繆璐歡，白鳳翎，勵建榮

(渤海大學食品科學研究院，遼寧省食品安全重點實驗室，“食品貯藏加工及質量安全控制工程技術研究中心”遼寧省高校重大科技平臺，遼寧錦州，121013)

傳統(tǒng)乳酸發(fā)酵食品是以天然乳酸菌為主體微生物發(fā)酵原料中的碳水化合物和蛋白質等大分子物質，形成以乳酸為主要代謝產(chǎn)物的具有酸、香、鮮風味的食品，主要包括酸奶、干酪和開菲爾等發(fā)酵乳制品，泡菜、酸菜、橄欖等發(fā)酵果蔬制品，火腿、香腸等發(fā)酵肉制品以及酵頭發(fā)酵面制品等。傳統(tǒng)乳酸發(fā)酵食品中具有豐富而龐雜的微生物區(qū)系，通過微生物種群與基質的相互作用，不僅使食品獲得了良好的風味，改善食品的品質，提高食品的營養(yǎng)價值，而且提升了食品的安全性，延長產(chǎn)品的保藏期。

乳酸菌是傳統(tǒng)乳酸發(fā)酵食品的主體微生物類群，分為同型和異型乳酸發(fā)酵乳酸菌，前者降解碳水化合物后產(chǎn)物為乳酸，后者除產(chǎn)生乳酸外，產(chǎn)生醇類、酮類、醛類等揮發(fā)性化合物，賦予發(fā)酵食品特有的口味和香味。同時，乳酸菌通過生態(tài)位競爭，形成酸性環(huán)境和產(chǎn)生拮抗性代謝產(chǎn)物，較好地控制了產(chǎn)品中的腐敗和致病微生物。因此，傳統(tǒng)乳酸發(fā)酵食品中乳酸菌對產(chǎn)品的品質和安全性具有十分突出的作用。本文對傳統(tǒng)乳酸發(fā)酵食品發(fā)酵過程中乳酸菌的發(fā)生、發(fā)展和演替過程和分析方法進行綜述，分析各種傳統(tǒng)乳酸發(fā)酵食品中乳酸菌與基質之間、乳酸菌與他種微生物之間、乳酸菌與乳酸菌之間的相互作用關系，進而闡明乳酸菌在傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的地位和作用，為實現(xiàn)傳統(tǒng)乳酸發(fā)酵食品的技術改造，開發(fā)乳酸菌資源提供借鑒與參考。

1 傳統(tǒng)發(fā)酵食品中乳酸菌的生態(tài)演替

傳統(tǒng)乳酸發(fā)酵食品充分體現(xiàn)了乳酸菌多樣性和多變性的生態(tài)學特點，乳酸菌的豐度(種群數(shù)量)和均勻度(種群量的大小)與演替過程主要受發(fā)酵原料、時間、溫度、地理環(huán)境以及其他微生物等因素的影響。

1.1 韓國泡菜

傳統(tǒng)韓國泡菜(kimchi)是以蔬菜為主要原料經(jīng)天然微生物發(fā)酵而成的食品，蔬菜中可溶性物質和部分浸出物為乳酸菌為主體的微生物生長提供營養(yǎng)需求，乳酸菌的生長較好地抑制了腐敗菌的繁殖。根據(jù)酸度變化，一般可將發(fā)酵過程分為初始階段(酸度＜0.2)、未成熟階段(酸度0.2～0.4)、成熟階段(酸度0.4 ～0.9)和過熟階段(酸度 ＞0.9)［1］。

Lee等［2］應用PCR-DGGE技術研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)韓國泡菜中主要乳酸菌類群為Weissella confusa、Leuconostoc citreum、Lactobacillus sakei和 Lb.curvatus。Cho等［3］應用多重 PCR技術研究發(fā)現(xiàn)，Leu.mesenteroides是泡菜未成熟期和成熟期的優(yōu)勢菌，Lb.sakei從初始發(fā)酵階段到過發(fā)酵階段一直存在。Park等［4］研究泡菜整個發(fā)酵過程中乳酸菌菌群為Weissella、Lactobacillus、Pediococcus 和 Leuconostoc。Jung等［5］應用焦磷酸測序技術分析表明，在不考慮泡菜類型和發(fā)酵劑的條件下，泡菜的主要乳酸菌類群為 Leuconostoc、Lactobacillus 和 Weissella，其 中 Leu-conostoc數(shù)量最多，Lactobacillus和Weissella次之。綜上研究結果表明，雖然不同品種和地域的傳統(tǒng)韓國泡菜產(chǎn)品中的乳酸菌類群構成不同，但主要乳酸菌類群為 Leuconostoc、Lactobacillus、Weissella 和 Pediococcus。

從韓國泡菜發(fā)酵過程中乳酸菌的菌相演替來看，發(fā)酵早期的優(yōu)勢菌群為Leuconostoc和 Weissella，隨后Lb.sakei替代 Leuconostoc和Weissella占優(yōu)勢，到發(fā)酵后期，主體乳酸菌為Lb.plantarum。韓國泡菜中乳酸菌來源于附著在蔬菜表面上的天然微生物類群，在發(fā)酵早期，pH在5.64～4.27，相對較高，乳酸菌主要為Leuconostoc、Lactobacillus和 Weissella［6-7］。Jeong 等研究發(fā)現(xiàn)，Leuconostoc、Lactobacillus和 Weissella是發(fā)酵開始階段的乳酸菌類群，可能由于 Leuconostoc和Weissella是原料蔥和蒜中的優(yōu)勢乳酸菌［8］。Cho等［9］研究發(fā)現(xiàn)，15℃預發(fā)酵2 d，然后在-1℃下進行主發(fā)酵，第一發(fā)酵階段泡菜中主要優(yōu)勢菌為 Leu.citreum 和 Leu.gasicomitatum，第 二 發(fā) 酵 階 段W.koreensis占主要優(yōu)勢。到發(fā)酵后期，當pH低于4.0 時，Hong 等［6］研 究 發(fā) 現(xiàn)，乳 酸 菌 主 要 為Lb.plantarum，可能是由于泡菜中Leuconostoc、Weissella和Pediococcus耐酸性較弱的緣故。

1.2 酵頭

酵頭是東西方各種發(fā)酵面制品(面包和饅頭等)的天然母發(fā)酵劑，按工藝酵頭分為I、II和III三種類型。I型為傳統(tǒng)酵頭，需經(jīng)每天翻新保持微生物處于活性狀態(tài)，II型為高溫條件下制作含有多種微生物的酵頭，III型酵頭為含有乳酸菌的干燥粉狀物［10］。酵頭中具有豐富多樣的微生態(tài)體系，酵母和乳酸菌是主要的微生物類群。其中，乳酸菌對面團結構和風味形成具有十分重要的作用，同時還具有提高營養(yǎng)價值和延長保質期的作用。

面團是營養(yǎng)豐富而全面的生態(tài)系統(tǒng)，微生物發(fā)酵作用將蛋白質、糖類等大分子物質水解成氨基酸、單糖等容易被乳酸菌生長吸收的小分子代謝產(chǎn)物，因此酵頭中乳酸菌呈現(xiàn)種類豐富而多樣的特點。Vuyst等［11］研究表明，酵頭中乳酸菌包括 Lactobacillus、Leuconostoc、Pediococcus和Weissella等菌屬。其中，Lactobacillus是傳統(tǒng)酵頭中最常見的乳酸菌類群，主要包括 Lb.brevis、 Lb.plantarum、 Lb.paralimentarius、Lb.rossiae 和 Lb.sanfranciscensis 等［12］。Robert 等［13］研究發(fā)現(xiàn)，Lactobacillus(39%)、Pediococcus(38%)、Leuconostoc(17%)、Weissella(4%)、Lactococcus(1%)和Enterococcus(＜1%)是法國傳統(tǒng)酵頭中的乳酸菌菌群。Corsetti等［12］分析酵頭中乳酸菌菌群的構成為 Enterococcus、Lactococcus、Leuconostoc、Pediococcus、Streptococcus和 Weissella。Moroni等［14］研究低溫持續(xù)自主發(fā)酵的buckwheat和teff傳統(tǒng)I型酵頭中乳酸菌組成，結果表明乳酸菌主要為Lactobacillus、Pediococcus、Leuconostoc。

總之，傳統(tǒng)酵頭具有豐富的乳酸菌微生態(tài)系統(tǒng)，最常見的是 Lactobacillus，Lactococcus、Enterococcus、Leuconostoc和Weissella廣泛存在于谷物和面粉中，但其耐受酸化環(huán)境的能力弱而在酵頭中處于弱勢地位［12］。與其他發(fā)酵食品相比，酵頭中發(fā)揮顯著作用的主要是專性異型發(fā)酵乳酸菌，這是由于它們能夠發(fā)酵糖類產(chǎn)生乙酸以及乳酸等代謝產(chǎn)物［15］。酵頭發(fā)酵過程中乳酸菌的演替主要與菌株對酸的適應機制和耐受性以及碳水化合物和氮代謝有關。Moroni等［14］應用PCR-DGGE技術研究buckwheat和teff酵頭中乳酸菌的演替過程，結果表明，初始發(fā)酵12 h主要有Lb.sakei、Lb.graminis 和 P.pentosaceus，12h 后 為Lb.plantarum、W.cibaria、Leu.holzapfelii，最后階段Lb.plantarum和W.cibaria的數(shù)量減少。Weckx等［16］研究發(fā)現(xiàn)黑麥酵頭發(fā)酵經(jīng)過3個主要階段，初期乳酸菌主要為 Lactococcus和 Enterococcus，中期被 Leuconostoc和 Weissella所取代，第 5天后主要為Lb.fermentum和Lb.plantarum。

1.3 發(fā)酵香腸

發(fā)酵香腸是經(jīng)乳酸菌、霉菌、酵母、微球菌等多種微生物共同發(fā)酵的肉制品，乳酸菌對產(chǎn)品的風味形成、營養(yǎng)價值提升和安全性保障都具有十分重要的作用。Urso等［17］研究意大利東北部 Friuli-Venezia-Giulia地區(qū)3種自然發(fā)酵香腸乳酸菌組成，發(fā)現(xiàn)Lb.curvatus(14.4%)和Lb.sakei(75.9%)數(shù)量最多。Bonomo等［18］對意大利南部Basilicata地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵香腸進行研究，發(fā)現(xiàn)Lb.sakei(67%)是優(yōu)勢乳酸菌，其次是P.pentosaceus(16%)和Leu.carnosum(8%)，然后是 Lb.plantarum(4%)、Lb.brevis(2%)和 Leu.pseudomesenteroides(2%)等。Cocolin 等［19］對意大利北部不同省份的3種發(fā)酵香腸乳酸菌生態(tài)學進行研究，發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢乳酸菌主要為 Lb.sakei和Lb.curvatus。

從乳酸菌在發(fā)酵香腸的菌群演變來看，發(fā)酵早期主要為Lb.sakei和Lb.curvatus，成熟階段的優(yōu)勢乳酸菌為 Lb.sakei。Danilovi等［20］分析了傳統(tǒng) Petrovac香腸整個發(fā)酵過程的乳酸菌菌相演替情況，結果表明，E.caseliflavus在開始第2天占主要優(yōu)勢地位，從第2天至第 90天 Leu.mesenteroides、P.pentosaceus和Lb.sakei共存，并形成優(yōu)勢菌群。Greco等［21］分析意大利干發(fā)酵香腸的乳酸菌菌相，結果表明主要由Lb.sakei、Lb.plantarum 和 Lb.curvatus構成。Tran等研究發(fā)現(xiàn)，Lb.plantarum和P.pentosaceus是nem chua香腸成熟階段中的優(yōu)勢菌群，這兩種菌產(chǎn)酸和耐酸能力較強，隨著pH減低，代替了初始發(fā)酵時期的耐酸性較弱的異型發(fā)酵乳酸菌［22］。

1.4 開菲爾

開菲爾(Kefir)是源于高加索地區(qū)由多種微生物協(xié)同作用而成的復合型發(fā)酵乳，其中開菲爾粒(Kefir grains，KG)是富含天然乳酸菌、酵母和醋酸菌等微生物的共發(fā)酵體系。乳酸菌是KG的主體微生物類群，數(shù)量約為108～109CFU/g，主要包括 Lactococcus、Lactobacillus和 Leuconostoc。Simova 等［23］對保加利亞地區(qū)開菲爾粒中菌相研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌占總微生物的83% ～ 90%，主 要 為 Lc.lactis subsp.lactis、Streptococcus thermophilus、Lb.delbrueckii subsp.bulgaricus、Lb.helveticus、Lb.casei subsp.pseudoplantarum和Lb.brevis;酵母占10% ～17%，主要為 Kluyveromyces marxianus var.lactis、Saccharomyce cerevisiae、Candida inconspicua 和 Candida maris。Nalbantoglu等［24］分析了土耳其開菲爾粒的乳酸菌菌相構成，結果表明，Lactobacillus的數(shù)量最多，包括Lb.kefiranofaciens、 Lb.buchneri 和 Lb.helveticus。ZHOU等［25］對我國西藏開菲爾粒的細菌菌相分析，Leu.mesenteroides、 Lb.helveticus、 Lb.kefiranofaciens、Lc.lactis、Lb.kefiri和Lb.casei為優(yōu)勢菌種。

圖1是 Witthuhn等［26］分析傳統(tǒng) kefir發(fā)酵過程中微生物群落分布狀況，A、B、C分別為開菲爾發(fā)酵20、25和30 d時微生物菌群組成。從圖中可以看出，發(fā)酵20 d時 Leu.mesenteroides subsp.mesenteroides占26.9%，Lc.lactis subsp.lactis占32.4%，此外還含有40.4% 的 Zygosaccharomyces sp.。 到 25d 時，Lb.fermentum占80.5%，成為優(yōu)勢菌，還有15.3%的Lc.lactis subsp.lactis和少量的Cryptococcus humicolus(4.0%)。隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵 30 d時Lb.fermentum達到98.2%，占有絕對優(yōu)勢。Magalh?es等［27］將開菲爾粒接種于糖水中在25℃發(fā)酵24 h，發(fā)現(xiàn) Lb.paracasei、Lb.parabuchneri和 Lb.kefiri在一直存在于發(fā)酵過程，Lb.casei和Lc.lactis在發(fā)酵初期存在，分別在12 h和18 h后又被重新檢測到。Leu.citreum在發(fā)酵12 h后才發(fā)現(xiàn)，到24 h后檢測到Lb.paracasei subsp.tolerans和 Lb.buchneri。

圖1 傳統(tǒng)kefir發(fā)酵過程中微生物群落分布狀況Fig.1 The average distribution frequency of the microbial population of traditional kefir production

2 食品乳酸菌生態(tài)學研究方法

食品微生態(tài)學研究方法主要包括以培養(yǎng)和鑒定技術獲取特征微生物的傳統(tǒng)微生物學方法，以微生物細胞結構成分或代謝特征差異進行鑒別的非培養(yǎng)的生理生化方法，基于核酸為微生物信息載體的分子生物學技術和以微生物代謝產(chǎn)物為信息對象的現(xiàn)代分析技術等。

2.1 傳統(tǒng)微生物學方法

傳統(tǒng)微生物學方法依據(jù)乳酸菌的生物學特征應用選擇性培養(yǎng)基從傳統(tǒng)乳酸發(fā)酵食品中分離各種乳酸菌菌落，再經(jīng)過形態(tài)學和生理生化特征進行分類鑒定，獲取乳酸菌菌相信息。Drosinos等［28］用MRS培養(yǎng)基從發(fā)酵香腸中分離出288株乳酸菌，通過形態(tài)學和生理生化鑒定 255株為 Lactobacillus，15株 Leuconostoc，18株為 Lc.lactis subsp.lactis和 E.faecium。Iacumin等［29］利用平板法分析意大利北部酵頭中微生物菌相構成，結果發(fā)現(xiàn)乳酸菌數(shù)量在103～109CFU/g之間，酵母數(shù)量在102～107CFU/g范圍內(nèi)，乳酸菌顯著高于酵母為優(yōu)勢菌群。

2.2 磷脂脂肪酸(PLFA)/脂肪酸甲酯(FAME)分析法

PLFA/FAME分析法是基于細胞組分水平研究微生物的方法，以微生物細胞膜中磷脂中脂肪酸的結構多樣性和生物特異性為基礎，作為標記物揭示微生物的數(shù)量和菌群組成。目前應用于發(fā)酵食品的研究相對較少，Lee等［30］利用微生物鑒定系統(tǒng)構建了韓國泡菜中230株乳酸菌、8個種群的FAMEs指紋數(shù)據(jù)庫，并對79株Leuconostoc進行鑒定。

2.3 Biolog微平板分析法

Biolog微平板法是美國Biolog公司研發(fā)的自動化鑒定微生物群落的方法，基于微生物對碳源底物利用的差異性比較分析微生物的群落構成。Lee等［31］利用該方法分析韓國泡菜中乳酸菌的菌群構成，結果表明獲得的75菌株均為Leuconostoc。

2.4 分子生物學技術

分子生物學技術主要包括特異性片段測序及分析技術、遺傳指紋圖譜分析技術、宏基因組分析技術等。

特異性片段測序及分析技術是利用通用引物擴增特定基因片段后直接測序，主要是針對16S rRNA進行序列分析。Kim等［32］將樣品用磷酸緩沖溶液稀釋，通過渦流和聲波處理等步驟，直接提取樣品中的DNA，并通過16S rRNA基因序列分析泡菜中細菌群落結構，發(fā)現(xiàn) Lactobacillus、Leuconostoc和 Weissella等乳酸菌為優(yōu)勢菌群。

遺傳指紋圖譜分析技術是采用凝膠電泳等方法對代表微生物群落結構的核酸分子進行分離，依據(jù)其遷移的差異構建遺傳指紋圖譜。經(jīng)PCR對特定基因片段擴增后，分析樣品中微生物的菌相構成，如變性梯度凝膠電泳技術(PCR-DGGE)、基因組重復序列PCR技術(rep-PCR)、隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)技術和脈沖場凝膠電泳(PFGE)技術等。ZHANG等［33］應用PCR-DGGE技術分析內(nèi)蒙古西部酵頭中乳酸菌群落構成，通過條帶比對，發(fā)現(xiàn)Lb.plantarum和 Lb.sanfranciscensis為優(yōu)勢菌群。Tran等［22］利用rep-PCR和PFGE技術獲取發(fā)酵香腸中乳酸菌的分子指紋圖譜，乳酸菌構成分別為 Lb.plantarum(67.6%)、 P.pentosaceus (21.6%)、 Lb.brevis(9.5%)和 Lb.farciminis(1.4%)。Urso等［17］從意大利3種發(fā)酵香腸分離的乳酸菌中提取100 ng DNA，經(jīng)過RAPD-PCR分析，Lb.curvatus和Lb.sakei是這些香腸中共同菌株。

宏基因組分析技術選擇性提取環(huán)境中樣品的總DNA/RNA，通過構建宏基因組文庫進行高通量測序分析或篩選新的活性物質。Jeong等［34］使用DNA快速抽提盒提取樣品中的DNA，經(jīng)過16S rRNA序列擴增，通過焦磷酸測序技術分析泡菜中的微生物群落，結果發(fā)現(xiàn)加入紅辣椒粉的泡菜在發(fā)酵初期生物多樣性比未加紅辣椒粉的減少速度緩慢。Leite等［35］通過PCR-DGGE技術和焦磷酸測序技術分析巴西不同地區(qū)的3種開菲爾粒的微生物多樣性和群落結構，結果表明 Lb.kefiranofaciens和 Lb.kefiri為優(yōu)勢菌群。Jung等［36］在泡菜發(fā)酵期間，通過熱酚法提取泡菜中的全部RNA并分離出mRNA，采用Illumina高通量得到泡菜發(fā)酵期間的轉錄文本，結果發(fā)現(xiàn) Leu.mesenteroides在早期發(fā)酵時期最為活躍，而Lb.sakei和W.koreensis在后發(fā)酵時期數(shù)量較多。

2.5 基于代謝產(chǎn)物的現(xiàn)代分析技術

代謝產(chǎn)物可間接反映食品中微生物的分布與演替情況，通過代謝產(chǎn)物分析獲取微生物種類及數(shù)量的相關信息。通常以色譜技術分離食品中微生物的代謝產(chǎn)物，以質譜和核磁共振等技術進行產(chǎn)物鑒定，實際工作中多采用分離與鑒定聯(lián)用技術。Weckx等［16］應用GC-MS和HPLC-MS分析4種黑麥酵頭發(fā)酵過程中糖類、氨基酸及其相關代謝產(chǎn)物變化情況，來推測發(fā)酵微生物的演變過程。Jeong等［8］通過核磁共振技術分析韓國水泡菜中的游離糖變化，發(fā)現(xiàn)隨著游離糖的快速消耗，丙三醇和乙醇等產(chǎn)物迅速增加，以此判斷泡菜的質量和產(chǎn)品成熟期。

由于食品中存在大量活的不可培養(yǎng)的微生物，傳統(tǒng)微生物學方法不能獲取全面真實微生物信息，非培養(yǎng)的生理生化方法受環(huán)境的影響，準確率有待于提高。因此，目前分子生物學技術是全面獲取食品微生態(tài)學研究的主要手段。在食品微生態(tài)學研究中，應在傳統(tǒng)微生物學和現(xiàn)代分子生物學獲取微生物菌群信息的基礎上，結合現(xiàn)代分析技術分析微生物的代謝產(chǎn)物獲取微生物及其代謝產(chǎn)物的全面信息。

3 展望

微生態(tài)學是一門新的學科主要用于土壤、海洋環(huán)境及人類和動物腸道中微生物多樣性分析，用于傳統(tǒng)發(fā)酵食品處于起步階段，已用于傳統(tǒng)韓國泡菜、歐洲酵頭和發(fā)酵香腸、開菲爾等食品。研究方法從傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)技術、化學成分分析方法到應用現(xiàn)代分子生物學技術和基于代謝組學的分析技術。本文以乳酸菌為主線分析傳統(tǒng)發(fā)酵食品中乳酸菌菌群的發(fā)生、發(fā)展與演替過程，闡明傳統(tǒng)乳酸發(fā)酵食品乳酸菌與原料之間、乳酸菌與他種微生物之間、乳酸菌菌群之間的相互作用關系，旨在探究發(fā)酵過程乳酸菌與產(chǎn)品品質形成的內(nèi)在聯(lián)系，為提高我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品的研究水平，提升應用現(xiàn)代技術對傳統(tǒng)發(fā)酵食品的改造水平，達到縮短發(fā)酵周期、提高產(chǎn)品品質和經(jīng)濟效益的目的。

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