劉壯，冮潔，涂茂林，謝彬，胡文忠，張平

1(大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連，116600)2(遼寧五女山米蘭酒業(yè)有限公司，遼寧 本溪，117201)

冰葡萄酒是以自然條件下冰凍的葡萄為原料，在結(jié)冰狀態(tài)下壓榨，低溫發(fā)酵，釀制而成的甜葡萄酒。由于其獨特濃郁的甜香、醇厚風味，加上繁復(fù)、嚴謹、漫長的釀造過程使其身價倍增，因而被譽為“液體黃金”［1］。冰葡萄酒是冰葡萄汁經(jīng)低溫發(fā)酵而成的，由于冰凍的葡萄中的水分一部分蒸發(fā)，一部分結(jié)冰。因此，冰葡萄汁的糖、酸得到濃縮，使冰葡萄汁具有很高的滲透壓和黏度，這要求發(fā)酵冰葡萄酒的酵母菌要具有很強的耐受性。目前我國冰葡萄酒發(fā)酵主要采用的是進口的釀酒酵母，如德國的W15，法國的K1、RHST、KD、DV10、EC1118 等［2］。我國自主品牌的冰葡萄酒發(fā)酵酵母很少。黃英子對甘肅祁連酒莊冰酒主栽品種(美樂、貴人香)自然發(fā)酵和接種發(fā)酵過程中采集到的酵母菌株進行歸類鑒定，美樂冰紅中共分離到6屬6種酵母菌:釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、戴爾有孢圓酵母(Torulaspora delbrueckii)、耐熱克魯維酵母(Lachancea thermotolerans)、葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniaspora uvarum)、核果梅奇酵母(Metschnikowia aff.fructicola)和亞膜漢遜酵母(Pichia subpelliculosa)，貴人香冰白中共分離到6屬8種:釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)、戴爾有孢圓酵母(Torulaspora delbrueckii)、葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniaspora uvarum)、耐熱克魯維酵母(Lachancea thermotolerans)、核果梅奇酵母(Metschnikowia aff.fructicola)、嗜高壓有孢漢生酵母(Hanseniaspora osmophila)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)［3］。趙新節(jié)在云南德欽產(chǎn)區(qū)的赤霞珠冰葡萄自然發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)5種酵母菌，分別為 Cryptococcus flavescens、Cryptococcus amylolentus、Hyphopichiapseudoburtonii、Hanseniasporauvarum、Saccharomyces cerevisiae［4］。本文主要對 1株從遼寧本溪種植的威代爾冰葡萄汁中分離獲得的冰葡萄酒發(fā)酵性能優(yōu)良的酵母菌進行鑒定和耐性研究，為豐富冰葡萄酒發(fā)酵酵母菌的種類，利用本土優(yōu)良酵母資源發(fā)酵冰葡萄酒提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與器材

冰葡萄汁，遼寧本溪五女山米蘭酒業(yè)提供的威代爾冰葡萄汁。

YEPD培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20.0，蛋白胨20.0，氯霉素0.2，瓊脂40.0，酵母膏10.0;

WL培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖50.0，胰蛋白胨5.0，酵母粉 5.0，KH2PO40.55，KCl 0.425，CaCl20.125，MgSO40.125，MnSO40.002 5，F(xiàn)eCl30.002 5，溴甲酚綠0.022，瓊脂17.0;

葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、溴甲酚綠、KH2PO4、FeCl3、MnSO4、MgSO4、CaCl2試劑均購自上海晶純生化科技股份有限公司。

BS 223S電子精密天平，賽多里斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;ZHJH-C2112B無菌操作臺，上海智城分析儀器制造有限公司;UV-2000紫外可見分光光度計，UNICO;HNY-100B恒溫培養(yǎng)振蕩器，天津市歐諾儀器儀表有限公司;H2050R臺高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酵母菌的分離純化

冰葡萄汁進行10倍梯度稀釋后取0.1 mL涂布于YEPD平板培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)3 d，得到單菌落，分別挑取不同形態(tài)的單菌落再次劃線接種于YEPD培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)培養(yǎng)3 d，將得到的酵母菌單菌落接種于YEPD培養(yǎng)基斜面，28℃恒溫3 d，然后放于 -4 ℃冰箱中保存［5］。

1.2.2 酵母菌的形態(tài)觀察

(1)菌落特征觀察:將分離純化得到的酵母菌平板劃線接種于WL鑒別培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)5 d，觀察培養(yǎng)基中菌落的特征［6-7］。

(2)細胞形態(tài)觀察:挑取純化得到的酵母菌，用1%呂氏美藍染色劑染色，分別制片，在顯微鏡下觀察酵母菌的形態(tài)［8］。

1.2.3 生理生化實驗

1.2.3.1 葡萄糖發(fā)酵實驗:參照文獻［9-10］進行。

1.2.3.2 KNO3同化實驗:參照文獻［11-12］進行。

1.2.3.3 尿素分解實驗:參照文獻［10-12］進行。

1.2.3.4 肌醇同化實驗:參照文獻［12］進行。

1.2.4 酵母菌的分子鑒定

酵母菌的分子鑒定的方法采用26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析。將保存的菌種委托寶生物公司進行測序，將測序結(jié)果輸入 www.NCBI.nlm.nih.gov，利用BLAST軟件，將測得的基因序列與Genbank數(shù)據(jù)庫的序列進行同源性比較。結(jié)合形態(tài)學(xué)等特性確定酵母菌種屬［13-14］。

1.2.5 酵母菌的耐性試驗

酵母菌液的制備:挑取試管保存的酵母菌于裝有100 mL富集培養(yǎng)基的三角瓶中，28℃搖床(130 r/min)培養(yǎng)48 h，再將此酵母液稀釋到1 L，得到酵母菌活化液，酵母菌濃度達到2×107個/mL，于 -4℃保存待用。酵母菌菌體濃度用血球計數(shù)板測定［15］。

耐糖能力實驗:取滅菌后的10 mL試管，加入9.0 mL 的蔗糖質(zhì)量濃度分別為 200、250、300、350、400、450g/L的液體培養(yǎng)基，再加入1.0 mL酵母菌液，于28℃搖床(130 r/min)培養(yǎng)24 h。測定600 nm下菌液的OD值，從而確定酵母菌對糖的耐受情況［15-16］。

耐SO2能力實驗:取滅菌后的10 mL試管，加入9.0 mL 質(zhì)量濃度分別為 60、120、180、240、360、420 mg/L的SO2液體培養(yǎng)基，再加入1.0 mL冰葡萄酵母活化液，28℃搖床(130 r/min)培養(yǎng)24 h。測定600 nm下菌液的OD值，從而確定酵母菌對SO2的耐受情況［15，17］。

耐乙醇能力實驗:取滅菌后的10 mL試管，加入9.0 mLC2H5OH 濃度分別為 70、90、110、130、150、180 mL/L的液體培養(yǎng)基，再加入1.0 mL冰葡萄酵母活化液28℃搖床(130 r/min)培養(yǎng)24 h。測定600 nm下菌液的OD值，從而確定酵母菌對乙醇的耐受情況［15-16］。

耐酸能力實驗:取滅菌后的10 mL試管，分別加入9.0 mL的液體培養(yǎng)基，使 pH分別為:2.4、2.8、3.2、3.4、3.8，再加入1.0 mL 冰葡萄酵母活化液，于28℃搖床(130 r/min)培養(yǎng)24 h。測定600 nm下菌液的 OD值，從而確定酵母菌對 pH的耐受情況［15-16］。

2 結(jié)果與討論

2.1 酵母菌的分離純化結(jié)果

采用1.2.1酵母菌的分離純化方法從威代爾冰葡萄汁中共分離到60株酵母菌，對這60株酵母菌進行了形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)鑒定，獲得德巴利酵母(Debaryomyces)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniaspora uvarum)等菌株。由于首次在冰葡萄汁中分離獲得德巴利酵母。因此，對其形態(tài)特征、生理生化特性和耐受性進行了詳細的研究。

2.2 WL培養(yǎng)基菌落形態(tài)觀察結(jié)果

將分離純化得到的德巴利酵母接種于WL鑒別培養(yǎng)基上進行形態(tài)聚類，德巴利酵母在WL培養(yǎng)基上呈現(xiàn)一種形態(tài)，如圖1所示，表現(xiàn)為:中央淡綠色，周圍白色，略凸起，表面干燥，邊緣整齊。

2.3 德巴利酵母細胞形態(tài)觀察結(jié)果

通過顯微鏡對德巴利酵母菌體形態(tài)進行觀察，結(jié)果如圖2所示。德巴利酵母細胞為橢圓形，平均大小為 4.5 μm ×5.4 μm，呈出芽繁殖。

2.4 生理生化實驗結(jié)果

2.4.1 葡萄糖發(fā)酵實驗

以葡萄糖為碳源的酵母菌，能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸通過三羧酸循環(huán)等復(fù)雜代謝途徑形成酸性代謝產(chǎn)物使溴甲酚紫指示劑變?yōu)辄S色。如果代謝過程伴有產(chǎn)氣，則在指示劑變黃的同時小杜氏管中有氣泡出現(xiàn)［9-10］。實驗結(jié)果如表1所示，從第2天開始，培養(yǎng)基的顏色從紫色漸漸變?yōu)辄S色，第4天時顏色基本為黃色，之后顏色保持不變。在這7天中始終無產(chǎn)氣現(xiàn)象。說明德巴利酵母能發(fā)酵葡萄糖形成酸性代謝產(chǎn)物，但代謝過程不產(chǎn)生氣體。

圖1 德巴利酵母WL培養(yǎng)基鑒別結(jié)果Fig.1 The result of Debaryomyces identification on WL medium

圖2 德巴利酵母顯微鏡觀察結(jié)果(×1000)Fig.2 The result of Debaryomyces observation by the microscope

表1 德巴利酵母葡萄糖發(fā)酵實驗結(jié)果Table 1 The results of Debaryomyces glucose fermentation experiment

2.4.2 KNO3同化實驗

德巴利酵母在不含氮源但添加了KNO3的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d后，培養(yǎng)基變渾濁，說明該德巴利酵母的生長情況良好。同時觀察到德巴利酵母在培養(yǎng)液中并未形成菌膜或菌環(huán)。

2.4.3 尿素分解實驗

有些酵母菌能產(chǎn)生脲酶，可分解尿素形成大量的氨，使得培養(yǎng)基 pH升高，使酚紅指示劑顯紅色［10-12］。

分離純化的德巴利酵母在尿素分解培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)基始終未變紅，說明該酵母菌不能產(chǎn)生脲酶。

2.4.4 肌醇同化實驗

分離純化的德巴利酵母接種入肌醇同化培養(yǎng)基，培養(yǎng)7 d后，觀察到培養(yǎng)基未變渾濁，說明該酵母菌的生長情況較差，不能利用肌醇作為碳源，同時觀察到培養(yǎng)液中沒有形成菌膜或菌環(huán)。

2.5 德巴利酵母的分子鑒定

對酵母菌的26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析，如圖3所示，分離到的酵母菌的PCR產(chǎn)物長度為557 bp。電泳圖中的陽性對照是試劑盒中的Control DNA的PCR擴增產(chǎn)物，條帶清晰，大小正確，說明所使用擴增體系正確，陰性對照是試劑盒中的dH2O的PCR擴增產(chǎn)物，說明擴增的過程中不存在DNA污染。

圖3 德巴利酵母26S rDNA D1/D2區(qū)PCR產(chǎn)物電泳圖譜Fig.3 The PCR electrophoretogram of Debaryomyces 26S rDNA D1/D2 region

將測序結(jié)果輸入 www.NCBI.nlm.nih.gov，利用BLAST軟件，將測得的基因序列與 Genbank數(shù)據(jù)庫的序列進行同源性比較。序列NCBI BLAST比對結(jié)果見表2。

在表2中，匹配分值與總體分值為比對得分，分值越高，兩個序列相似性越高。隨機匹配可能性越小，可信度越高，它的值接近零或為零時，代表完全匹配。由表2可以看出分離得到的酵母菌與各株漢遜德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)的同源性均達到100%，結(jié)果表明分離得到的酵母菌屬于德巴利酵母屬。德巴利酵母能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)D-阿拉伯糖醇顯著改善酒精飲品的品質(zhì)［18］。也可以在受傷的柑橘表面快速繁殖，對柑橘保護酶的誘導(dǎo)有積極作用，抵御病蟲害［19］。還用于生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)飼料用菌體蛋白［20］。

表2 德巴利酵母的序列比對分析結(jié)果Table 2 The results of Debaryomyces sequence comparison and analysis

2.6 酵母菌的耐受性實驗結(jié)果

2.6.1 德巴利酵母對糖的耐受情況

冰葡萄汁具有含糖量高的特點，通常其含量為350～420 g/L。因此優(yōu)良的冰酒酵母菌必須具有良好的耐糖性。該株德巴利酵母對糖的耐受性如圖4所示。含糖量為250 g/L時最適宜其生長，在含糖量為450 g/L時仍具有較高生長量，菌體濃度為2.1×107個/mL，說明其耐糖性能較好，可作為冰酒釀造的菌種。

圖4 德巴利酵母對糖的耐受結(jié)果Fig.4 The results of Debaryomyces glucosetolerance experiment

2.6.2 德巴利酵母對SO2的耐受情況

冰酒的釀造過程中會添加一定量的SO2，因此酵母菌對SO2的耐受情況也應(yīng)作為篩選酵母菌的指標。由圖5可得出結(jié)論:該株德巴利酵母的生長量隨SO2濃度的升高而降低，但當SO2的濃度達到420 mg/L時，菌體濃度仍可達到1×107個/mL，表現(xiàn)出了對SO2良好的耐受性。

圖5 德巴利酵母對SO2的耐受結(jié)果Fig.5 The results of Debaryomyces sulfur dioxide tolerance experiment

2.6.3 德巴利酵母對乙醇的耐受情況

成品冰酒的酒精度一般為11o，性狀優(yōu)良的酵母菌必須具備能耐高酒精度特點。由圖6可知:該株德巴利酵母對乙醇有一定的耐受性，乙醇含量達到18%時，OD600nm為0.031，菌體濃度為 4 ×106個/mL，表現(xiàn)出對乙醇具有較好的耐受性，可用于冰酒釀造過程中。

2.6.4 德巴利酵母對酸的耐受情況

冰葡萄汁的pH一般為3.3左右，因而優(yōu)良的酵母菌種應(yīng)具備耐酸的能力。由圖7酵母菌對pH的耐受結(jié)果可以看出:該株德巴利酵母在pH為3.2時生長量為最大，菌體濃度達到1.5×107個/mL，表明具有較好的酸耐受性，可在冰酒釀造過程中使用。

圖6 德巴利酵母對乙醇的耐受結(jié)果Fig.6 The results of Debaryomyces alcohol tolerance experiment

圖7 德巴利酵母對pH的耐受結(jié)果Fig.7 The results of Debaryomyces acid tolerance experiment

3 結(jié)論

本研究從遼寧本溪地區(qū)的威代爾冰葡萄汁中共分離獲得60株酵母菌，對這60株酵母菌進行了形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)鑒定，鑒定出德巴利酵母(Debaryomyces)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniaspora uvarum)等菌株，說明遼寧本溪地區(qū)冰葡萄上的酵母菌具有較好的多樣性。為研究本土葡萄釀酒微生物資源的生物多樣性，分離收集優(yōu)質(zhì)葡萄酒產(chǎn)區(qū)酵母菌株提供參考。

本研究首次在冰葡萄汁中分離獲得德巴利酵母菌，通過德巴利酵母的耐受性實驗結(jié)果可以看出:該株德巴利酵母對糖、SO2、乙醇和酸均有較強的耐受性。在含糖量450 g/L、SO2濃度420 mg/L、乙醇含量18%、pH 3.8時，仍可保持106個/mL以上的生物量，說明分離獲得的該株德巴利酵母適合應(yīng)用在冰葡萄酒的釀造中。雖然德巴利酵母能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)D-阿拉伯糖醇顯著改善酒精飲品的品質(zhì)［18］，但還未應(yīng)用到冰酒釀造過程中。在未來研究中，可作為增香菌株，與釀酒酵母共同發(fā)酵，為生產(chǎn)出更具地方特色，風格獨特的冰葡萄酒奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

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