鄭愛泉， 張寶林

(1.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，陜西楊凌712100;2.貴州省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗測試中心，貴州貴陽 550000)

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DNA分子標(biāo)記技術(shù)及其在小麥遺傳多樣性研究中的應(yīng)用

鄭愛泉1， 張寶林2

(1.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，陜西楊凌712100;2.貴州省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗測試中心，貴州貴陽 550000)

研究小麥遺傳多樣性對其遺傳育種、種質(zhì)資源保護、開發(fā)及利用均具有重要的意義。概述了幾種主要小麥遺傳多樣性研究的DNA分子標(biāo)記，如RFLP、RAPD、AFLP、SSR和SRAP等技術(shù)的基本原理、特點及其優(yōu)缺點等，進而探討了這些分子標(biāo)記技術(shù)在小麥遺傳多樣性研究中的作用和意義，為拓寬小麥遺傳基礎(chǔ)、提高小麥遺傳變異育種提供理論基礎(chǔ)。

分子標(biāo)記技術(shù)；小麥；遺傳多樣性

遺傳多樣性是物種內(nèi)不同群體或群體內(nèi)不同個體間遺傳變異的總和，是生物多樣性的基礎(chǔ)和核心，決定著生物多樣性的形成和發(fā)展。造成遺傳多樣性的根源是其遺傳物質(zhì)的改變，即遺傳變異越大，其遺傳多樣性越豐富。遺傳多樣性是進行小麥遺傳育種改良的基礎(chǔ)。遺傳多樣性的研究，無論是對于小麥種質(zhì)資源的搜集與保持，還是對于資源評價和利用、物種的演化過程研究及遺傳資源核心種質(zhì)的建立均具有重要意義[1-2]。遺傳多樣性的評價是小麥育種研究的重要內(nèi)容，它決定著小麥種質(zhì)在今后遺傳育種工作實踐中的有效利用。

小麥屬于禾本科小麥屬(TriticumL.)，是世界上種植面積最大、總產(chǎn)量最多的糧食作物之一[1]。小麥屬中有20多個種，常見的多為普通小麥(T.aestiuumL.)，占小麥種植總面積的90%以上；硬粒小麥(T.durumL.)，占種植總面積的8%左右；圓錐小麥(T.trugidumL.)、密穗小麥(T.compaecumL.)和斯卑爾脫小麥(T.speltaL.)等[3]。由于小麥種植生態(tài)區(qū)的環(huán)境氣候差異及其長期的自然選擇作用等，使得不同小麥種間存在明顯的不同，特別是在小麥的野生近緣植物中表現(xiàn)出豐富的特異性遺傳性狀。然而，該特點不僅是改良小麥栽培、培育優(yōu)良品種的重要原始材料，也是進行小麥遺傳多樣性研究的重要素材。目前，隨著不同研究學(xué)科間的交叉和融合，研究小麥種群遺傳學(xué)的方法也在不斷發(fā)展和完善。先后經(jīng)歷了形態(tài)標(biāo)記、細胞標(biāo)記、生化標(biāo)記和DNA分子標(biāo)記等階段[4]。但DNA分子標(biāo)記方法不僅能夠適應(yīng)于不同發(fā)育時期的個體、任何的組織器官甚至可以利用細胞做檢查；此外，DNA分子標(biāo)記不受環(huán)境條件的影響和其基因表達與否的限制。因此，DNA分子標(biāo)記被普遍認為是研究生物遺傳差異的理想手段[5-6]。

1 DNA分子標(biāo)記及其特點

分子標(biāo)記是指可遺傳的并可有效檢測種群內(nèi)或種群間遺傳分化及遺傳多樣性程度的DNA序列或蛋白；狹義上，分子標(biāo)記是指能反映生物個體或種群基因組中某種差異的特異性DNA片段。最早的分子標(biāo)記是以淀粉凝膠電泳技術(shù)為基礎(chǔ)的等位酶電泳。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)先后經(jīng)歷了3個大的發(fā)展階段，分別為以Southern雜交為基礎(chǔ)的RFLP標(biāo)記；以鏈?zhǔn)骄酆厦甘椒磻?yīng)為基礎(chǔ)的RAPD、SSR、AFLP標(biāo)記和DNA 測序等及以基因組序列為基礎(chǔ)的SNP標(biāo)記等[7-8]。每一種分子標(biāo)記都有其自身的優(yōu)點及其適用范圍。理想的分子標(biāo)記應(yīng)該具備以下幾個優(yōu)點：①遺傳多態(tài)性高，信息量大及遺傳差異分辨率高；②共顯性遺傳，信息完整，可以有效地區(qū)分雜合體和純合體，對隱性性狀的選擇十分方便；③在基因組中大量存在且分布均勻；④開發(fā)使用成本低，試驗操作簡便，易于實現(xiàn)自動化；⑤樣品組織或DNA模板用量少，且樣品質(zhì)量要求相對不高；⑥選擇中性，無表型效應(yīng)，不受環(huán)境限制和影響。目前，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，DNA分子標(biāo)記技術(shù)種類至今多達幾十種。

2 分子標(biāo)記技術(shù)概述

2.1 限制性片斷長度多態(tài)性標(biāo)記技術(shù)(RFLP) RFLP是20世紀(jì)80年代研究生物遺傳多態(tài)性的方法[9]。RFLP具有共顯性、更高的多態(tài)性、高度的穩(wěn)定性、重顯性和適應(yīng)范圍廣等優(yōu)點。但在進行RFLP分析時需要使用放射性同位素及其核酸雜交技術(shù)，其操作過程比較繁瑣，不安全且不宜自動化操作。Siedler 等[10]利用RFLP分子標(biāo)記技術(shù)分析了不同小麥品種間的遺傳多樣性及其遺傳變異情況。2001年，賈繼增等[11]利用473個RFLP探針分析來自不同國家小麥品種間的遺傳多樣性差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)普通小麥品種間的遺傳多樣性明顯低于其他作物的遺傳多樣性，說明普通小麥的遺傳基礎(chǔ)更為狹窄，且B基因組的遺傳多樣性較高，而D基因組的遺傳多樣性較差。

2.2 隨機擴增片段長度多態(tài)性標(biāo)記技術(shù)(RAPD) RAPD是1990年由Williams所領(lǐng)導(dǎo)的研究小組和Welsh、MeClelland等2位科學(xué)家同時提出的一項基于PCR的分子標(biāo)記技術(shù)。RAPD技術(shù)的優(yōu)點是可以對物種在沒有任何分子生物學(xué)研究的情況下，對物種基因組進行DNA片段的多態(tài)性分析；可以運用上百種引物對整個基因組進行多態(tài)性分析；RAPD的隨機引物數(shù)量大，可無限合成，且一套引物可以用于任何物種基因組中，省時省力，經(jīng)濟易行。1993年，Joshi等[12]利用RAPD標(biāo)記技術(shù)研究了15個小麥品種的遺傳多樣性，且依據(jù)獲得的多態(tài)性結(jié)果并結(jié)合其他方法成功構(gòu)建了小麥品種遺傳關(guān)系樹狀圖。該技術(shù)雖然共顯性遺傳，但無法區(qū)分雜合子和純合子；結(jié)果重復(fù)性差等。

2.3 擴增片段長度多態(tài)技術(shù)(AFLP) AFLP是1993年由Zabeau Marc和Vos Pieter發(fā)明的一種檢測基因組DNA多態(tài)性技術(shù)。它既具有RFLP技術(shù)的可靠性又具有PCR技術(shù)的高效性和簡易性[13]。AFLP也有其缺點[14]：產(chǎn)生的標(biāo)記多數(shù)是顯性的，操作技術(shù)較復(fù)雜，試驗條件要求高等。由于AFLP技術(shù)結(jié)合了RFLP技術(shù)和PCR技術(shù)的優(yōu)點，相比于單純的RAPD技術(shù)具有更大的優(yōu)越性。郝晨陽等[15]采用AFLP技術(shù)分析了我國西北春麥區(qū)小麥育成品種間的遺傳多樣性，研究結(jié)果為我國小麥種質(zhì)資源鑒定和遺傳多樣性研究提供了豐富的理論基礎(chǔ)。Bohn等[16]分別利用RFLP、AFLP和SSR 3種分子標(biāo)記技術(shù)分析了德國和澳大利亞冬小麥的遺傳多樣性，結(jié)果表明這3種分子標(biāo)記技術(shù)所反映出的遺傳多態(tài)性信息含量PIC值不存在顯著性差異，但比較發(fā)現(xiàn)AFLP對遺傳多態(tài)性的檢測效果更高。

2.4 微衛(wèi)星DNA標(biāo)記(SSR) SSR是指一段簡單重復(fù)的DNA片段，其每個重復(fù)單位一般為1～4個堿基，重復(fù)數(shù)為10～20次，如(GA)n、(AC)n、(GAA)nA等，該片段廣泛存在于基因組的間隔順序及內(nèi)含子等非編碼區(qū)內(nèi)[17]。微衛(wèi)星標(biāo)記具有數(shù)量多、分布廣、多態(tài)性豐富、共顯性遺傳、易檢測、適用于自動化分析等特點[18-20]。崔國惠等[21]對15份我國不同生態(tài)區(qū)的普通小麥品種和9份不同國家的斯卑爾脫小麥品種進行微衛(wèi)星分子標(biāo)記，其中96.78%的擴增條帶具有多態(tài)性，且斯卑爾脫小麥品種間的位點多態(tài)性高于普通小麥品種間的位點多態(tài)性；分析斯卑爾脫小麥品種與普通小麥品種間的遺傳距離發(fā)現(xiàn)，斯卑爾脫小麥與普通小麥間的平均遺傳距離為0.651 7 CM，且兩者存在較大的遺傳差異。Plaschke等[22]利用SSR技術(shù)分析了40個親緣關(guān)系較近的小麥品種間的遺傳差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有品種中每對引物均具有較豐富的遺傳多態(tài)性，且該研究結(jié)果顯示相對較少的SSR位點即可完成小麥種質(zhì)資源間遺傳多樣性的檢測。

2.5 序列相關(guān)擴增多態(tài)性(SRAP) SRAP 是2001年由美國加州大學(xué)蔬菜作物系Li等提出，該方法是一種新型的、基于PCR的分子標(biāo)記技術(shù)。其原理是利用獨特的引物設(shè)計對開放閱讀框架(OEFs)進行PCR擴增，由于個體間的差異或者物種的內(nèi)含子、啟動子與間隔長度不等而產(chǎn)生多態(tài)性的差異。SRAP標(biāo)記技術(shù)具有操作簡便、過程快速、引物設(shè)計簡單以及多態(tài)性和信息量豐富的特點，被廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性分析、基因標(biāo)記、定位及其遺傳連鎖圖的構(gòu)建等方面[23-25]。

3 分子標(biāo)記技術(shù)特征比較

分子標(biāo)記作為新的遺傳標(biāo)記，雖然具有非常多的優(yōu)點，但目前尚不存在一種分子標(biāo)記技術(shù)可以滿足理想分子標(biāo)記的所有要求。不同分子標(biāo)記技術(shù)由于PCR標(biāo)記體系類型多樣，其各自的復(fù)雜性、可靠性及遺傳信息不同。如RAPD標(biāo)記方法簡單、成本低，但重復(fù)性較差、檢測位點不多；SSR標(biāo)記多為共顯性，重復(fù)性好，但位點較少，引物開發(fā)成本較高；AFLP譜帶多，但試驗操作過程復(fù)雜，需要同位素標(biāo)記，常因基因組DNA的甲基化造成“假多態(tài)性”現(xiàn)象，適用成本高[26-27]。因此，應(yīng)用時應(yīng)根據(jù)研究的需要及其試驗條件，選取相應(yīng)適用的標(biāo)記技術(shù)。

4 分子標(biāo)記技術(shù)在小麥遺傳多樣性中的應(yīng)用

4.1 分子標(biāo)記的多態(tài)性與小麥品種親緣關(guān)系分析 明確小麥品種間親緣關(guān)系是拓寬小麥栽培面積、進行合理基因布局及研究小麥遺傳背景的基礎(chǔ)。目前，研究小麥品種間親緣關(guān)系的方法一般有2種，一種是追溯小麥品種的系譜，通過系譜間的親緣關(guān)系遠近了解不同小麥品種間的親緣關(guān)系；另一種是通過分子標(biāo)記技術(shù)研究小麥間的遺傳差異，通過計算品種間遺傳距離的大小來確定品種間遺傳差異的多少，進而評價不同小麥品種間的親緣關(guān)系。系譜分析方法簡單直觀，但很難確保各品種間系譜的準(zhǔn)確性和可靠性，錯誤的系譜或是不完全清楚的系譜不能真實地反映品種間的親緣關(guān)系，且每個品種遺傳雙親的血緣并不一定全為1/2，因此通過追溯系譜分析品種間的親緣關(guān)系存在較大誤差。通過分子標(biāo)記技術(shù)計算不同品種間的遺傳距離，不僅準(zhǔn)確、可靠，而且簡單、快捷，但該方法的缺點是試驗耗費較大。

孫其信等[28]利用RAPD標(biāo)記技術(shù)對我國40個小麥品種進行遺傳多態(tài)性分析，確定了小麥品種間基因型的遺傳差異及不同品種間的親緣關(guān)系，該結(jié)果對小麥雜種優(yōu)勢群的劃分起著重要的作用。景蕊蓮等[29]利用分子標(biāo)記技術(shù)分析了我國國家種質(zhì)庫中3個平遙小麥種質(zhì)的親緣關(guān)系，結(jié)果顯示，ZM1213平遙小麥與燕大1817的相似程度最高；對平遙小麥、螞蚱麥及其衍生品種的譜系親緣關(guān)系進行聚類分析，研究結(jié)果與系譜中的親緣關(guān)系結(jié)果基本一致。李宏偉等[30]利用新型分子標(biāo)記EST-SSRs技術(shù)對小麥遺傳多樣性進行研究，結(jié)果顯示，部分引物可以用于普通小麥及其近緣種屬的親緣關(guān)系，且可以依據(jù)特征帶譜進行小麥品種的鑒定。宋迎輝等[31]利用系譜分析方法和SSR標(biāo)記方法對河南省小麥主要推廣品種間的親緣關(guān)系進行了研究，結(jié)果表明在河南省主要推廣的10個小麥品種間其血緣關(guān)系較近，其中，豫麥2號和豐產(chǎn)3號為骨干親本；分子標(biāo)記結(jié)果顯示11個小麥品種中均具有豐富的遺傳多態(tài)性，通過計算不同小麥品種間遺傳距離的大小可以判斷各品種間的親緣關(guān)系遠近。利用分子標(biāo)記手段探討不同小麥品種間的遺傳差異及其品種間的親緣關(guān)系是小麥種質(zhì)資源工作的重要內(nèi)容[3]。

4.2 小麥種質(zhì)資源多樣性及其品質(zhì)鑒定研究 有效地評價小麥種質(zhì)資源的遺傳多樣性和正確地鑒定小麥種質(zhì)資源的品質(zhì)是拓寬小麥遺傳基礎(chǔ)、培育優(yōu)良品種的科學(xué)依據(jù)。而分子標(biāo)記是檢測小麥種質(zhì)資源多樣性的有效工具[3,5-6]。在早期，Siedler等[10]利用RFLP分子標(biāo)記技術(shù)研究斯卑爾脫小麥與普通小麥之間的遺傳差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小麥間的平均遺傳差異為春性普通小麥<斯卑爾脫小麥>冬性普通小麥[10]。Sun等[32]運用RAPD標(biāo)記對西藏半野生小麥、普通小麥和斯卑爾脫小麥3種小麥品種進行了遺傳多樣性研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)西藏半野生小麥和斯卑爾脫小麥的群體間遺傳變異較大，且西藏半野生小麥和斯卑爾脫小麥與普通小麥間也存在顯著的群體遺傳差異，該研究結(jié)果不僅可以豐富普通小麥育種親本的遺傳基礎(chǔ)，還可以擴大親本間的遺傳差異。賈繼增等[11]利用分布于21條染色體上的473個RFLP探針分析了不同國家小麥品種間的遺傳多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)普通小麥品種間的遺傳多態(tài)性水平明顯低于其他作物品種間的遺傳多樣性水平，該研究說明普通小麥的遺傳基礎(chǔ)相對而言更為狹窄，其中在B基因組中的小麥遺傳多樣性較高，而在D基因組間的小麥遺傳多樣性最差。因此，小麥種質(zhì)資源多樣性及其品質(zhì)鑒定的研究結(jié)果對在小麥育種中如何引進新的遺傳變異種質(zhì)及雜優(yōu)育種具有重要的指導(dǎo)意義。

4.3 小麥品種間遺傳多樣性研究 研究小麥遺傳多樣性不僅可以為了解小麥物種的起源、品種的分類、親本額選配及核心種質(zhì)資源的構(gòu)建等提供科學(xué)依據(jù)，還是研究、保護和利用現(xiàn)有種質(zhì)資源的重要前提條件。Barrett等[33]利用AFLP 技術(shù)研究了太平洋西北地區(qū)小麥品種間遺傳多樣性差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同小麥品種間的遺傳多樣性為冬性小麥遺傳多樣性>春性小麥遺傳多樣性；此外，還發(fā)現(xiàn)冬性小麥與春性小麥進行雜交或同一生態(tài)習(xí)性的不同類型進行雜交其遺傳多樣性更為豐富，且群體間較大的遺傳變異有助于豐富育種群體的遺傳基礎(chǔ)。李宏偉等[30]利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)研究了96份小麥材料的遺傳多樣性，對于小麥重要基因的開發(fā)、保存與利用具有重要意義。陳新民等[34]利用 59 對 SSR 引物研究了 48 份優(yōu)質(zhì)小麥品種的遺傳多樣性，認為品種間的遺傳差異與系譜結(jié)果較吻合。 耿惠敏等[35]利用 43 對 SSR引物對河南省審定的 40 個小麥品種的遺傳多樣性進行了研究， 認為品種間的遺傳差異較小。高睦槍等[36]利用 53 對SSR 引物研究了48個在1999～2000 年由北方冬麥區(qū)及黃淮冬麥區(qū)觀察圃中選出的新品種或新品系間的遺傳差異，結(jié)果表明我國冬小麥品種的種質(zhì)基礎(chǔ)相對較狹窄。詹克慧等[37]利用79個微衛(wèi)星位點對黃淮麥區(qū)129份小麥種質(zhì)資源進行遺傳差異分析，揭示了不同小麥材料的遺傳差異及其遺傳關(guān)系。Fahima等[38]利用分子標(biāo)記技術(shù)研究了野生二粒小麥、硬粒小麥及普通小麥間遺傳差異，且通過UPGMA聚類群分析方法揭示了野生二粒小麥的遺傳多樣性與地理分布的關(guān)系。對于小麥品種間遺傳差異及其多樣性的研究，Plaschke等[22]和 Bohn等[16]利用小麥 SSR 標(biāo)記對普通小麥品種間的遺傳差異進行了研究，認為微衛(wèi)星標(biāo)記的多態(tài)性和檢測效率明顯高于 RELP 和 RAPD 標(biāo)記。

王鳳濤等[39]利用SRAP標(biāo)記技術(shù)研究了22個河南小麥栽培品種的遺傳多樣性，結(jié)果顯示平均多態(tài)性條帶數(shù)為7，即SRAP標(biāo)記表現(xiàn)出較高的多態(tài)性，該研究結(jié)果高于王林海等[40]利用SSR標(biāo)記技術(shù)對黃淮麥區(qū)130個推廣品種的遺傳多樣性分析的多態(tài)性條帶數(shù)(4.3條帶/引物對)。SRAP標(biāo)記揭示的DNA多態(tài)性高于SSR標(biāo)記?；跇?biāo)記的原理不同，SRAP標(biāo)記技術(shù)與SSR、AFLP等技術(shù)相比更具有目的性和較高的多態(tài)性，更能揭示不同品種間的遺傳差異。

研究表明小麥種屬間的遺傳多樣性豐富，而普通小麥品種間的遺傳多樣性低，其原因可能是由于大量使用相同的骨干親本和單一的育種方法造成的[2-3,31]。因此，加強對現(xiàn)有栽培小麥及其野生近緣種質(zhì)的研究和利用，創(chuàng)造和引進新種質(zhì)、豐富小麥的遺傳基礎(chǔ)等將有利于拓寬普通小麥的遺傳多樣性，進而有利于小麥的遺傳育種、品質(zhì)鑒定及其資源保護等。

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Application of DNA Molecular Maker Techniques in Genetic Diversity of Wheat

ZHENG Ai-quan1， ZHANG Bao-lin2

(1.College of biotechnology,Yangling Vocational and Technical College, Yangling, Shaanxi 712100;2.Agricultural Products Quality Safety Supervision and Testing Center of Guizhou Province, Guiyang,Guizhou 550000)

The research of genetic diversity plays an important role of wheat genetic breeding and germplasm resources protection, development and application. The basic principles, characteristics, advantages and defects of a few types of molecular markers, such as RFLP, RAPD, AFLP, SSR and SRAP were reviewed. Further more, the role and significance of molecular markers in wheat genetic diversity were studied, which will offer theoretical basis in broadening wheat genetics and improving genetic breeding.

Molecular maker; Wheat; Genetic diversity

鄭愛泉(1980- )，男，甘肅靖遠人，講師，博士，從事小麥遺傳育種研究。

2015-04-23

S 188+.1

A

0517-6611(2015)17-040-03