黃寶瑩，佘之蘊(yùn)，蘇妙儀，羅永潮，黃玲玲

（廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院廣東順德528000）

0 引言

酸奶含有豐富的營養(yǎng)成分，如蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)、乳酸等[1]。酸奶除了富含營養(yǎng)物質(zhì)，還有多種保健功能，如減輕乳糖不耐癥、調(diào)整腸道菌群的生態(tài)平衡[2]、降低膽固醇[3]、降血壓、提高免疫力等[4]。酸奶的營養(yǎng)物質(zhì)和保健功能取決于乳酸菌的品種和活力。聯(lián)合國糧農(nóng)組織、世界衛(wèi)生組織和國際乳品聯(lián)合會（FAO、WHO/IDF）及GB 19302-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵乳》中均有規(guī)定，酸奶成品中必須含有大量的、相應(yīng)的活性乳酸菌[5]。上述國標(biāo)允許在風(fēng)味發(fā)酵乳中添加食品添加劑，本文主要研究多種香精、色素等食品添加劑對德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌的抑菌活力和最小抑菌濃度，探討其對乳酸菌的抑菌作用，以期對酸奶的生產(chǎn)控制提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus，St）FSCC 225005；德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus bulgari?cus，Lb）CICC 6045。

培養(yǎng)基為MRS瓊脂。

添加劑如表1所示。

1.2 儀器和設(shè)備

AC2-6S1生物安全柜，玻璃熱珠滅菌器，Easy?mix拍擊式均質(zhì)器，GHP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱，麥?zhǔn)媳葷醿x，牛津杯（內(nèi)徑6.0mm±0.1mm，外徑7.8mm±0.1mm，高10.0mm±0.1mm）。

2 方法

2.1 牛津杯法[6-7]

2.1.1 指示菌懸液的制備

菌株劃線于MRS瓊脂，36℃±1℃厭氧培養(yǎng)48 h活化，培養(yǎng)至生長良好。取新鮮培養(yǎng)的菌株，用麥?zhǔn)媳葷醿x制備成2.40～2.60麥?zhǔn)媳葷岫龋s106mL-1）菌懸液，立即用于抑菌實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 抑菌液的配制

粉末狀添加劑：稱取一定質(zhì)量的添加劑，液體添加劑：吸取一定體積的添加劑，用無菌水溶解，定容至100mL，搖勻，制成一定濃度的抑菌液，4℃保存?zhèn)溆?，使用前搖勻。粉末狀添加劑以10.000 g/100 mL為初始質(zhì)量濃度，按二倍稀釋法制成5.000，2.500，1.250，0.625，0.313，0.156，0.078 g（每100 mL中）系列質(zhì)量濃度；液體狀添加劑以原液100.000%為初始體積分?jǐn)?shù)，按二倍稀釋法制成50.000%，25.000%，12.500%，6.250%，3.125%，1.563%，0.781%，0.391%系列體積分?jǐn)?shù)。

2.1.3 檢測平板的制備

每個平板加入20 mL的MRS瓊脂，凝固后待水份干燥，取0.2 mL菌懸液在平板上均勻涂布，以平板無可見水滴為準(zhǔn)，立刻進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

表1 食品添加劑

2.1.4 抑菌圈測定

以無菌水為空白對照，每個平板均勻放置3～4個牛津杯，將200 L抑菌液加入到牛津杯中，36℃±1℃下厭氧培養(yǎng)48 h。觀察牛津杯底周圍有無抑菌圈，每次試驗(yàn)至少作3次重復(fù)，測量抑菌圈直徑，取平均值。

2.1.5 最小抑菌濃度（MIC）測定

先以初始質(zhì)量濃度（或體積分?jǐn)?shù)）的添加劑溶液做初篩實(shí)驗(yàn)，根據(jù)初篩結(jié)果，挑選出有抑菌作用的添加劑，用牛津杯法測定其MIC，能產(chǎn)生抑菌圈的最小的質(zhì)量濃度（或體積分?jǐn)?shù)）定為MIC。其確定標(biāo)準(zhǔn)為：在該質(zhì)量濃度（或體積分?jǐn)?shù)）下抑菌圈直徑大于或等于8.0 mm。

3 結(jié)果與討論

3.1 添加劑的初篩結(jié)果

采用牛津杯法測試37種添加劑對兩種指示菌的抑制作用，初步篩選有抑菌效果的添加劑，其結(jié)果如表2所示。

表2 添加劑的初步篩選結(jié)果 mm

采用牛津杯法進(jìn)行添加劑的篩選，牛津杯中的試劑緩慢向四周擴(kuò)散，假若添加劑對指示菌有抑菌效果，在杯底周圍與培養(yǎng)基接觸面就出現(xiàn)抑制圈。抑菌圈的大小就代表添加劑抑菌力的高低。由表2可以看出，7種色素和4種甜味劑，除了甜蜜素對嗜熱鏈球菌產(chǎn)生了抑菌作用，其他均不產(chǎn)生抑菌圈，表明其對乳酸菌無抑菌作用。24種甜味香精中有21種對乳酸菌產(chǎn)生了大小不同的抑菌圈，同一風(fēng)味不同廠家的香精對乳酸菌的抑菌效果存在較大差異。兩種乳酸菌對檸檬酸和蘋果酸均十分敏感，都產(chǎn)生了較大的抑菌圈。對乳酸菌的抑菌作用由強(qiáng)到弱分別為酸度調(diào)節(jié)劑、香精、甜味劑、色素。

3.2 色素對乳酸菌的抑制作用

7種色素均為粉末狀添加劑，其初篩質(zhì)量濃度為10.000 g/100 mL。由表2可知，7種色素均沒有產(chǎn)生抑菌圈。此質(zhì)量濃度下，色素已是過飽和溶液，說明7種色素對Lb和St無抑菌作用。實(shí)驗(yàn)過程中，色素均隨著牛津杯由里向外均勻擴(kuò)散，MRS培養(yǎng)基也隨之染上相應(yīng)顏色，但乳酸菌在其表面生長良好。根據(jù)GB 19302-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 發(fā)酵乳》和GB 2760-2011《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》，發(fā)酵乳中允許使用檸檬黃、日落黃、胭脂紅、亮藍(lán)色素，前三者最大使用量為0.05 g/kg，亮藍(lán)為0.025 g/kg，梔子黃、莧菜紅在食品中的最大使用量一般為0.3g/kg，姜黃按生產(chǎn)需要適量使用，而實(shí)際應(yīng)用中，出于生產(chǎn)需要和成本考量，實(shí)際使用量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于最大使用量。說明在使用范圍內(nèi)，7種色素對乳酸菌無抑制作用。

3.3 香精對乳酸菌的抑制作用

24種甜味香精的MIC測定結(jié)果如表3所示。

表3 香精對乳酸菌的MIC

由表3可以看出，24種甜味香精中，有21種對兩種乳酸菌產(chǎn)生了不同程度的抑制作用。13，18，19，23，24，26這6種香精對Lb的抑菌作用較強(qiáng)；13，18，19，20，23，25，26，29，30這9種香精對St的抑菌作用較強(qiáng)。MIC越小，說明其抑菌效果越強(qiáng)，對于Lb，MIC：18=19=26＜13=23＜30。對于St，MIC：18=19=30＜13=20=26＜23=25=29。食用香精在食品中是按生產(chǎn)需要適量添加，一般添加量在0.01%～0.5%之間。兩種乳酸菌的MIC均低至1.563%，接近于實(shí)際添加量，說明這幾種香精在低濃度下對乳酸菌有明顯的抑制作用，可能會影響發(fā)酵乳發(fā)酵過程或保存期間乳酸菌的生長繁殖和生物活性。

不同香精配方成分差異很大，相同風(fēng)味的香精，由于需求不同，其配方也不盡相同。香精是由各種酸、醇、醛、酮、酯類等組成的混合物，一般含有二、三十種化學(xué)成分。天然香精或人工香精可能含有抑制乳酸菌活性的物質(zhì)，具體機(jī)理尚不清楚。表3中挑選了5種不同廠家生產(chǎn)的草莓香精，其中4種都對乳酸菌產(chǎn)生了明顯的抑菌作用。張丹[8]等用氣質(zhì)法分析草毒香精中成分，共鑒定出29種化學(xué)成分，其中乙醇占總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的26.979%，丙二醇占66.165%，揮發(fā)性成分中乙基麥芽酚占1.979%，葉醇占1.272%。草莓香精的抑菌效果可能源自其主要組成成分。

3.4 其他添加劑對乳酸菌的抑制作用

4種甜味劑、2種酸度調(diào)節(jié)劑的MIC實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

由表4可以看出，甜味劑在10.000 g/100mL質(zhì)量濃度下對兩種乳酸菌基本無抑菌作用。根據(jù)GB 19302-2010和GB 2760-2011，發(fā)酵乳中允許使用安賽蜜和三氯蔗糖，其最大使用量分別為0.35 g/kg和0.3 g/kg（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其在使用范圍對乳酸菌無抑菌作用。

表4 其他添加劑對乳酸菌的MIC g/100mL

兩種酸度調(diào)節(jié)劑對乳酸菌均產(chǎn)生明顯的抑菌作用。St比Lb對酸更敏感。乳酸菌是一類以乳酸為唯一或主要代謝產(chǎn)物的細(xì)菌，故它們對酸性環(huán)境比較適應(yīng)。乳桿菌屬的最適pH值為5.5～6.2，最低生長pH值為4.5。鏈球菌屬生長pH值范圍較廣，對酸較不敏感。但當(dāng)乳酸菌接種到初始pH偏離最適pH較遠(yuǎn)的培養(yǎng)條件下時，生長速度很低。10.000%一水檸檬酸的pH值為1.69，在此酸性條件下，各種乳酸菌的生長受到嚴(yán)重抑制，隨著一水檸檬酸濃度稀釋，pH值逐漸上升，0.078%一水檸檬酸的pH值為2.96，此pH值仍低于乳酸菌最適pH值，但已無抑菌圈產(chǎn)生。當(dāng)介質(zhì)pH值在2.96時，菌體內(nèi)pH值可能高于此值，故其新陳代謝沒有收到抑制。

4 結(jié)束語

7種色素在初篩濃度下，對Lb和St均無抑制作用。多種甜味香精對乳酸菌產(chǎn)生明顯的抑制作用，不同菌株對不同香精敏感性不同，同一風(fēng)味不同廠家的香精，對同一菌株的抑菌效果也存在差異。這可能與其化學(xué)成分和組成差別有關(guān)。其中18草莓香精、19草莓香精、26特濃草莓香精對Lb的抑菌作用最強(qiáng)，MIC均為1.563%；18、19、30酸奶香精對St的抑菌作用最強(qiáng)，MIC均為3.125%。

兩種乳酸菌對4種常用甜味劑不敏感。DL-蘋果酸、一水檸檬酸在食品中常用作酸度調(diào)節(jié)劑或防腐劑，兩種乳酸菌對其十分敏感。其對Lb的MIC均為0.313%，對St的MIC均為0.156%，St對酸的耐受性更差。

抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，酸度調(diào)節(jié)劑對乳酸菌的抑菌力最高，香精其次，色素和甜味劑基本無抑菌力。添加劑對乳酸菌的抑菌機(jī)理有待于進(jìn)一步的研究和探討。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明多種添加劑對乳酸菌產(chǎn)生抑菌作用，可能對酸奶發(fā)酵過程及保質(zhì)期間活乳酸菌數(shù)量產(chǎn)生影響。

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