武　強(qiáng)， 呂志創(chuàng)， 張桂芬， 嚴(yán)　盈,2,3， 劉桂清,4， 李建偉， 王玉生， 蔡玉音， 萬方浩,5*

1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193； 2 Department of

Entomology, North Carolina State University, Campus Box 7613, Raleigh, NC 27695-7613, USA；

3Genetic Engineering and Society Center and W.M. Keck Center for Behavioral Biology, North

Carolina State University, Raleigh, NC 27695-7613, USA; 4廣東省昆蟲研究所，

廣東 廣州 510260； 5青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與植物保護(hù)學(xué)院，山東 青島 266109

?

遺傳控制技術(shù)在實(shí)蠅類害蟲中的研究進(jìn)展

武強(qiáng)1， 呂志創(chuàng)1， 張桂芬1， 嚴(yán)盈1,2,3， 劉桂清1,4， 李建偉1， 王玉生1， 蔡玉音1， 萬方浩1,5*

1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193；2Department of

Entomology, North Carolina State University, Campus Box 7613, Raleigh, NC 27695-7613, USA；

3Genetic Engineering and Society Center and W.M. Keck Center for Behavioral Biology, North

Carolina State University, Raleigh, NC 27695-7613, USA;4廣東省昆蟲研究所，

廣東 廣州 510260；5青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與植物保護(hù)學(xué)院，山東 青島 266109

摘要:實(shí)蠅類害蟲嚴(yán)重危害多種水果和蔬菜，是世界果蔬產(chǎn)業(yè)最重要的害蟲類群之一，嚴(yán)重影響了發(fā)生地的果蔬生產(chǎn)和出口貿(mào)易活動。昆蟲不育技術(shù)(SIT)是一種物種特異和環(huán)境友好型防治措施，在多種實(shí)蠅類害蟲的防治、阻截和根除中起到了不可替代的重要作用。通過分子生物學(xué)技術(shù)對昆蟲的基因組進(jìn)行遺傳修飾，可對SIT進(jìn)行改進(jìn)，提高其防控效果并擴(kuò)大應(yīng)用的物種范圍，近年來相關(guān)方面的研究已取得重要進(jìn)展，成為害蟲遺傳控制的研究熱點(diǎn)。本文闡述了通過受四環(huán)素調(diào)控的tet-off基因表達(dá)系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)昆蟲“不育”的基本原理和在果蠅及其他幾種主要實(shí)蠅類害蟲中建立的不同類型的遺傳控制體系，以及類似體系在其他農(nóng)業(yè)昆蟲中的應(yīng)用情況。簡要介紹了在橘小實(shí)蠅遺傳控制技術(shù)體系構(gòu)建方面的工作進(jìn)展，并對該技術(shù)的在害蟲綜合治理(IPM)尤其是實(shí)蠅類害蟲防治中的應(yīng)用前景進(jìn)行了討論和展望。

關(guān)鍵詞:遺傳控制； 實(shí)蠅； 昆蟲不育技術(shù)； tet-off基因表達(dá)系統(tǒng)； 致死品系

Genetic engineering approaches for the improvement

of sterile insect technique (SIT) on fruit flies

Qiang WU1, Zhi-chuang Lü1, Gui-fen ZHANG1, Ying YAN1,2,3, Gui-qing LIU1,4,

Jian-wei LI1, Yu-sheng WANG1,Yu-yin CAI1, Fang-hao WAN1,5*

1StateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesandInsectPests,InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgricultural

實(shí)蠅類害蟲屬雙翅目Diptera實(shí)蠅科Tephritidae，遍布全球熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)，種類繁多，寄主范圍廣且危害嚴(yán)重。成蟲于寄主植物果皮下產(chǎn)卵，幼蟲在果實(shí)內(nèi)取食為害，致使被害果實(shí)腐爛、脫落，該蟲極易隨果蔬、花卉等的貿(mào)易活動傳播(Hardy,1969; Lysandrou,2009; White & Elson-Harris,1992)。目前已記錄的實(shí)蠅類昆蟲超過500屬4500余種，其中250 余種具有經(jīng)濟(jì)意義(李志紅等，2013)。具經(jīng)濟(jì)重要性的實(shí)蠅主要分為5個類群：按實(shí)蠅屬AnastrephaSchiner、臘實(shí)蠅屬CeratitisMacleay、繞實(shí)蠅屬RhagoletisLoew、離腹寡毛實(shí)蠅屬BactroceraMacqart和合腹寡毛實(shí)蠅屬DacusFabricius(嚴(yán)盈等，2009)。隨著國際貿(mào)易活動的日趨頻繁與復(fù)雜化，實(shí)蠅類害蟲傳播和擴(kuò)散的機(jī)率也增加，成為世界果蔬進(jìn)出口貿(mào)易中的重要檢疫問題。

通過昆蟲不育技術(shù)(Sterile insect technique,SIT) (Klassen & Curtis,2005; Knipling,1955)與滅雄技術(shù)(Male annihilation technique,MAT) (Allwoodetal.,2002; Cunningham,1989)相結(jié)合，可有效防控和阻截多種實(shí)蠅類害蟲和鱗翅目害蟲，并逐步發(fā)展形成以昆蟲不育技術(shù)為核心的大區(qū)域綜合治理策略(Area-wide integrated pest management approach,AW-IPM)防控體系(Klassen,2005; Vargasetal.,2010)。然而，傳統(tǒng)的將昆蟲進(jìn)行輻射后標(biāo)記釋放的技術(shù)存在交配競爭力降低、熒光粉標(biāo)記易混淆等缺陷，同時，雌雄混合釋放會大大降低防治效果，而用于雄蟲篩選的遺傳性別品系(Genetic sexing strain,GSS)在新物種中的構(gòu)建較為困難，阻礙了SIT在更多物種中的推廣應(yīng)用(Morrisonetal.,2010; Scolarietal.,2008)。通過遺傳修飾對昆蟲基因組進(jìn)行編輯而實(shí)現(xiàn)昆蟲不育的技術(shù)，能夠克服傳統(tǒng)SIT的缺陷，從而達(dá)到更高效和穩(wěn)定的防控效果。

近年來，害蟲遺傳控制技術(shù)的相關(guān)研究取得了一系列重要進(jìn)展，本文著重闡述了基于四環(huán)素調(diào)控tet-off基因表達(dá)系統(tǒng)的遺傳不育體系的基本原理和其在果蠅和部分實(shí)蠅類害蟲中的研究進(jìn)展，以及相似體系在其他農(nóng)業(yè)昆蟲中的應(yīng)用情況。

1　通過tet-off系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)昆蟲遺傳控制的基本原理

利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)達(dá)到使昆蟲“不育”的目的，主要是通過與受四環(huán)素調(diào)控的tet-off基因表達(dá)系統(tǒng)相結(jié)合來實(shí)現(xiàn)的。研究表明，大腸桿菌Escherichcoli轉(zhuǎn)座子Tn10中四環(huán)素阻遏因子(Tetracycline repressor,tetR)可與四環(huán)素結(jié)合，從而不能負(fù)性調(diào)節(jié)四環(huán)素抗性操縱子(Tetracycline-resistance operon,tetO)，因此在四環(huán)素存在時，tetR對tetO沒有阻遏作用，下游轉(zhuǎn)錄隨即啟動(Gatz & Quail,1988)。依此原理，將tetR中的部分氨基酸與單純皰疹病毒(Herpes simplex virus,HSV)中的Viral protein 16蛋白的轉(zhuǎn)錄活化區(qū)域(VP16)組合成一種融合蛋白，即四環(huán)素轉(zhuǎn)錄激活因子(Tetracycline transcriptional activator,tTA)，將tetO與巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus,CMV)啟動子組合成tTA響應(yīng)元件(tTA response element,TRE)，由此便得到了tet-off基因表達(dá)雙元件系統(tǒng)(Belloetal.,1998; Gossen & Bujard,1992)。四環(huán)素不存在時，tTA蛋白結(jié)合tetO從而引發(fā)CMV啟動子對下游基因的啟動功能；四環(huán)素濃度達(dá)到一定劑量時，四環(huán)素與tTA蛋白結(jié)合，阻抑了tetO感知tTA的途徑，因此無法激發(fā)TRE下游基因的轉(zhuǎn)錄活化。

如果將某些“致死基因”作為上述基因表達(dá)系統(tǒng)中的目的基因，那么含有該系統(tǒng)的個體在沒有四環(huán)素的條件下，由于“致死基因”的大量表達(dá)而導(dǎo)致其個體死亡，而在四環(huán)素存在時，“致死基因”不能表達(dá)，個體可正常發(fā)育和存活(圖1A)。相關(guān)研究表明，低水平表達(dá)的tTA對細(xì)胞無害，被廣泛用于基因表達(dá)研究，然而高水平表達(dá)的tTA蛋白對細(xì)胞有毒害作用，其原因可能是依賴泛素的蛋白質(zhì)水解作用受到干擾。Gongetal. (2005)根據(jù)上述現(xiàn)象對雙元件致死系統(tǒng)進(jìn)行簡化，得到了單元件致死系統(tǒng)。在該系統(tǒng)中，tTA發(fā)揮了轉(zhuǎn)錄激活因子與致死效應(yīng)因子的雙重功能：在無四環(huán)素條件下，基礎(chǔ)水平表達(dá)的tTA蛋白可以反復(fù)結(jié)合tetO，從而促使更大量tTA的合成，其表達(dá)量受tTA的mRNA穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄效率的調(diào)控，逐步積累可達(dá)到使蟲體致死的劑量；存在四環(huán)素的條件下，tTA的驅(qū)動作用被抑制，從而使其表達(dá)量保持在較低水平而不會對蟲體造成傷害(圖1B)。

圖1　四環(huán)素可抑制的雙元件致死系統(tǒng)(A)及單元件致死系統(tǒng)(B) (改自Morrison et al.,2010)

2　遺傳控制策略與致死系統(tǒng)類型

2.1　雙元件雌性特異致死系統(tǒng)

Thomasetal.(2000)獲得了黑腹果蠅Drosophilamelanogaster(Meigen)的雌性特異致死品系，該體系是基于轉(zhuǎn)基因雙元件表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建的：以雌蟲特異表達(dá)的卵黃蛋白yp3基因的啟動子驅(qū)動tTA的表達(dá)，以能產(chǎn)生細(xì)胞毒素的Ras64BV12基因作為效應(yīng)載體中的致死基因，所得品系在有四環(huán)素條件下生長正常，在無四環(huán)素條件下雌蟲全部死亡?；诖?，提出了釋放攜帶顯性致死系統(tǒng)昆蟲(Release of insects carrying a dominant lethal,RIDL)的理念，并分析了該系統(tǒng)與傳統(tǒng)SIT相比的優(yōu)勢。

Heinrich & Scott(2000)也基于類似的思路在果蠅上實(shí)現(xiàn)了雙元件的雌性特異致死系統(tǒng)，該系統(tǒng)使用了在雌蟲脂肪體中特異表達(dá)的卵黃蛋白yp1基因的啟動子和可促近細(xì)胞凋亡的頭部退化缺陷基因headinvolutiondefective(hid)分別構(gòu)建驅(qū)動載體和效應(yīng)載體，并獲得遺傳轉(zhuǎn)化品系。tTA的表達(dá)受雌蟲脂肪體特異表達(dá)基因yp1的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子的調(diào)控，在沒有四環(huán)素的條件下，tTA與tetO結(jié)合并進(jìn)一步誘導(dǎo)促細(xì)胞凋亡基因hid在脂肪體中表達(dá)，雌蟲脂肪體的缺失導(dǎo)致其死亡；存在四環(huán)素條件下，tTA與tetO的結(jié)合受到抑制，hid基因不能表達(dá)，雌蟲可正常存活(圖2)。

2.2　雙元件胚胎致死系統(tǒng)

以上系統(tǒng)由于卵黃蛋白基因在成蟲期才能高表達(dá)，所以該系統(tǒng)多在成蟲期才能致死，而實(shí)蠅類害蟲多在幼蟲期危害，如果可以實(shí)現(xiàn)胚胎期致死，則可以避免釋放的不育雄蟲的后代造成的危害，一定程度上降低其生態(tài)風(fēng)險，而且還將大大降低飼養(yǎng)成本。

Horn & Wimmer(2003)利用在胚胎早期高表達(dá)的serendipityα(sryα)和nullo基因的啟動子來驅(qū)動tTA的表達(dá)，以hid基因?yàn)橹滤阑?，分別構(gòu)建胚胎早期驅(qū)動載體(Embryonic driver)和致死效應(yīng)載體(Lethal effector)，在果蠅上成功構(gòu)建了胚胎條件致死系統(tǒng)。該系統(tǒng)中由sryα驅(qū)動tTA在胚胎早期高表達(dá)，無四環(huán)素條件下，tTA與TRE結(jié)合驅(qū)動促細(xì)胞凋亡基因hid的表達(dá)并累積，從而使蟲體在胚胎期死亡；而存在四環(huán)素的條件下，可阻止tTA與TRE的結(jié)合，hid不能表達(dá)，胚胎可存活并正常發(fā)育(圖3)。

圖2　四環(huán)素調(diào)控的轉(zhuǎn)基因雙元件雌性特異

該系統(tǒng)已在地中海實(shí)蠅Ceratitiscapitata(Wiedemann) (Scheteligetal.,2009)和加勒比按實(shí)蠅Anastrephasuspensa(Loew)(Schetelig & Handler,2012a)中成功建立。地中海實(shí)蠅的雙元件致死系統(tǒng)中驅(qū)動品系、效應(yīng)品系和致死品系的熒光表達(dá)模式如圖4所示，驅(qū)動品系和效應(yīng)品系可分別表達(dá)紅色熒光蛋白DsRed和綠色熒光蛋白EGFP，而由其雜交所得的致死品系同時含有驅(qū)動元件和效應(yīng)元件，同時表達(dá)這2種熒光。

圖3　雙元件胚胎條件致死體系原理示意圖(Ogaugwu,2013)

圖4　地中海實(shí)蠅雙元件致死系統(tǒng)中驅(qū)動品系、效應(yīng)品系和致死品系的熒光表達(dá)模式

2.3　單元件早期發(fā)育致死系統(tǒng)

Gongetal. (2005)構(gòu)建了單元件致死系統(tǒng)所需的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pLA656和pLA928，這2個質(zhì)粒除標(biāo)記單元中熒光蛋白基因所用的啟動子不同外，轉(zhuǎn)座子和致死單元的組成都相同，其中致死單元由熱激蛋白hsp70基因啟動子、tetO和經(jīng)過密碼子優(yōu)化突變改造的tTA (tTAV)組成，所用啟動子為果蠅hsp70基因啟動子的近端元件片段(包括其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和很短的前導(dǎo)序列，推斷其已失去熱激響應(yīng)功能)；pLA656中由ubi-p63E啟動子驅(qū)動紅色熒光蛋白DsRed2表達(dá)，而pLA928中則為Hr5增強(qiáng)子和IE1啟動子。

用這2個質(zhì)粒對地中海實(shí)蠅進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了早期發(fā)育致死的RIDL品系，將純合子雄蟲與野生型雌蟲交配，則后代基因組中攜帶單拷貝的復(fù)合轉(zhuǎn)座子，在無四環(huán)素條件下，致死單元表達(dá)tTAV并大量積累最終死亡；該品系的雜合子和純合子個體能通過熒光表達(dá)強(qiáng)度來區(qū)分。所得品系中使tTAV的表達(dá)量積累到致死劑量一般要到幼蟲期，在無四環(huán)素條件下，所得品系的地中海實(shí)蠅很少(1.3%~7.7%)能存活到蛹期，極少數(shù)(0.2%~0.7%)可發(fā)育到成蟲(Gongetal.,2005)。

基于類似設(shè)計， Morrisonetal.(2012)和 Simmonsetal.(2007)構(gòu)建了質(zhì)粒OX1124并用于棉紅鈴蟲Pectinophoragossypiella(Saunders) RIDL品系的構(gòu)建，該質(zhì)粒所得轉(zhuǎn)化品系的幼蟲期致死率僅27%~46%。分析發(fā)現(xiàn)，增加tetO/tTAV在其基因組中的拷貝數(shù)可放大致死率。對該質(zhì)粒進(jìn)行改造后，構(gòu)建了含多個tetO/tTAV的質(zhì)粒OX3347、OX3400和OX3402，并通過遺傳轉(zhuǎn)化得到了相應(yīng)的轉(zhuǎn)化品系，其中OX3347和OX3402得到了幼蟲期致死率100%的品系。

2.4　單元件雌性特異致死系統(tǒng)

與性別決定相關(guān)的2個關(guān)鍵基因transformer和doublesex均存在雌雄差異剪切現(xiàn)象(Black,2003; Parketal.,2004; Sacconeetal.,2002)。在雄蟲中trasformer的編碼區(qū)由含有多個終止密碼子的外顯子所打斷，而雌蟲中的剪切體不含該外顯子(圖5A)，因此可編碼有功能的Tra蛋白(Paneetal.,2002)。如果將這段雌性特異剪切的內(nèi)含子插入到基因組上某個基因的編碼區(qū)，那么從原理上來講，與transformer基因的情況類似，該基因?qū)⒅辉诖葡x中表達(dá)(圖5B)。Fuetal. (2007)將地中海實(shí)蠅中transformer基因(Cctra)的雌性特異剪切元件(Transformer intron,traI)引入到質(zhì)粒pLA928中得到質(zhì)粒pLA3097，使tTAV只能在雌蟲中表達(dá)并積累至致死劑量，而雄蟲則不能表達(dá)tTAV，從而實(shí)現(xiàn)了雌性特異的早期發(fā)育致死。

通過該系統(tǒng)，Oxitec公司已經(jīng)分別在地中海實(shí)蠅(圖6A、 B)、橄欖實(shí)蠅Bactroceraoleae(Gmelin) (圖6C、 D)、墨西哥按實(shí)蠅Anastrephaludens(Loew)和小菜蛾P(guān)lutellaxylostella(L.)中建立了雌性幼蟲100%致死的雌性特異早期發(fā)育致死品系。Tanetal. (2013)使用家蠶Bombyxmori(L.)的doublesex基因(Bmdsx)雌性特異剪切元件構(gòu)建類似質(zhì)粒，并通過遺傳轉(zhuǎn)化得到了家蠶的雌性特異致死轉(zhuǎn)化品系。基于類似的設(shè)計，Lietal. (2014)和 Scott(2014)以銅綠蠅Luciliacuprina(Wiedemann)的熱激蛋白hsp70基因(Lchsp70)啟動子和其transformer基因(Lctra)雌性特異剪切內(nèi)含子元件等構(gòu)建相應(yīng)質(zhì)粒并獲得了銅綠蠅的雌性特異致死品系。

圖5　地中海實(shí)蠅transformer基因(Cctra)雌性特異剪切模式 (Fu et al.,2007)

圖6　雌性特異致死RIDL品系OX3864A (地中海實(shí)蠅: A, B)和OX3097D (橄欖實(shí)蠅: C, D)的

2.5　雙元件雌性特異胚胎致死系統(tǒng)

由于卵黃蛋白基因在成蟲期才能高表達(dá)，由其驅(qū)動的雙元件雌性特異致死系統(tǒng)只能在成蟲期致死；而單元件的雌性特異致死系統(tǒng)中tTA的致死作用原理尚不明確，且飼養(yǎng)條件下抑制該系統(tǒng)表達(dá)所需的四環(huán)素濃度較高(Schetelig & Handler,2012a)，可能會提高某些潛在的未知風(fēng)險，所以更理想的是利用雙元件致死系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)雌性特異胚胎致死。

該系統(tǒng)可通過將transformer基因的雌性特異剪切內(nèi)含子元件traI引入到雙元件胚胎條件致死系統(tǒng)中的驅(qū)動載體或效應(yīng)載體中來達(dá)到該目的。分別構(gòu)建含有traI的驅(qū)動載體(Sexing driver)質(zhì)粒和效應(yīng)載體(Sexing effector)質(zhì)粒，并獲得相應(yīng)遺傳轉(zhuǎn)化品系，并分別與相應(yīng)不含traI的效應(yīng)品系或驅(qū)動品系雜交，則所得品系中只有雌蟲可以表達(dá)tTA蛋白并驅(qū)動TRE表達(dá)Hid蛋白從而致死，或者雌雄蟲都能表達(dá)tTA蛋白，但只有雌蟲可以表達(dá)Hid蛋白，從而實(shí)現(xiàn)雌性特異的胚胎致死(Ogaugwu,2013)。

在地中海實(shí)蠅中，用含traI的效應(yīng)載體(圖7B)轉(zhuǎn)化所得效應(yīng)品系與不含traI的驅(qū)動載體(圖7A)所得驅(qū)動品系進(jìn)行雜交得到的致死品系能達(dá)到雌蟲胚胎100%致死，而含traI的驅(qū)動載體與不含traI的效應(yīng)載體所得品系的致死效率較低(Ogaugwu,2013)?；陬愃频乃悸?，Schetelig & Handler (2012b)通過使用按實(shí)蠅中的相關(guān)分子元件成功構(gòu)建了加勒比按實(shí)蠅的雌性特異胚胎致死品系，其雜合子和純合子的熒光表達(dá)模式及熒光強(qiáng)度對比如圖8所示，它們也均可同時表達(dá)紅色熒光蛋白和綠色熒光蛋白，而純合子個體表達(dá)熒光強(qiáng)度要比雜合子個體強(qiáng)。

圖7　雌性特異胚胎致死體系中胚胎驅(qū)動載體(A)和雌性特異效應(yīng)載體(B)的

圖8　雙元件致死的加勒比按實(shí)蠅雜合個子(A)和純合子(B)的

3　橘小實(shí)蠅遺傳不育品系構(gòu)建的工作進(jìn)展

橘小實(shí)蠅是一種危害水果和蔬菜的世界性害蟲，在我國發(fā)生尤為嚴(yán)重，且有向北方果蔬產(chǎn)區(qū)擴(kuò)張的趨勢(謝琦和張潤杰，2005； 尹英超和王勤英，2014； 周國梁等，2007)。目前，橘小實(shí)蠅的防治主要以性誘劑和化學(xué)農(nóng)藥等傳統(tǒng)防治措施為主，已有研究發(fā)現(xiàn)，由于頻繁使用農(nóng)藥，橘小實(shí)蠅野外種群已對有機(jī)磷殺蟲劑、擬除蟲菊酯和阿維菌素等產(chǎn)生了抗性(潘志萍等，2005； 章玉蘋等，2008)。根據(jù)我國對橘小實(shí)蠅有效防控的需求，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物入侵研究室錨定國際研究前沿，開展了橘小實(shí)蠅遺傳控制技術(shù)體系的構(gòu)建研究。

基于對以上各遺傳不育系統(tǒng)的分析，研究人員擬采用基于tet-off雙元件表達(dá)系統(tǒng)的不育策略，在橘小實(shí)蠅中首先構(gòu)建胚胎致死系統(tǒng)和雌性特異胚胎致死系統(tǒng)。首先，該體系的構(gòu)建需要得到的分子元件包括：(1)胚胎早期高表達(dá)基因的啟動子，以構(gòu)建胚胎早期驅(qū)動載體并使其在胚胎期啟動tTA系統(tǒng)；(2) 致死基因(如促細(xì)胞凋亡基因hid,reaper和grim等)，用于構(gòu)建致死效應(yīng)載體；(3) 雌性特異剪接基因元件(如性別決定基因transformer或doublesex的雌性特異剪切內(nèi)含子序列)，用于構(gòu)建雌性特異表達(dá)的效應(yīng)載體。在得到以上分子元件后，構(gòu)建相應(yīng)載體并通過遺傳轉(zhuǎn)化與篩選獲得驅(qū)動品系與效應(yīng)品系，再將其雜交進(jìn)行致死效果驗(yàn)證，并最后獲得相應(yīng)致死品系。

目前，研究人員已經(jīng)克隆了胚胎分化期特異表達(dá)基因sryα及母體效應(yīng)基因nanos和vasa等胚胎早期高表達(dá)基因，并分離了它們的上游潛在啟動區(qū)序列；克隆了促細(xì)胞凋亡基因hid的cDNA全長；克隆了性別決定基因transformer的cDNA全長并得到了其內(nèi)含子序列，通過分析獲得了其雌性特異剪切元件；并已利用以上分子元件構(gòu)建了雙元件胚胎致死品系所需的胚胎早期驅(qū)動載體和致死效應(yīng)載體。然后，對橘小實(shí)蠅早期胚胎顯微注射流程進(jìn)行了調(diào)整和優(yōu)化，通過胚胎顯微注射將各載體對橘小實(shí)蠅進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的工作正在進(jìn)行中。以上研究結(jié)果為獲得橘小實(shí)蠅遺傳不育品系，實(shí)現(xiàn)橘小實(shí)蠅可持續(xù)控制奠定了基礎(chǔ)。

4　總結(jié)與展望

近年來，由于國際果蔬貿(mào)易活動的大量增加和旅游產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，大大增加了有害生物傳播和擴(kuò)散的機(jī)會，很多實(shí)蠅類害蟲在原發(fā)生地以外的地區(qū)發(fā)生為害(Clarkeetal.,2005; Malacridaetal.,2007)。實(shí)蠅類害蟲的雜食性、較強(qiáng)的飛行能力和較高的繁殖力等特點(diǎn)，使其具有很強(qiáng)的入侵性(Duycketal.,2004)，而其幼蟲危害的隱蔽性也使得化學(xué)防治等傳統(tǒng)防治技術(shù)不能對其進(jìn)行有效防治。因此，研究人員一直在致力于研究和發(fā)展針對實(shí)蠅類害蟲的替代傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥的防治技術(shù)。

Rubin & Spradling(1982)通過P-轉(zhuǎn)座元件將調(diào)控野生型玫瑰色眼睛顏色的基因插入果蠅基因組，開啟了轉(zhuǎn)基因昆蟲領(lǐng)域的相關(guān)研究，經(jīng)過30多年的發(fā)展，在很多昆蟲中對其基因組進(jìn)行人工操縱和改造已成為現(xiàn)實(shí)(Fraser,2012)。這些技術(shù)已成為在一些模式昆蟲中進(jìn)行基因功能分析等基礎(chǔ)生物學(xué)研究的重要實(shí)驗(yàn)工具，也為農(nóng)林害蟲和媒介害蟲的防治提供了新的思路(Wimmer,2003)。近年來，用于害蟲防治的遺傳不育技術(shù)相關(guān)研究取得了很多重要進(jìn)展(曾保勝等,2013； Morrisonetal.,2010)，可應(yīng)用于SIT的多個類型的遺傳致死品系先后在果蠅、地中海實(shí)蠅、橄欖實(shí)蠅、按實(shí)蠅等實(shí)蠅類害蟲，及棉紅鈴蟲、小菜蛾和家蠶等農(nóng)業(yè)昆蟲中建立(表1)。

害蟲遺傳控制技術(shù)具有物種特異、環(huán)境友好及高效長久等優(yōu)點(diǎn)，符合未來有害生物防治技術(shù)的需求與發(fā)展趨勢，將在基于大區(qū)域綜合治理策略的農(nóng)業(yè)害蟲綜合防控技術(shù)體系中發(fā)揮重要作用。然而，作為一種基于遺傳修飾的新型害蟲防控技術(shù)，遺傳控制技術(shù)在廣泛應(yīng)用前仍存在一些問題。

首先，經(jīng)過遺傳修飾的生物在進(jìn)行野外環(huán)境釋放前，要嚴(yán)格進(jìn)行系統(tǒng)的安全性風(fēng)險評價，已有多家研究單位和政府組織進(jìn)行了一系列相關(guān)研究，并制訂了遺傳轉(zhuǎn)化昆蟲研究和釋放流程相關(guān)的政策和法規(guī)(AHTEG,2010; Benedictetal.,2011; FAO/IAEA,2006; NRE,2009; USDA-APHIS,2009)。

其次，抗性問題也是需要考慮的重要問題之一。很多昆蟲具有對各種化學(xué)農(nóng)藥和生物農(nóng)藥快速產(chǎn)生抗性的能力(Zhaoetal.,2003)，相關(guān)調(diào)查發(fā)現(xiàn),有些經(jīng)過SIT防治“篩選”的雌蟲產(chǎn)生了“行為抗性(Behaviral resistance)”，即可識別釋放的不育雄蟲并避免與其交配(Dycketal.,2005)。目前大部分基于遺傳修飾改進(jìn)的SIT體系中，都是單一致死因子(如雙元件系統(tǒng)中的促細(xì)胞凋亡基因和單元件系統(tǒng)中的tTA蛋白的過量表達(dá))，而少數(shù)害蟲體內(nèi)可能會存在或者有些害蟲在防治過程中會產(chǎn)生相應(yīng)的抗性突變位點(diǎn)，所以，目標(biāo)害蟲是否也會通過其“生物抗性”能力對該技術(shù)產(chǎn)生抗性也是需要考慮的重要問題之一(Alpheyetal.,2011; Gould,1998; Maclntosh,2010; Reevesetal.,2012)。

表1　已成功構(gòu)建遺傳致死品系的農(nóng)業(yè)昆蟲

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，各種高效的基因組編輯技術(shù)體系已逐步發(fā)展成熟并且在多種物種中成功測試(王躍強(qiáng)等,2013； Fraser,2012)，這些技術(shù)的應(yīng)用及相關(guān)新體系的建立有望進(jìn)一步解決現(xiàn)行手段的缺陷并顯著提高安全性，為新型的害蟲遺傳控制技術(shù)的發(fā)展提供重要工具。

致謝：本文中所用部分圖片由Dr. Marc F. Schetelig (Justus-Liebig-University Giessen, Germany)和Dr. Luke Alphey (Oxitec Limited, UK)提供，特此表示感謝。

參考文獻(xiàn)

李志紅, 姜帆, 馬興莉, 方焱, 孫壯志, 秦譽(yù)嘉, 王巧鈴. 2013. 實(shí)蠅科害蟲入侵防控技術(shù)研究進(jìn)展. 植物檢疫, 27(2): 1-10.

潘志萍, 曾玲, 陸永躍. 2005. 華南地區(qū)桔小實(shí)蠅對幾種農(nóng)藥的抗藥性研究. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報： 自然科學(xué), 26(4): 23-26.

王躍強(qiáng), 鄭貴斌, 譚安江, 黃勇平. 2013. 基因組編輯技術(shù)及其在昆蟲研究中的應(yīng)用. 中國科學(xué): 生命科學(xué), 43(12): 1105-1111.

謝琦, 張潤杰. 2005. 桔小實(shí)蠅生物學(xué)特點(diǎn)及其防治研究概述. 生態(tài)科學(xué), 24(1): 52-56.

嚴(yán)盈, 楊瑞, 呂志創(chuàng), 郭建英, 張桂芬, 萬方浩. 2009. 實(shí)蠅害蟲防治措施的研究進(jìn)展. 中國生物防治, (增刊2): 1-19.

尹英超, 王勤英. 2014. 警惕北方果園新害蟲——桔小實(shí)蠅. 河北農(nóng)業(yè), 236(11): 48-49.

曾保勝, 許軍, 陳樹清, 譚安江, 黃勇平. 2013. 昆蟲種群的遺傳調(diào)控. 中國科學(xué): 生命科學(xué), 43(12): 1098-1104.

章玉蘋, 曾玲, 陸永躍, 梁廣文. 2008. 華南地區(qū)桔小實(shí)蠅田間種群抗藥性的監(jiān)測. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 27(4): 456-459.

周國梁, 陳晨, 葉軍, 胡白石, 劉鳳權(quán). 2007. 利用GARP生態(tài)位模型預(yù)測橘小實(shí)蠅(Bactroceradorsalis)在中國的適生區(qū)域. 生態(tài)學(xué)報, 27(8): 3362-3369.

AHTEG. 2011. Risk assessment of living modified mosquitoes∥GuidanceonRiskAssessmentofLivingModifiedOrganisms. Ad Hoc Technical Expert Group on Risk Assessment and Risk Management (AHTEG), Secretariat of the Convention on Biological Diversity, Montreal, Canada.

Allwood A J, Vueti E T, Leblanc L and Bull R. 2002. Eradication of introducedBactroceraspecies (Diptera: Tephritidae) in Nauru using male annihilation and protein bait application techniques∥Veitch C R and Clout M N.TurningtheTide:theEradicationofInvasiveSpecies. IUCN Species Specialist Group. IUCN, Gland Switzerland and Cambridge, UK, 19-25.

Alphey N, Bonsall M B and Alphey L. 2011. Modeling resistance to genetic control of insects.JournalofTheoreticalBiology, 270: 42-55.

Bello B, Resendez-Perez D and Gehring W J. 1998. Spatial and temporal targeting of gene expression inDrosophilaby means of a tetracycline-dependent transactivator system.Development, 125: 2193-2202.

Benedict M Q, Eckerstorfer M, Franz G,Gaugitsch H, Greiter A, Heissenbergera A, Knols B, Kumschick S, Nentwig W and Rabitsch W. 2010. Defining environmental risk assessment criteria for genetically modified insects to be placed on the EU market.Scientific/technicalreportsubmittedtoEFSA. Question number: EFSA-Q-2009-01081.

Black D L. 2003. Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing.AnnualReviewofBiochemistry, 72: 291-336.

Clarke A R, Armstrong K F, Carmichael A E, Milne J R, Raghu S, Roderick G K and Yeates D K. 2005. Invasive phytophagous pest arising through a recent tropical evolutionary radiation: theBactroceradorsaliscomplex of fruit flies.AnnualReviewofEntomology, 50: 293-319.

Cunningham R T. 1989. Male annihilation∥Robinson A S and Cooper G.FruitFlies:theirBiology,NaturalEnemiesandControl. Amsterdam: Elsevier, 345-351.

Duyck P F, David P and Quilici S. 2004. A review of relationships between interspecific competition and invasions in fruit flies (Diptera: Tephritidae).EcologicalEntomology, 29: 511-520.

Dyck V A, Hendrichs J and Robinson A S. 2005.SterileInsectTechnique:PrinciplesandpracticeinArea-WideIntegratedPestManagement. The Netherlands: Springer.

FAO/IAEA. 2006.StatusandRiskAssessmentoftheUseofTransgenicArthropodsinPlantProtection. FAO/IAEA technical meeting, 8-12 April 2002. IAEA-TECDOC-1483. http:∥www-pub.iaea.org/MTCD/publications/PDF/te_1483_web.pdf.

Fraser M J. 2012. Insect transgenesis: current applications and future prospects.AnnualReviewofEntomology, 57: 267-289.

Fu G, Condon K C, Epton M J, Gong P, Jin L, Condon G C, Morrison N I, Dafa′alla T H and Alphey L. 2007. Female-specific insect lethality engineered using alternative splicing.NatureBiotechnology, 25: 353-357.

Gatz C and Quail P H. 1988. Tn10-encoded tet repressor can regulate an operator-containing plant promoter.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica, 85: 1394-1397.

Gong P, Epton M J, Fu G L, Scaife S, Hiscox A, Condon K C, Condon G C, Morrison N I, Kelly D W, Dafa′alla T, Coleman P G and Alphey L. 2005. A dominant lethal genetic system for autocidal control of the Mediterranean fruitfly.NatureBiotechnology, 23: 453-456.

Gossen M and Bujard H. 1992. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica, 43: 701-726.

Gould F. 1998. Sustainability of transgenic insecticidal cultivars: integrating pest genetics and ecology.AnnualReviewofEntomology, 43: 701-726.

Hardy D E. 1969. Taxonomy and distribution of the oriental fruit fly and related species (Tephritidae: Diptera).ProceedingsoftheHawaiianEntomologicalSociety, 20: 395-428.

Heinrich J C and Scott M J. 2000. A repressible female-specific lethal genetic system for making transgenic insect strains suitable for a sterile-release program.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences, 97: 8229-8232.

Horn C and Wimmer E A. 2003. A transgene-based, embryo-specific lethality system for insect pest management.NatureBiotechnology, 21: 64-70.

Klassen W. 2005. Area-wide integrated pest management and the Sterile Insect Technique∥Dyck V A, Hendrichs J and Robinson A S.SterileInsectTechnique:PrinciplesandpracticeinArea-WideIntegratedPestManagement. Springer, Dordrecht, The Netherlands, 39-68.

Klassen W and Curtis C F. 2005. History of the Sterile Insect Technique∥Dyck V A, Hendrichs J and Robinson A S.SterileInsectTechnique:PrinciplesandpracticeinArea-WideIntegratedPestManagement. Springer, Dordrecht, The Netherlands, 3-36.

Knipling E F. 1955. Possibilities in insect control or eradication through the use of sexually sterile males.JournalofEconomicEntomology, 48: 459-462.

Li F, Wantuch H A, Linger R J, Belikoff E J and Scott M J. 2014. Transgenic sexing system for genetic control of the Australian sheep blow flyLuciliacuprina.InsectBiochemistryandMolecularBiology, 51: 80-88.

Lysandrou M. 2009. Fruit flies in the mediterranean and Arab world: how serious a threat are they and how can we minimize their impact.ArabJournalofPlantProtection, 27: 236-239.

Maclntosh S C. 2010. Managing the risk of insect resistance to transgenic insect control traits: practical approaches in local environments.PestManagementScience, 66:100-106.

Malacrida A R, Gomulski L M, Bonizzoni M, Bertin S, Gasperi G and Guglielmino C R. 2007. Globalization and fruitfly invasion and expansion: the medfly paradigm.Genetica, 131: 1-9.

Morrison N I, Franz G, Koukidou M, Miller T A, Saccone G, Alphey L S, Beech C J, Nagaraju J, Simmons G S and Polito L C. 2010. Genetic improvements to the sterile insect technique for agricultural pests.Asia-PacificJournalofMolecularBiologyandBiotechnology, 18: 275-295.

Morrison N I, Simmons G S, Fu G, O′Connell S, Walker A S, Dafa′alla T, Walters M, Claus J, Tang G, Jin L, Marubbi T, Epton M J, Harris C L, Staten R T, Miller E, Miller T A and Alphey L. 2012. Engineered repressible lethality for controlling the pink bollworm, a Lepidopteran pest of cotton.PLoSONE, 7: e50922.

NRE. 2009. Risk assessment workshop on transgenic insects∥Hilton P J.MinistryofNaturalResourcesandEnvironment. Putrajaya, Malaysia, 13-15. http:∥www.nre.gov.my/Malay/Pusat-Media/Penerbitan/NewsletterBoisafety2009.pdf.

Ogaugwu C E. 2013.Biotechnologicalapproachestofightfruitfliesofagriculturalimportance. Goettingen: University of Goettingen.

Ogaugwu C E, Schetelig M F and Wimmer E A. 2013. Transgenic sexing system forCeratitiscapitata(Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality.InsectBiochemistryandMolecularBiology, 43: 1-8.

Pane A, Salvemini M, Delli Bovi P, Polito C and Saccone G. 2002. The transformer gene inCeratitiscapitataprovides a genetic basis for selecting and remembering the sexual fate.Development, 129: 3715-3725.

Park J W, Parisky K, Celotto A, Reenan R and Graveley B. 2004. Identification of alternative splicing regulators by RNA interference inDrosophila.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica, 101: 15974-15979.

Reeves R G, Denton J A, Santucci F, Bryk J and Reed F A. 2012. Scientific standards and the regulation of genetically modified insects.PLoSNeglectedTropicalDiseases, 6: e1502.

Rubin G M and Spradling A C. 1982. Genetic transformation ofDrosophilawith transposable element vectors.Science, 218: 348-353.

Saccone G, Pane A and Polito C. 2002. Sex determination in flies, fruitflies and butterflies.Genetica, 116: 15-23.

Schetelig M F and Handler A M. 2012a. Strategy for enhanced transgenic strain development for embryonic conditional lethality inAnastrephasuspense.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica, 109: 9348-9353.

Schetelig M F and Handler A M. 2012b. A transgenic embryonic sexing system forAnastrephasuspense(Diptera: Tephritidae).InsectBiochemistryandMolecularBiology, 42: 790-795.

Scolari F, Schetelig M F, Gabrieli P, Siciliano P, Gomulski L M, Karam N, Wimmer E A, Malacrida A R and Gasperi G. 2008. Insect transgenesis applied to tephritid pest control.JournalofAppliedEntomology, 132: 820-831.

Scott M J. 2014. Development and evaluation of male-only strains of the Australian sheep blowfly,Luciliacuprina.BMCGenetics, 15(S2): S3.

Simmons G S, Alphey L S, Vasquez T, Morrison N I, Epton M J, Miller E, Miller T A and Staten R T. 2007. Potential use of a conditional lethal transgenic pink bollworm pectinophora gossypiella∥Vreysen M J B, Robinson A S and Hendrichs J.Area-WideControlofInsectPests:FromResearchtoFieldImplementation. Dordrecht, The Netherlands: Springer, 119-123.

Tan A, Fu G, Jin L, Guo Q, Li Z, Niu B, Meng Z, Morrison N I, Alphey L and Huang Y. 2013. Transgene-based, female-specific lethality system for genetic sexing of the silkworm,Bombyxmori.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica, 110: 6766-6770.

Thomas D D, Donnelly C A, Wood R J and Alphey L S. 2000. Insect population control using a dominant, repressible, lethal genetic system.Science, 287: 2474-2476.

USDA-APHIS. 2008. General document preparation guidelines for submission to BRS. v. 2/22/2011.http:∥www.aphis.usda.gov/brs/pdf/Doc_Prep_Guidance.pdf.

Vargas R I, Mau R F L, Stark J D, Piero J C, Leblanc L and Souder S K. 2010. Evaluation of methyl eugenol and cue-lure traps with solid lure and insecticide dispensers for fruit fly monitoring and male annihilation in the Hawaii areawide pest management program.JournalofEconomicEntomology, 103: 409-415.

White I M and Elson-Harris M M. 1992.FruitFliesofEconomicSignificance:TheirIdentificationandBionomics. CAB International, Wallingford, UK.

Wimmer E A. 2003. Applications of insect transgenesis.NatureReviewsGenetics, 4: 225-232.

Zhao J Z, Cao J, Li Y, Collins H L, Roush R T, Earle E D and Shelton A M. 2003. Transgenic plants expressing twoBacillusthuringiensistoxins delay insect resistance evolution.NatureBiotechnology, 21: 1493-1497.

(責(zé)任編輯:郭瑩)

Sciences,Beijing100193,China;2DepartmentofEntomology,NorthCarolinaStateUniversity,CampusBox7613,Raleigh,

NC27695-7613,USA;3GeneticEngineeringandSocietyCenterandW.M.KeckCenterforBehavioralBiology,North

CarolinaStateUniversity,Raleigh,NC27695-7613,USA;4GuangdongEntomologicalInstitute,Guangzhou，

Guangdong510260,China;5CollegeofAgronomyandPlantProtection,QingdaoAgriculturalUniversity,

Qingdao，Shandong266109,China

Abstract:Many tephritid fruit flies are economically important pest species that can destroy fruits and vegetables, bringing can be a barrier to international trades. The Sterile Insect Technique (SIT), a species-specific and environment-friendly pest control method, has been proven to be highly effective against tephritid pests. Genetic engineering has a potential to bring great improvements to SIT and facilitate its applicability to more insect pests. Much progress has been made in the area, which also became a frontier of genetic innovation. Here we describe the principles of lethality systems based on the tet-off inducible gene expression system，same case studies from Drosophila and tephritid fruit flies for the improvement of SIT, and the application of similar systems to other agricultural insects. The progress to develop a genetic control system on Bactrocera dorsalis is also briefly reported here. The genetic control strategies based on genetic engineering and SIT is believed to play a great role in the Integrated Pest Management (IPM) of tephritid fruit flies and other agricultural insect pests in the future.

Key words:genetic control; fruit flies; sterile insect technique; tet-off gene expression system; lethality strains

通訊作者*(Author for correspondence): 張桂芬， E-mail: guifenzhang3@163.com; 萬方浩， E-mail: wanfanghao@caas.cn

作者簡介:張桂芬, 女, 研究員。 研究方向： 入侵生物學(xué)。 E-mail: guifenzhang3@163.com

基金項目:公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(200903047)； 國家“973”計劃項目(2009CB119200)

收稿日期(Received)： 2014-11-12接受日期(Accepted)： 2015-01-28

DOI:10.3969/j.issn.2095-1787.2015.02.009