牛燦杰，陳小珍，張慧，王展華，馬千里，徐生堅(jiān)

1(浙江省質(zhì)量檢測科學(xué)研究院，浙江杭州，310013)2(浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué) 工程學(xué)院，浙江 杭州，310014)

隨著人們生活水平的提高，果汁飲料需求量及消費(fèi)量逐年增長。然而國際市場上60%～80%的果汁易存在摻假，究其原因是利益驅(qū)使及檢測技術(shù)的落后。目前，研究報(bào)道的果汁鑒別檢測方法多以糖類［1］、有機(jī)酸［2］、黃酮類［3］、氨基酸［4］、無機(jī)元素［5］等物質(zhì)為研究對象，這些物質(zhì)具有價(jià)廉易被添加、不能體現(xiàn)果汁整體性質(zhì)且易受產(chǎn)地影響等缺點(diǎn)。已有研究［6-8］表明，果汁中的可溶性蛋白質(zhì)具有穩(wěn)定不易受工業(yè)流程影響、無經(jīng)濟(jì)利益不易被添加等特點(diǎn)，有望用于果汁摻假鑒別。由于果汁體系復(fù)雜，具有完整性、穩(wěn)定性優(yōu)勢的特征指紋圖譜成為果汁質(zhì)量控制的研究方向［9-11］。

我國現(xiàn)有的用于橙汁檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法為GB/T 12143-2008《飲料通用分析方法》，然該方法需測定6項(xiàng)指標(biāo)并經(jīng)過復(fù)雜的計(jì)算，且主要用于橙汁含量的定量檢測，關(guān)于橙汁摻假快速鑒別方法的研究仍然缺乏。

本文以橙汁中的的可溶性蛋白質(zhì)為研究對象，采用凝膠色譜柱分離柱后復(fù)合考馬斯亮藍(lán)染色法，分離橙汁中分子質(zhì)量大于1 000Da的蛋白質(zhì)，實(shí)現(xiàn)橙汁蛋白質(zhì)按分子量分布的連續(xù)檢測，建立橙汁中可溶性蛋白質(zhì)的特征指紋圖譜，可用于鑒別橙汁真?zhèn)?。該方法簡單、快速、干擾小。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

橙汁主產(chǎn)區(qū)［12］的純正濃縮果汁，江西濃縮橙汁(64.9Brix)，四川濃縮橙汁(64.9Brix)，均儲存于-18℃;市場上隨機(jī)抽取的不同產(chǎn)地橙汁飲料(果汁標(biāo)簽上均有注明橙汁含量≥10%)12種，均儲存于-4℃;橙子鮮榨汁，葡萄鮮榨汁，西瓜鮮榨汁、橘子鮮榨汁均由水果經(jīng)榨汁機(jī)榨汁后用濾紙過濾，儲存于-4℃。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

1.2.1 檢測儀器

浙江省質(zhì)量檢測科學(xué)研究院和杭州新材料科技有限公司聯(lián)合研制的果汁蛋白質(zhì)檢測儀。

1.2.2 儀器原理

果汁蛋白質(zhì)檢測儀的原理是蛋白質(zhì)經(jīng)凝膠過濾色譜柱分離后，按分子質(zhì)量依次流經(jīng)混合器，與考馬斯亮藍(lán)染色劑染色形成蛋白質(zhì) 色素絡(luò)合物，該物質(zhì)在595nm具有最大吸收，經(jīng)光譜檢測儀檢測，將所得吸光度值轉(zhuǎn)換為電壓信號傳送到計(jì)算機(jī)(見圖1)。

圖1 果汁蛋白質(zhì)快速檢測儀器結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 The structure diagram of the detecting instrument

1.2.3 色譜工作站及蛋白質(zhì)分子量標(biāo)尺

果汁蛋白質(zhì)特征圖譜通過配備的色譜工作站獲得，除采用保留時間定性外，色譜工作站中含有蛋白質(zhì)標(biāo)尺(采用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)定標(biāo)獲得)輔助定性。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 100%橙汁樣品的制備

將可溶性固性物為64.9 Brix的高倍濃縮橙汁，稀釋還原為11.6 Brix的標(biāo)準(zhǔn)濃縮還原汁，以此作為標(biāo)樣，標(biāo)樣制備過程中只加入果汁濃縮時失去的天然水分等量的水。

橙子鮮榨汁經(jīng)濾紙過濾濾去果渣，余下橙汁備用。

1.3.2 果汁含量和總氮含量的測定

橙汁原果汁含量按照GB/T 12143-2008《飲料通用分析方法》進(jìn)行檢測;橙汁中蛋白質(zhì)含量按照GB 5009.5-2010《食品中蛋白質(zhì)的測定:第一法——微量凱式定氮法測定粗蛋白含量》進(jìn)行測定。

1.3.3 樣品處理與檢測

果汁用定量濾紙過濾并經(jīng)超聲儀脫氣后，取5mL樣液用手動進(jìn)樣器進(jìn)樣，果汁蛋白質(zhì)檢測儀進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品果汁含量和總氮含量的測定

不同產(chǎn)地樣品的果汁含量和總氮含量的結(jié)果見表1，其中，編號為“12”的樣品未檢測出果汁含量。

表1 不同產(chǎn)區(qū)果汁含量及全氮含量Table 1 Content and total nitrogen content of juice in different regions

2.2 濃縮還原橙汁標(biāo)準(zhǔn)樣品蛋白質(zhì)指紋圖譜

橙汁標(biāo)準(zhǔn)樣品A、B、C的蛋白質(zhì)指紋圖譜見圖2。

圖2 橙汁標(biāo)準(zhǔn)樣品圖譜Fig.2 The spectrometry of standard samples

圖譜具有4個特征峰，分別標(biāo)記為第“1”、“2”、“3”、“4”峰，“1”峰的出峰時間為 20 ～50min，分子質(zhì)量約為7.5 ×104Da，其余3 個峰(“2”、“3”、“4”峰)的出峰時間位于70～100min，分子質(zhì)量約為0.5×104～1.0×104Da。

不同產(chǎn)區(qū)的標(biāo)準(zhǔn)樣品“1”峰的出峰時間及對應(yīng)分子質(zhì)量基本相似，而分子質(zhì)量位于0.5×104～1.0×104Da的“2”、“3”、“4”峰，出峰時間及蛋白質(zhì)分子質(zhì)量具有極小差別，可能是由于地區(qū)差異及果汁制作技術(shù)(實(shí)驗(yàn)室配制與工業(yè)工藝流程的差異)的影響引起的，但整體上，鮮榨汁與2個不同地區(qū)的濃縮還原橙汁的蛋白質(zhì)指紋圖譜，具有很高的相似性。

2.3 國內(nèi)不同產(chǎn)地的商品橙汁飲料蛋白質(zhì)指紋圖譜

國內(nèi)不同產(chǎn)地的商品橙汁飲料蛋白質(zhì)指紋圖譜見圖3。

圖 3 中“1#”、“2#”、“3#”、“4#”、“5#”分別是編號為1、2、3、4、5的商品橙汁飲料(樣品信息見表1)，由于編號為7、8、11的樣品與編號為5的樣品圖譜非常接近，編號為6、9的樣品圖譜與編號為2的樣品圖譜非常接近，樣品10與樣品4非常接近，因此省略。

圖3顯示，國內(nèi)不同產(chǎn)地的商品橙汁飲料蛋白質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)樣品的譜圖(圖2)規(guī)律相同，且圖3中“2”、“3”、“4”峰的出峰時間及分子量分布基本一致。

同時，商品樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品圖譜規(guī)律相同，表明果汁中的添加劑并不干擾蛋白質(zhì)指紋圖譜，這是由于考馬斯亮藍(lán)染色法不受脂肪、多糖、維生素、游離氨基酸和酚類物質(zhì)的干擾［12-13］。而橙汁中其他常見添加物，如甜味劑(葡萄糖、蔗糖等)、有機(jī)酸(如蘋果酸、檸檬酸等)，具有分子質(zhì)量小且595nm無吸收的特點(diǎn)，經(jīng)凝膠過濾色譜柱分離后不干擾特征峰的檢測。因此，橙汁飲料中蛋白質(zhì)按分子量分布的特征指紋圖譜抗干擾能力強(qiáng)、穩(wěn)定性好。

圖3 國內(nèi)不同橙汁產(chǎn)區(qū)濃縮還原商品橙汁飲料樣品(樣品1～11)圖譜Fig.3 The spectrometry of samples from different regions in China

圖4 陽性樣品的圖譜Fig.4 The spectrometry of positive samples

2.4 陽性樣品的圖譜

陽性樣品的圖譜如圖4所示，圖4中“a”、“b”、“c”、“d”分別為編號為“12”的陽性樣品(樣品信息見表1)、西瓜鮮榨汁、葡萄鮮榨汁、橘子鮮榨汁的圖譜。

由圖4中的“a”可得不含橙汁的的樣品，沒有橙汁蛋白質(zhì)的特征譜圖;由圖“b”，“c”，“d”，可得橙汁蛋白質(zhì)的指紋圖譜與其他果汁指紋圖譜不同，具有特征性。因此該方法可有效快速的檢測不含橙汁或橙汁含量很低的勾兌飲料，及以其他果汁(如橘汁、葡萄汁等)冒充橙汁的摻假行為。

3 小結(jié)

本研究采用凝膠過濾色譜分離柱后復(fù)合考馬斯亮藍(lán)染色法，建立了橙汁中蛋白質(zhì)按分子質(zhì)量分布的的特征指紋圖譜，并對橙汁摻假鑒別進(jìn)行了初探。凝膠過濾色譜的分子篩作用可將不同分子質(zhì)量的物質(zhì)依次分離，避免了常見的小分子添加物，如糖類(葡萄糖、蔗糖、果糖)、有機(jī)酸(檸檬酸、蘋果酸)的干擾;復(fù)合考馬斯亮藍(lán)染色劑的特異性避免了酚類物質(zhì)及游離氨基酸等物質(zhì)的干擾，方法簡單、快速，抗干擾能力強(qiáng)，可用于檢測不含橙汁的勾兌果汁，以及用其他果汁(如橘汁、葡萄汁等)冒充橙汁的摻假行為。但是由于目前收集的果汁樣品數(shù)量有限，仍需擴(kuò)大樣品檢測范圍，對方法進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

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