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鐘基因Per2和腫瘤相關(guān)鐘控基因在金黃地鼠口腔頰黏膜癌變不同階段的晝夜節(jié)律改變

2015-12-16 07:24:54葉華楊凱譚雪梅趙丹呂曉強(qiáng)王青青
華西口腔醫(yī)學(xué)雜志 2015年5期
關(guān)鍵詞:中值癌變振幅

葉華 楊凱 譚雪梅 趙丹 呂曉強(qiáng) 王青青,2

1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔頜面外科;2.口腔疾病與生物醫(yī)學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400016

在長(zhǎng)期的生物進(jìn)化中,地球上的生物形成了內(nèi)源性的時(shí)間調(diào)節(jié)系統(tǒng),即晝夜節(jié)律時(shí)鐘[1-2]。目前研究[3-4]表明,哺乳動(dòng)物體內(nèi)的許多生命活動(dòng),如睡眠與清醒、激素分泌和免疫活動(dòng)等均表現(xiàn)出以近24 h為周期的晝夜節(jié)律波動(dòng),這種波動(dòng)是由鐘基因的晝夜節(jié)律性表達(dá)控制的。進(jìn)一步研究[2,5]發(fā)現(xiàn),哺乳類(lèi)動(dòng)物基因組中約有5%~10%的基因受到鐘基因的調(diào)控,也表現(xiàn)出以24 h為周期的晝夜節(jié)律波動(dòng),這些基因被稱(chēng)為鐘控基因。鐘基因和鐘控基因的晝夜節(jié)律表達(dá)對(duì)維持正常生命活動(dòng)高度協(xié)同有序具有重要作用[5-6]。

Per2(Period 2)基因是重要的鐘基因,在正常細(xì)胞中的表達(dá)具有晝夜節(jié)律性[1,7];同時(shí)Per2也是一種抑癌基因,在前列腺癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤等多種實(shí)體癌細(xì)胞中低表達(dá)[8-9]。許多與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的重要基因?yàn)殓娍鼗?,受到了鐘基因Per2的調(diào)控[9-11]。Per2通過(guò)調(diào)控下游眾多腫瘤相關(guān)基因影響細(xì)胞的增殖、凋亡和腫瘤新生血管生成,與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[10-11]。但目前尚不清楚鐘基因Per2與腫瘤相關(guān)鐘控基因在癌癥發(fā)生發(fā)展不同階段晝夜節(jié)律的動(dòng)態(tài)變化情況。本研究通過(guò)檢測(cè)鐘基因Per2和腫瘤相關(guān)基因血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、Ki67、c-Myc和P53在金黃地鼠頰黏膜癌變不同階段的晝夜節(jié)律表達(dá)變化規(guī)律,分析該基因與癌變的關(guān)系,對(duì)深入研究癌癥發(fā)生發(fā)展的機(jī)制以及基于恢復(fù)生物晝夜節(jié)律的癌癥治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 主要材料

1.1.1 儀器與試劑 二甲基苯并蒽(dimethylbenzanthracene,DMBA)(Sigma公司,美國(guó))。RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司,日本)。冷凍低溫離心機(jī)(Z223MK-Z型,HERMLE公司,德國(guó)),核酸蛋白分析儀(UV-GeneQuant型,瑞典安瑪西亞公司)。聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)試劑盒(TaKaRa公司,日本)。梯度PCR儀(BioRad公司,美國(guó)),熒光定量PCR儀(S1000TMThermal Cycler型,BioRad公司,美國(guó))。光學(xué)顯微鏡(BX51型,Olympus公司,日本)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原體級(jí)敘利亞金黃地鼠(北京維通利公司)90只,雄性,6~7周齡,質(zhì)量90~120 g。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作程序均經(jīng)過(guò)重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用管理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DMBA誘導(dǎo)金黃地鼠頰黏膜癌變動(dòng)物模型的建立 90只敘利亞金黃地鼠隨機(jī)分籠飼養(yǎng),每籠5只,墊料、飼料和飲水均經(jīng)滅菌處理,室溫為(24±1) ℃,空氣濕度為60%±10%,置于標(biāo)準(zhǔn)化12 h光照和12 h黑暗環(huán)境中飼養(yǎng)3周以同步化金黃地鼠的晝夜生活習(xí)性。時(shí)間以開(kāi)燈后時(shí)間(hours after light onset,HALO)作為參考,0 HALO為開(kāi)燈時(shí)間,12 HALO為關(guān)燈時(shí)間。在第3周最后1 d,在24 h內(nèi)4、8、12、16、20和24 HALO共6個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)采用頸椎脫位法處死30只金黃地鼠,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死5只,獲取其左側(cè)正常頰黏膜組織(正常組)。余下的60只地鼠繼續(xù)置于12 h光照和12 h黑暗環(huán)境中飼養(yǎng),每周1、3、5將地鼠固定于自制鼠盒上,拉開(kāi)上下牙列,用5號(hào)油畫(huà)筆于左側(cè)頰黏膜涂抹0.5%DMBA丙酮液,分別于涂抹DMBA第6周和第14周的最后1 d,在24 h內(nèi)的4、8、12、16、20和24 HALO共6個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)用頸椎脫位法各處死5只金黃地鼠,獲取左側(cè)頰部組織。

根據(jù)不同的誘導(dǎo)時(shí)間,第6周獲取的組織為癌前病變組,第14周獲取的組織為癌癥組。每個(gè)動(dòng)物所獲的組織均分為兩個(gè)部分,一部分用10%甲醛溶液常規(guī)固定,脫水,石蠟包埋;另一部分迅速分裝于凍存管,保存在液氮中。

1.2.2 病理學(xué)檢測(cè) 將獲取的每塊石蠟包埋組織行4 μm厚切片,行常規(guī)蘇木精-伊紅(hematoxylineosin,HE)染色、封片,在光學(xué)顯微鏡下觀察組織的癌變情況。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。1)組織總RNA提?。河肦NA提取試劑盒提取液氮保存組織的總RNA,用核酸蛋白分析儀測(cè)定其在波長(zhǎng)260 nm及280 nm處的光密度值,計(jì)算RNA質(zhì)量濃度和純度。2)cDNA合成:用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,反應(yīng)體系為10 μL,37 ℃,15 min,85 ℃,5 s。3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng):用Oligo7.0軟件設(shè)計(jì)并合成目的基因Per2、VEGF、Ki67、c-Myc、P53以及內(nèi)參基因β-actin的引物(引物序列見(jiàn)表1),反應(yīng)體系為2×SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 12.5 μL,濃度均為0.4 μmol·L-1的上游和下游引物各1 μL,DNA模板2 μL(相當(dāng)于100 ng),滅菌滅酶蒸餾水8.5 μL。反應(yīng)液總體積為25 μL。反應(yīng)條件均為95 ℃預(yù)變性1.5 min,95 ℃變性10 s,60 ℃退火延伸30 s,擴(kuò)增40個(gè)循環(huán);60 ℃延伸時(shí)采集熒光信號(hào)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算Per2、VEGF、Ki-67、c-Myc和P53 mRNA的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析各目的基因在每個(gè)癌變階段各6個(gè)時(shí)間點(diǎn)的差異性表達(dá),檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。用Time Series Analysis Cosinor 6.3軟件行單余弦分析,以P<0.05為目的基因表達(dá)存在晝夜節(jié)律性,并繪制余弦曲線。晝夜節(jié)律特征以中值、振幅和峰值位相時(shí)來(lái)反映,其中中值為曲線對(duì)應(yīng)的所有數(shù)據(jù)的平均值,振幅表示余弦曲線振蕩高于或低于中值的程度,峰值位相時(shí)表示節(jié)律達(dá)到頂峰時(shí)的時(shí)間。

表1 各基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR引物序列Tab 1 Primers used for real-time PCR amplification of gene expression

2 結(jié)果

2.1 病理學(xué)檢查

病理學(xué)檢查顯示:正常組30例均為正常頰黏膜組織;癌前病變組30例中有25例表現(xiàn)為中度不典型增生,3例為輕度不典型增生,2例為重度不典型增生;癌癥組30例均為鱗狀細(xì)胞癌組織(圖1)。

圖1 正常頰黏膜、癌前病變及癌癥組織的病理學(xué)檢測(cè) HE × 400Fig 1 Pathological observation of normal buccal mucosa, precancerous lesions and cancer HE × 400

2.2 鐘基因Per2 mRNA在頰黏膜癌變不同階段表達(dá)的晝夜節(jié)律改變

Per2 mRNA在正常組、癌前病變和癌癥組晝夜6個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)之間表達(dá)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。余弦分析表明:Per2 mRNA在正常組、癌前病變組和癌癥組中的表達(dá)均有晝夜節(jié)律性(表3),基因表達(dá)的余弦擬合曲線見(jiàn)圖2。結(jié)合表2、表3和圖2分析晝夜節(jié)律特征如下。1)中值和振幅:Per2 mRNA表達(dá)的中值和振幅在癌前病變組和癌癥組中均低于正常黏膜組(P<0.05),癌癥組中值低于癌前病變組(P<0.05),但振幅在癌癥組和癌前病變組中無(wú)明顯差異(P>0.05)。2)峰值位相時(shí):Per2 mRNA癌癥組的峰值位相時(shí)與正常組大致相同,但癌前病變組則較正常組提前了2.94 h。

表2 Per2、VEGF、Ki67、c-Myc和P53 mRNA在正常頰黏膜、癌前病變和癌癥組織中24 h內(nèi)6個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的mRNA相對(duì)表達(dá)量Tab 2 The mRNA relative expression of Per2, VEGF, Ki67, c-Myc and P53 in normal buccal mucosa, precancerous lesions and cancer at 6 different time points in 24 h

表3 Per2、VEGF、Ki67、c-Myc和P53 mRNA在正常頰黏膜、癌前病變和癌癥組織中mRNA表達(dá)的晝夜節(jié)律變化特征Tab 3 The circadian rhythm characteristics of Per2, VEGF, Ki67, c-Myc and P53 mRNA expression in normal buccal mucosa,precancerous lesions and cancer

2.3 癌癥相關(guān)基因mRNA在頰黏膜癌變不同階段表達(dá)的晝夜節(jié)律改變

VEGF、Ki67和P53 mRNA在正常組、癌前病變組和癌癥組晝夜6個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)之間表達(dá)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);c-Myc mRNA在正常組、癌前病變組晝夜6個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但在癌癥組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

各基因的余弦擬合曲線見(jiàn)圖2,結(jié)合圖2和表2進(jìn)行余弦分析,可以發(fā)現(xiàn)以下規(guī)律:VEGF、P53和c-Myc mRNA在正常組、癌前病變和癌癥組中的表達(dá)具有晝夜節(jié)律性(P<0.05);Ki67 mRNA在正常組和癌前病變組中的表達(dá)具有晝夜節(jié)律性(P<0.05),但在癌癥組中不具有晝夜節(jié)律性(P>0.05)。

圖2 Per2、VEGF、Ki67、c-Myc和P53 mRNA分別在正常頰黏膜、癌前病變和癌癥組織表達(dá)的晝夜變化的余弦擬合曲線Fig 2 Cosine fitted curves of Per2, VEGF, Ki67, c-Myc and P53 mRNA expression in normal buccal mucosa, precancerous lesions and cancer

各基因的晝夜節(jié)律特征分析如下。1)中值:VEGF和c-Myc mRNA表達(dá)的中值在癌前病變組和癌癥組中均高于正常組,且癌癥組的中值明顯高于癌前病變組;Ki67 mRNA表達(dá)的中值在癌前病變組中高于正常組;P53 mRNA表達(dá)的中值在癌前病變組和癌癥組中均低于正常組,且癌癥組的中值低于癌前病變組,以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2)振幅:VEGF和c-Myc mRNA的振幅在癌前病變組和癌癥組中均高于正常組(P<0.05),但在癌癥組和癌前病變組之間無(wú)明顯差異(P>0.05);Ki67 mRNA的振幅在癌前病變組中明顯高于正常組(P<0.05);P53 mRNA的振幅在癌前病變組和癌癥組中均低于正常組,且癌癥組低于癌前病變組(P<0.05)。3)峰值位相時(shí):VEGF mRNA的峰值位相時(shí)在癌前病變組和癌癥組中較正常組分別提前3.72 h和8.89 h;Ki67 mRNA的峰值位相時(shí)在癌前病變組較正常組滯后18.28 h;P53 mRNA的峰值位相時(shí)在正常組和癌癥組大致相同,但癌前病變組較正常組滯后3.40 h;c-Myc mRNA的峰值位相時(shí)在癌前病變和癌癥組中分別較正常組提前3.86 h和滯后16.15 h。

3 討論

鐘基因Per2為抑癌基因,其表達(dá)的晝夜節(jié)律改變與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[10-12]。Zieker等[1]報(bào)道,正常人口腔頰黏膜細(xì)胞中Per2的表達(dá)具有晝夜節(jié)律性。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),Per2 mRNA在口腔頰黏膜癌變3個(gè)不同階段的表達(dá)均具有晝夜節(jié)律性,Per2 mRNA表達(dá)的中值和振幅隨癌變的發(fā)展而下降,證明其抑癌作用逐漸減弱,細(xì)胞出現(xiàn)惡性轉(zhuǎn)化。從峰值位相時(shí)來(lái)看,Per2 mRNA表達(dá)峰值的出現(xiàn)時(shí)間在正常頰黏膜和癌癥組織中大概相同,但在癌前病變階段較正常組提前2.94 h,其機(jī)制有待深入研究。

癌癥的發(fā)生發(fā)展必需依賴(lài)于腫瘤新生血管的生成[11],VEGF在誘導(dǎo)腫瘤新生血管生成中起核心作用[11]。Koyanagi等[7]發(fā)現(xiàn),VEGF mRNA在小鼠皮下移植肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)具有晝夜節(jié)律性,同時(shí)在荷瘤鼠的肝細(xì)胞和血漿中VEGF蛋白的表達(dá)也具有晝夜節(jié)律性。本研究發(fā)現(xiàn),VEGF mRNA在口腔頰黏膜癌變3個(gè)不同階段的表達(dá)均具有晝夜節(jié)律性,其中值和振幅隨癌癥的發(fā)展而升高,促進(jìn)腫瘤新生血管的形成和腫瘤的發(fā)展;另外VEGF mRNA的峰值位相時(shí)隨癌癥的發(fā)生發(fā)展而不斷提前,這為基于VEGF為靶點(diǎn)的癌癥治療用藥時(shí)間提供了參考。

P53為抑癌基因,其表達(dá)水平增高能抑致腫瘤生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,Ki67和c-Myc是細(xì)胞增殖基因,其表達(dá)水平增高能增加細(xì)胞的增殖水平[10]。本研究表明:P53和c-Myc mRNA在口腔頰黏膜癌變3個(gè)不同階段的表達(dá)均具有晝夜節(jié)律性,但Ki67 mRNA僅在正常組和癌前病變組具有晝夜節(jié)律性,癌癥組表現(xiàn)為晝夜節(jié)律紊亂??傮w來(lái)看,隨著癌癥的發(fā)生發(fā)展,P53 mRNA表達(dá)的中值和振幅逐漸降低,表明其抑癌作用和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力逐漸減弱,而Ki67和c-Myc mRNA的中值和振幅逐漸升高,細(xì)胞增殖水平逐漸增強(qiáng),導(dǎo)致細(xì)胞增殖和凋亡的平衡失調(diào)。從峰值位相時(shí)來(lái)看,P53 mRNA的峰值位相時(shí)在正常組和癌癥組中基本相同,但癌前病變組較正常組滯后3.40 h,Ki67在癌前病變組較正常組滯后18.28 h,c-Myc在癌前病變組和癌癥組較正常組分別提前3.86 h和滯后16.15 h。由此推測(cè),細(xì)胞凋亡基因P53和細(xì)胞增殖基因Ki67、c-Myc峰值位相時(shí)在癌變過(guò)程中的不協(xié)同改變進(jìn)一步加重了細(xì)胞增殖和凋亡的平衡失調(diào),從而促進(jìn)癌癥的發(fā)生發(fā)展。

本研究發(fā)現(xiàn),隨著癌癥的發(fā)生發(fā)展,鐘基因Per2和腫瘤相關(guān)基因VEGF、Ki-67、c-Myc和P53表達(dá)的中值、振幅和峰值位相時(shí)均發(fā)生了明顯改變,這為從基因的晝夜節(jié)律改變的角度來(lái)探索癌癥發(fā)生機(jī)制以及基于恢復(fù)生物晝夜節(jié)律的癌癥治療提供了新的思路。

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