張利霞， 孟彥斌

(隴南師范高等?？茖W(xué)校農(nóng)林技術(shù)學(xué)院，甘肅隴南 742500)

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半夏無菌組織培養(yǎng)體系建立中存在的問題和解決方法

張利霞， 孟彥斌

(隴南師范高等?？茖W(xué)校農(nóng)林技術(shù)學(xué)院，甘肅隴南 742500)

分析了建立半夏組培體系過程中存在的污染、次生代謝產(chǎn)物毒害、低成活率、再生方式多樣化的問題，提出了切實(shí)可行的解決方法，為對(duì)高效建立半夏組織培養(yǎng)體系的實(shí)踐提供依據(jù)。

半夏；組織培養(yǎng)體系；建立；問題；解決方法

半夏組織培養(yǎng)技術(shù)主要用于大規(guī)模繁殖半夏優(yōu)良品種和珍貴種質(zhì)資源，莖尖脫毒和無毒苗擴(kuò)繁以及人工半夏種子生產(chǎn)中，其首要環(huán)節(jié)是建立無菌組織培養(yǎng)體系。建立半夏無菌組織培養(yǎng)體系，就要解決污染、次生代謝產(chǎn)物毒害、成活率低、再生方式多樣化的問題，筆者在此就這幾種問題的發(fā)生情況及解決方法進(jìn)行了分析。

1 污染及其預(yù)防措施

污染可導(dǎo)致組織培養(yǎng)體系建立工作失敗，且引起污染的因素復(fù)雜多樣，所以半夏組織培養(yǎng)無菌體系建立中最為關(guān)鍵和困難的問題是防止污染發(fā)生。

1.1 污染原因 在組培半夏外植體建立中，引起污染的一類因素是外植體、消毒用容器、培養(yǎng)基、接種器械和接種室消毒不徹底，超凈工作臺(tái)過濾裝置失效，操作人員未遵守操作規(guī)程等，使得培養(yǎng)材料外部或培養(yǎng)基上帶有細(xì)菌、真菌等微生物，在培養(yǎng)最初的幾天內(nèi)培養(yǎng)材料和培養(yǎng)基上滋生菌絲或菌落，不及時(shí)處理會(huì)使所有材料和整個(gè)培養(yǎng)基表面均受到感染。引起污染的另一因素是外植體攜帶內(nèi)生菌，培養(yǎng)初期并不表現(xiàn)污染，培養(yǎng)5 d后或更長時(shí)間才出現(xiàn)，污染程度較輕，但最難控制。在半夏外植體材料中，以塊莖尤其是生長結(jié)束后采收的塊莖引起的污染最為嚴(yán)重，珠芽的污染最輕。

1.2 污染的預(yù)防措施

1.2.1 接種環(huán)境嚴(yán)格消毒。接種室、培養(yǎng)室、超凈工作臺(tái)、消毒用容器、接種用器械、沖洗外植體材料所用的蒸餾水、工作人員的工作服和手都要嚴(yán)格消毒。筆者將沖洗外植體材料用的瓶裝蒸餾水、消毒外植體用的容器也用牛皮紙包扎好，用高壓鍋消毒，減少了污染。

1.2.2 選擇適宜的外植體及處理方法。在外植體材料的選擇上盡可能采用生長旺盛時(shí)期健壯母株的珠芽和塊莖，其帶菌少，啟動(dòng)快，又較耐藥劑消毒處理。生長結(jié)束后的塊莖帶菌多，可先無土栽培塊莖，使其生長出珠芽，再以珠芽為外植體接種，能減輕污染。半夏外植體常規(guī)消毒方法是先用流水反復(fù)沖洗外植體，然后0.1%的升汞溶液處理材料10～15 min，用無菌水沖洗3次，再用70%～75%的酒精處理材料1 min，用無菌水沖洗3次，用無菌濾紙吸干外植體水后切割接種。對(duì)帶菌多消毒難的塊莖先要用0.5%的吐溫20浸塊莖材料1 h，期間更換新鮮液2～3次，后用常規(guī)消毒方法滅菌，再剝?nèi)テぃ?0%的次氯酸鈉溶液消毒30 min。材料消毒和沖洗的過程中要不斷攪拌材料，使藥劑或水和材料充分接觸。外植體材料消毒結(jié)束后，將其保留在消毒的容器中，瓶口對(duì)著酒精燈火焰的情況下對(duì)材料進(jìn)行切割、接種。

1.2.3 分散培養(yǎng)。用試管分裝培養(yǎng)基，滅菌后，每支試管中接一個(gè)材料進(jìn)行培養(yǎng)，5～15 d內(nèi)將無污染的材料轉(zhuǎn)接在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，可避免多個(gè)材料接在一個(gè)培養(yǎng)瓶中造成的交叉感染和浪費(fèi)。也可在每試管中接一粒消毒后的塊莖或珠芽，培養(yǎng)一段時(shí)期后，剪取無污染材料的葉柄和葉片扦插組培。

1.2.4 應(yīng)用農(nóng)藥或抗生素抑制病原菌。組培體系建立過程中任何環(huán)節(jié)操作不慎就帶來污染，且外植體材料所帶內(nèi)生菌用前述的表面消毒方法難以殺滅，半夏塊莖和葉也不耐多次消毒，為此可以參考其他植物組培的相關(guān)研究成果，用抗生素或農(nóng)藥預(yù)處理外植體，然后進(jìn)行常規(guī)消毒，或?qū)⒖股鼗虼温人徕c加入培養(yǎng)基中。彭廣霖等用含5～10 mg/L次氯酸鈉的培養(yǎng)基很好地抑制了組培中的枯草桿菌[1]?？股赜欣Ｆ?、氨芐西林鈉、慶大霉素、鏈霉素等，在不同的植物組培上用量在5～1 000 mg/L不等[2-4]。這些都值得借鑒，但在半夏組織培養(yǎng)中需要先進(jìn)行試驗(yàn)才能確定藥劑類型和劑量，原則上要能抑制微生物，不對(duì)外植體造成較大毒害，不造成過高培養(yǎng)成本。

單一的抗生素抑菌也單一，且易使菌類形成抗藥性，濃度高又影響植物生長，使用2種以上抗生素的效果較好。王志成等研究發(fā)現(xiàn)用60 mg/L米鮮胺和 300 mg/L氨芐青霉素或卡那霉素組合基本可抑制幾種材料的污染混合物[5]。田永亮等在葡萄組培初期用2種抗生素有效抑制了污染菌，隨后2種抗生素對(duì)污染菌均降低了抑制作用[6]，說明抗生素能抑制污染菌的生長，但不徹底殺滅污染菌，應(yīng)用中要注意這一現(xiàn)象。

2 次生代謝產(chǎn)物毒害及預(yù)防

2.1 次生代謝產(chǎn)物及其毒害 半夏的次生代謝產(chǎn)物有生物堿、β-谷甾醇、葡萄糖苷、半夏蛋白、脂肪酸[7]等，它們是半夏的生理活性成分，但在組培中對(duì)半夏生長和分化會(huì)起抑制作用。半夏中還含大黃酚[8]等酚類成分，在組織培養(yǎng)中可引起外植體褐化。筆者在半夏組培研究中發(fā)現(xiàn)，不加活性炭的MS培養(yǎng)基上半夏生長速度慢，愈傷組織小，分化的類原球莖少且小，組織容易老化；由于次生代謝產(chǎn)物的毒害使得土壤栽培半夏的輪作年限至少為5年。這是由于半夏在生長過程中不斷向周圍環(huán)境分泌次生代謝產(chǎn)物，環(huán)境中次生代謝產(chǎn)物的積累又反過來對(duì)半夏生長和發(fā)育起抑制作用。

2.2 次生代謝產(chǎn)物毒害的預(yù)防措施 用比較年幼健壯的珠芽、葉、塊莖作外植體，它們所含的次生代謝產(chǎn)物低，因而毒害小。以塊莖作為接種的外植體時(shí)切割的傷口不宜大，否則代謝產(chǎn)物溢出多，毒害大。切塊暴露在空氣中的時(shí)間不宜長，在培養(yǎng)基中暴露的組織也不宜多，以減少酚類氧化而發(fā)生褐化的機(jī)會(huì)。用不含激素的1/2MS +3%葡萄糖培養(yǎng)基為初代培養(yǎng)基，接種后在較低溫度和黑暗情況下進(jìn)行初始培養(yǎng)[9]。培養(yǎng)基中加0.2%～0.3%的活性炭[10]，吸附次生代謝產(chǎn)物，預(yù)防次生代謝產(chǎn)物積累造成的毒害，且活性炭還能減輕外植體材料玻璃化，促進(jìn)生根。對(duì)初代培養(yǎng)的材料及時(shí)轉(zhuǎn)接，縮短轉(zhuǎn)接周期，減少次生代謝產(chǎn)物的積累。

3 成活率和增殖率低及解決方法

3.1 成活率低的原因和表現(xiàn) 由于外植體受污染、次生代謝產(chǎn)物毒害、消毒創(chuàng)傷等原因，在初代培養(yǎng)時(shí)成活率低，具體表現(xiàn)為葉片枯萎，葉柄兩端水漬狀壞死，塊莖顏色變深組織變軟后失去生命能力。成活的外植體也多表現(xiàn)出低增殖率、產(chǎn)生的愈傷組織或類原球莖少。

3.2 提高成活率的措施 對(duì)外植體材料既要嚴(yán)格消毒以防帶菌，還要防止消毒過度而造成死亡。用生長旺盛時(shí)期的珠芽作外植體材料最為理想，成活率最高。以塊莖為外植體時(shí)在消毒后于1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，幾天后頂芽萌發(fā)，周圍組織變綠，再進(jìn)行切塊和轉(zhuǎn)接。塊莖和珠芽的切塊以頂端生長點(diǎn)為中心，輻射狀縱切，盡可能使每個(gè)材料均帶頂端組織，接種后成活率和增值倍數(shù)高，生長速度快。消毒后的葉柄去掉兩端損傷的部分，葉片剪掉邊緣然后接入培養(yǎng)基中容易成活和誘導(dǎo)。

4 再生方式多樣化及解決途徑

4.1 半夏再生方式 組培中半夏再生方式多樣化，一種是一步成苗，即從外植體上直接長出葉和根，形成完整的植株。用帶頂芽的塊莖和珠芽切塊作外植體多是這種再生方式。劉彩蓮試驗(yàn)得出塊莖是誘導(dǎo)半夏一步成苗的最優(yōu)外植體，且最佳培養(yǎng)基及激素配比組合為MS+0.2 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L KT+0.1 mg/L NAA[11]。另一種再生方式是從半夏外植體材料上直接產(chǎn)生不定芽或類原球莖。這種方式基本不通過愈傷組織渠道，所以速度快、用時(shí)短、遺傳穩(wěn)定，但增殖率低，以葉柄、葉片誘導(dǎo)容易形成類原球莖。李先良等以葉片在MS+ 0.5 mg/L 6-BA +0.2 mg/L NAA培養(yǎng)基上誘導(dǎo)形成珠芽，但每個(gè)外植體僅能形成3.5個(gè)珠芽(類原球莖)[12]。第3種增值方式是外植體在創(chuàng)傷和激素誘導(dǎo)下先脫分化產(chǎn)生愈傷組織，愈傷組織上產(chǎn)生不定芽或類原球莖。由于愈傷組織細(xì)胞的分生能力強(qiáng)，故能分化出大量不定芽或類原球莖，極大地提高半夏繁殖系數(shù)，但遺傳穩(wěn)定性不能保證。陶米林等分析發(fā)現(xiàn)半夏頂芽愈傷組織誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L[13]。

4.2 半夏再生方式的利用 3種再生方式各有優(yōu)缺點(diǎn)，建立組培體系工作中要根據(jù)現(xiàn)有的材料、培養(yǎng)目的、外源激素的效應(yīng)等因素合理規(guī)避或加以利用。具體方法為：①一步成苗適用于篩選無菌苗，即將塊莖或珠芽用小容器分散培養(yǎng)成苗，選擇無菌苗，以其葉片、葉柄、珠芽為外植體重新進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織、類原球莖或不定芽。②從外植體材料上直接產(chǎn)生的類原球莖顏色深、結(jié)構(gòu)致密，容易發(fā)芽長成完整植株，可直接以類原球莖作為種子。因其增殖倍數(shù)小，所以在組培上要加大接種量以提高群體的產(chǎn)量。③通過愈傷組織的途徑產(chǎn)生的不定芽只能作為繼代培養(yǎng)的外植體，產(chǎn)生的類原球莖既可作為繼代培養(yǎng)的外植體，也可作為種子，因此通過選用適宜的外植體材料和激素組合的培養(yǎng)基引導(dǎo)愈傷組織朝需要的方向生長。愈傷組織太大浪費(fèi)養(yǎng)分多，其上生長的不定芽或類原球莖體積小，所以也要控制激素含量以控制愈傷組織大小。④愈傷組織的細(xì)胞比其他的細(xì)胞容易發(fā)生變異，其中可能有染色體多倍性變異。多倍體一般比二倍體的個(gè)大，或內(nèi)含物多，表現(xiàn)為倍性效應(yīng)，多倍體半夏也容易通過無性繁殖固定下來，因此工作人員應(yīng)該經(jīng)常觀察，選擇優(yōu)良變異，將其培育成優(yōu)良品種。⑤同一外植體材料在同一種培養(yǎng)基中不一定只表現(xiàn)一種增殖方式，對(duì)管理和利用帶來一定的不便。要盡可能用同一種材料，選用最適宜的培養(yǎng)基，使半夏組織的生長步調(diào)相同。

5 結(jié)論

半夏組織培養(yǎng)體系的建立以防止污染和褐化、提高成活率為中心任務(wù)，通過選擇適宜的外植體材料和消毒方法，改進(jìn)接種技術(shù)，改善培養(yǎng)條件，引導(dǎo)半夏組織再生方式，經(jīng)濟(jì)高效地建立無菌體系。半夏塊莖、珠芽、葉片、葉柄均可作為外植體，以旺盛生長時(shí)期的地上珠芽帶毒少，又耐消毒，成活率高，增值率高，是最為理想外植體。對(duì)接種環(huán)境嚴(yán)格消毒，對(duì)外植體適度、多重消毒，分散培養(yǎng)，既要消除污染，又要保證一定的成活率。用低濃度MS培養(yǎng)基，并添加活性炭，分步進(jìn)行初始培養(yǎng)和誘導(dǎo)培養(yǎng)，縮短轉(zhuǎn)接時(shí)間，以減輕褐化。通過選擇外植體和外源激素，引導(dǎo)半夏再生方式朝需要的方向發(fā)展。

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張利霞(1965- )，女，甘肅西和人，副教授，從事植物組織培養(yǎng)和遺傳育種教學(xué)及研究工作。

2015-04-20

S 567.23+9

A

0517-6611(2015)17-082-02