焦月華，張爽，黃曉峰，姜波，趙良友，嚴(yán)妍，樸成玉

(1.黑龍江省中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評(píng)價(jià)中心，哈爾濱150040；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱150030；3.黑龍江生物科技職業(yè)學(xué)院，哈爾濱150025)

0 引言

青貯飼料的質(zhì)量直接影響反芻動(dòng)物的生產(chǎn)性能，而青貯飼料所用乳酸菌對(duì)其質(zhì)量起決定性作用，我國(guó)在青貯飼料用直投式乳酸菌發(fā)酵劑的研究與應(yīng)用方面十分薄弱。乳酸菌直投式發(fā)酵劑的制備通常采用真空冷凍干燥技術(shù)，在凍干過(guò)程中部分菌體細(xì)胞會(huì)受損甚至死亡[1]，使菌體細(xì)胞的發(fā)酵活力下降，凍干保護(hù)劑可有效減少菌體所受傷害。本研究以從青貯飼料中分離并篩選得到的1株用于青貯飼料制作的優(yōu)良植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，Lp1）為研究對(duì)象，選取了4種公認(rèn)保護(hù)效果較好的凍干保護(hù)劑[2-5]，采用單因素和正交試驗(yàn)比較了不同的凍干保護(hù)劑對(duì)其菌體細(xì)胞凍干后存活率的影響，以期確定最佳的凍干保護(hù)劑配方，從而為青貯飼料用乳酸菌直投式發(fā)酵劑在畜牧行業(yè)的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 菌株來(lái)源

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）Lp1，本實(shí)驗(yàn)室保存。分離自?xún)?yōu)質(zhì)的青貯玉米飼料，經(jīng)前期實(shí)驗(yàn)已初步確定具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力和產(chǎn)酸速率，可用于制作青貯飼料。

1.1.2 試劑和培養(yǎng)基

脫脂乳粉（進(jìn)口），海藻糖，三聚磷酸鉀，抗壞血酸，葡萄糖，蛋白胨，牛肉膏，酵母粉，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，葡萄糖20 g，Tween-80 1g，乙酸鈉5 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，檸檬酸氫二銨2 g，磷酸氫二鉀2 g，蒸餾水1L，pH值為5.8～6.0，121℃滅菌15 min。

1.1.3 儀器和設(shè)備

高速冷凍離心機(jī)（TGL-16G），培養(yǎng)箱（DHPP272），光學(xué)顯微鏡，超凈工作臺(tái)（VD-1320），CHRIST ALPHA 1-4型凍干機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 菌體的活化與培養(yǎng)

將實(shí)驗(yàn)室保存的植物乳桿菌Lp1接入到MRS液體培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)，每24 h傳代一次，均按照體積分?jǐn)?shù)為1.5%的接種量接種，活化兩次。隨后將活化后的菌液以體積分?jǐn)?shù)為3%的接種量接種到100 mL的MRS液體培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)至穩(wěn)定期初期（14 h）后收集菌體。

1.2.2 濃縮發(fā)酵劑的制備和真空冷凍干燥

將植物乳桿菌Lp1的發(fā)酵液在4℃下，以6 000 g，離心20 min，在無(wú)菌操作臺(tái)中棄掉上清液，用滅菌生理鹽水洗滌菌泥2次，隨后用1/10原發(fā)酵液體積的滅菌生理鹽水充分懸浮混合菌體，接著4℃離心收集菌體，棄去上清液，然后加入等體積的不同濃度的凍干保護(hù)劑后充分震蕩，混勻菌懸液。將菌懸液樣品放置在-80℃預(yù)凍12 h后，放入真空冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行凍干，利用凍干后菌體細(xì)胞的存活率來(lái)比較凍干保護(hù)劑的效果。

1.2.3 菌體細(xì)胞存活率計(jì)算

采用梯度稀釋平板活菌計(jì)數(shù)法，分別對(duì)凍干前的菌懸液樣品和凍干后的樣品進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，其中凍干后的菌粉計(jì)數(shù)時(shí)，先向凍干菌粉中加入與凍干前等體積的滅菌生理鹽水進(jìn)行復(fù)水，隨后將平板在37℃下培養(yǎng)48 h后計(jì)活菌數(shù)，測(cè)定菌體細(xì)胞凍干存活率。

菌體細(xì)胞存活率=1mL凍干后樣品中的活菌數(shù)/1mL凍干前樣品中的活菌數(shù)×100%。

1.2.4 凍干保護(hù)劑單因素的確定

根據(jù)目前的研究進(jìn)展，選取的4種保護(hù)劑的質(zhì)量濃度分別如下：海藻糖為10，20，40，60，80 g/L[3,6-7]；脫脂乳為10，50，100，150，200 g/L[2,4,7]；三聚磷酸鉀為5，10，15，20，25 g/L[5]；抗壞血酸為10，20，30，40，50 g/L[4-5,7]。

1.2.5 凍干保護(hù)劑的正交組合確定

根據(jù)單因素的變化趨勢(shì)，綜合考慮保護(hù)效果和成本因素，選出各因素最適宜的質(zhì)量濃度水平范圍，設(shè)計(jì)正交組合優(yōu)化凍干保護(hù)劑的復(fù)配，具體的因素水平如表1所示。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，并用Duncan's法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

表1 因素水平編碼 g/L

2 結(jié)果與分析

2.1 凍干保護(hù)劑的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1為凍干保護(hù)劑對(duì)凍干后菌體細(xì)胞存活率的影響。由圖1可以看出，與不添加任何凍干保護(hù)劑相比，所有凍干保護(hù)劑在凍干過(guò)程中對(duì)菌體細(xì)胞都具有不同程度的保護(hù)作用。其中，由圖1（a）可知脫脂乳質(zhì)量濃度選為50，100，150 g/L時(shí)保護(hù)效果較好；由圖1（b）可以看出，海藻糖質(zhì)量濃度為20，40，60 g/L和80 g/L時(shí)菌粉凍干存活率較高，由于考慮成本，所以選擇質(zhì)量濃度為20，40，60 g/L作為后續(xù)正交實(shí)驗(yàn)的水平；由圖1（c）可以看出，三聚磷酸鉀的質(zhì)量濃度為10，15，20g/L時(shí)保護(hù)效果最佳；由圖1（d）可以看出，抗壞血酸質(zhì)量濃度為20，30，40 g/L時(shí)保護(hù)效果較好。

2.2 凍干保護(hù)劑的正交組合優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

比較圖1和表2可知，添加各單一凍干保護(hù)劑的乳酸菌在凍干后細(xì)胞的存活率在30.25%～70.43%，而添加正交實(shí)驗(yàn)中9種復(fù)合凍干保護(hù)劑的乳酸菌菌體細(xì)胞的凍干存活率在71.45%～92.18%，表明復(fù)合凍干保護(hù)劑對(duì)乳酸菌菌體細(xì)胞的保護(hù)效果比單一凍干保護(hù)劑的保護(hù)效果好。

由表2可以看出，影響植物乳桿菌Lp1凍干后菌體細(xì)胞存活率的因素主次順序?yàn)锽＞C＞D＞A，海藻糖的效果最明顯，三聚磷酸鉀次之，再次為抗壞血酸，影響最小的為脫脂乳，最佳保護(hù)劑配方為A2B2C3D2，但是優(yōu)化出的最優(yōu)組合未出現(xiàn)在正交實(shí)驗(yàn)組，為了進(jìn)一步確定正交實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，在相同條件下，對(duì)A2B2C3D2組合與A2B3C1D2組合進(jìn)行了一次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，植物乳桿菌Lp1菌體細(xì)胞的凍干存活率為95.47%，高于實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率的最大值。因此確定A2B2C3D2為最佳的復(fù)合凍干保護(hù)劑組合，即脫脂乳100 g/L，海藻糖40 g/L，三聚磷酸鉀20 g/L，抗壞血酸30 g/L（均為質(zhì)量濃度）。

表2 因素水平編碼 g/L

圖1 對(duì)凍干后菌體細(xì)胞存活率的影響

3 討論

乳酸菌直投式發(fā)酵劑一般是通過(guò)真空冷凍干燥制備而成的，它具有活菌數(shù)高、菌體細(xì)胞活力強(qiáng)、不易被污染和易于運(yùn)輸保藏等優(yōu)點(diǎn)。許多研究表明[2,5]，在乳酸菌的冷凍干燥過(guò)程中，若直接進(jìn)行冷凍干燥，其死亡率將達(dá)90%以上，因此選擇合適的凍干保護(hù)劑至關(guān)重要，單一保護(hù)劑不能滿(mǎn)足菌體抵抗外界惡劣條件的要求[8]，本研究也證實(shí)了這一點(diǎn)，正交試驗(yàn)中9種復(fù)合凍干保護(hù)劑對(duì)菌體細(xì)胞的保護(hù)效果全部都優(yōu)于各單一凍干保護(hù)劑的保護(hù)效果，而未添加凍干保護(hù)劑的植物乳桿菌菌體細(xì)胞在凍干后的死亡率接近96%。本研究選擇脫脂乳、海藻糖、三聚磷酸鉀和抗壞血酸作為保護(hù)劑，主要原因包括如下幾點(diǎn)。脫脂乳不管單獨(dú)使用還是與其他凍干保護(hù)劑混合使用均具有良好的保護(hù)作用，它在凍干過(guò)程中能使溶液呈過(guò)冷狀態(tài)[2]，抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的變性失活，維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)以降低細(xì)胞死亡率，另外，它含有大量的蛋白質(zhì)，能夠減少細(xì)胞暴露于氧氣和介質(zhì)中的表面積，給細(xì)胞提供了保護(hù)性的外衣，減少細(xì)胞壁損傷[9]。海藻糖在凍干過(guò)程中能擴(kuò)散至胞內(nèi)并填充在胞內(nèi)酶和其他蛋白質(zhì)等活性大分子周?chē)?dāng)細(xì)胞失水時(shí)，海藻糖的羥基可與胞內(nèi)的生物活性大分子的極性基團(tuán)形成氫鍵，代替極性基團(tuán)周?chē)サ乃肿樱瑥亩S持胞內(nèi)蛋白質(zhì)分子的穩(wěn)定性[3]。抗壞血酸的羥基能夠與乳酸菌菌體細(xì)胞壁中磷脂分子的磷酸基團(tuán)之間形成氫鍵，從而抑制細(xì)胞膜因失水而受損。此外，抗壞血酸還能夠減少氧氣分子對(duì)凍干菌粉的氧化作用，如不添加抗壞血酸，則在儲(chǔ)存過(guò)程中，凍干菌粉會(huì)隨著水分活度的增加而發(fā)生褐變，從而導(dǎo)致顏色變深[10]。三聚磷酸鉀能夠在胞內(nèi)液中結(jié)合水分子，發(fā)生水合作用，使胞內(nèi)液的粘性增加[5]，從而在凍干過(guò)程中弱化了水的結(jié)晶過(guò)程，降低了體系中水轉(zhuǎn)化成冰的比例，使其直接進(jìn)入升華階段。

4 結(jié)論

通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)篩選出最佳的凍干保護(hù)劑配方為：脫脂奶粉100 g/L，海藻糖40 g/L，三聚磷酸鉀20 g/L，抗壞血酸30 g/L（均為質(zhì)量濃度）。，凍干后的發(fā)酵劑中菌體細(xì)胞的存活率為95.47%，對(duì)植物乳桿菌Lp1具有良好的保護(hù)效果，為青貯用直投式乳酸菌發(fā)酵劑的大規(guī)模應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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