崔燕玲，劉丹丹*，劉長(zhǎng)風(fēng)，劉大偉

(1.沈陽(yáng)化工大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110142;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030)

我國(guó)是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)大國(guó)，化學(xué)農(nóng)藥使用量大，國(guó)家質(zhì)檢總局公布的數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)農(nóng)藥年產(chǎn)量(按有效成分100%計(jì))近50萬(wàn)t，加工制劑超過(guò)100萬(wàn)t，僅次于美國(guó)，居世界第2位。由于我國(guó)農(nóng)藥使用技術(shù)落后、施用者科技水平不高，造成農(nóng)藥長(zhǎng)期不合理地使用和濫用［1］，使我國(guó)土地受到大面積污染，在主要流域(包括長(zhǎng)江、黃河、松花江、遼河、海河、珠江)的底泥中農(nóng)藥污染情況十分嚴(yán)重［2］。很多省份的農(nóng)田土壤中檢出大量的農(nóng)藥殘留。例如，湖南省160個(gè)土壤樣品中，滴滴涕和六六六檢出率均為100%［3］;遼北農(nóng)田土壤中檢出8種有機(jī)氯農(nóng)藥，其中六氯苯檢出率為100%，狄氏劑檢出率為40.7%［4］;佳木斯松花江沿岸土壤中檢出17種有機(jī)氯農(nóng)藥［5］。

大量研究表明，農(nóng)藥污染已經(jīng)嚴(yán)重威脅到食品安全和人畜健康。2012年浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所和農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥殘留檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室等單位對(duì)浙江省蔬菜生產(chǎn)中主要使用的78種農(nóng)藥(主要為低毒農(nóng)藥)進(jìn)行殘留檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)大量農(nóng)藥殘留，主要的殘留農(nóng)藥就有28種［6］。而環(huán)境中擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑的殘留會(huì)導(dǎo)致哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)、荷爾蒙、生殖系統(tǒng)疾病，甚至誘發(fā)癌癥［7］，有機(jī)氯農(nóng)藥暴露可能與乳腺癌、阿爾茨海默病、帕金森氏病的發(fā)生有關(guān)［8－9］。在棉花上應(yīng)用的殺雄劑甲基砷酸鋅、甲基砷酸鈉為砷類化合物，對(duì)人體危害也很大［10］。因此，人們迫切需要尋求治理土壤農(nóng)藥污染的有效途徑，而一直被認(rèn)為最安全、有效、經(jīng)濟(jì)、無(wú)二次污染的生物修復(fù)技術(shù)無(wú)疑是最佳選擇。筆者介紹了近年來(lái)土壤農(nóng)藥污染的微生物修復(fù)研究概況，旨在為微生物修復(fù)技術(shù)在農(nóng)藥環(huán)境污染治理中的應(yīng)用提供參考。

1 微生物修復(fù)技術(shù)的研究歷程

微生物修復(fù)技術(shù)屬于生物修復(fù)的范疇，該技術(shù)的最大特點(diǎn)是可以對(duì)大面積的環(huán)境污染進(jìn)行治理。生物修復(fù)技術(shù)的發(fā)展最早可追溯到20世紀(jì)50年代，Alexander與他的學(xué)生開(kāi)展了農(nóng)藥在土壤中可降解性的研究，為生物技術(shù)在環(huán)境保護(hù)中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)［11］。至20世紀(jì)70年代，隨著環(huán)境技術(shù)和微生物學(xué)的快速發(fā)展，生物修復(fù)技術(shù)也有了長(zhǎng)足的發(fā)展。微生物以其種類繁多、分布范圍廣泛、代謝方式豐富多樣、代謝速率快等特點(diǎn)，在污染物的修復(fù)中發(fā)揮了不可替代的作用，但該時(shí)期的研究還主要集中在污染物的可降解性和降解程度等基礎(chǔ)方面。20世紀(jì)80年代以后才有學(xué)者利用分子生物學(xué)技術(shù)探索污染修復(fù)機(jī)理并開(kāi)始構(gòu)建多功能微生物菌株。目前，人們對(duì)Pseudomonas sp.ADP菌株的阿特拉津降解基因atzA、B、C、D 及其對(duì)應(yīng)的酶已有較多的了解［12］，近年來(lái)又發(fā)現(xiàn)trzN基因也在阿特拉津的降解過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，且推測(cè)阿特拉津降解基因的進(jìn)化機(jī)制可能與基因的水平轉(zhuǎn)移有關(guān)［13］。在1989年以前，生物修復(fù)的應(yīng)用范圍僅限于試驗(yàn)階段，直到美國(guó)阿拉斯加海域受到大面積石油污染后，生物修復(fù)技術(shù)才真正得到大規(guī)模應(yīng)用。1991年3月，第一屆原位生物修復(fù)的國(guó)際會(huì)議在美國(guó)圣地亞哥召開(kāi)，出版了《In situ bioremediation》和《On-site bioreclamation》2本論文集，標(biāo)志著以生物修復(fù)為核心的環(huán)境生物技術(shù)進(jìn)入了一個(gè)全新的發(fā)展時(shí)期［14］。

2 農(nóng)藥修復(fù)微生物資源

微生物修復(fù)技術(shù)中應(yīng)用的微生物包括兩大類:土著微生物和外源微生物。利用土著微生物進(jìn)行污染修復(fù)時(shí)，主要依靠改善外界環(huán)境條件(如添加營(yíng)養(yǎng)元素、改變環(huán)境介質(zhì)理化性質(zhì)等)來(lái)刺激土著微生物，從而達(dá)到修復(fù)效果。如甲基桿菌(Methylobacterium sp.)能夠利用乙酰甲胺磷為唯一碳源生長(zhǎng)，添加甲醇為補(bǔ)充碳源后，大大促進(jìn)了其對(duì)乙酰甲胺磷的降解［15］。利用節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)降解阿特拉津時(shí)添加淀粉，不僅能促進(jìn)菌株自身生長(zhǎng)，又能促進(jìn)對(duì)阿特拉津的降解［16］。利用外源微生物進(jìn)行污染修復(fù)，則是通過(guò)接種外源具有強(qiáng)降解性能的微生物達(dá)到修復(fù)環(huán)境污染的效果。例如，用六六六和滴滴涕降解菌(包括無(wú)色桿菌屬的3株，芽孢菌屬、假單胞菌屬、產(chǎn)堿菌屬各1株)所制成的復(fù)合菌劑降解茶園土壤中有機(jī)氯農(nóng)藥，效果顯著［17］。從農(nóng)藥廠土壤中分離篩選得到1株絲狀真菌——霉菌7能在含有燃料培養(yǎng)基中生長(zhǎng)并吸附降解燃料，降解速度快，脫色效果較好［18］。從石油污染土壤中分離出的鞘脂菌屬(Sphingobium sp.)可用于對(duì)環(huán)境中甲氰菊酯的修復(fù)，在其基礎(chǔ)上構(gòu)建的新型工程菌株Sphingobium sp.BA3-pytH對(duì)甲氰菊酯的修復(fù)效果更是大大增強(qiáng)［19］。

微生物修復(fù)技術(shù)發(fā)展至今，已有大量高效微生物修復(fù)資源被發(fā)現(xiàn)和利用，包括細(xì)菌、真菌、放線菌、藻類等各微生物類群，其中細(xì)菌類群以其生化上超強(qiáng)的適用能力和較高的突變率等特性，在農(nóng)藥修復(fù)微生物類群中占據(jù)主要地位，而假單胞菌屬更是細(xì)菌類群中最活躍的菌株。趙萍等分離獲得惡臭假單胞菌(P.putida)和腸桿菌(Enterobacter ludwigii)均具有高效修復(fù)有機(jī)磷農(nóng)藥污染的效果［20］。王培蘭從福建長(zhǎng)期受污染的茶園中分離得到的銅綠假單胞菌(P.aeruginos)能夠修復(fù)氯氟氰菊酯污染［21］。解林奇等從土壤中篩選得到9個(gè)多菌靈降解菌系，并從中篩選出5株降解菌［4株為紅球菌屬(Rhodococcus sp.)，1株為寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas sp.)］，72 h對(duì)土壤中5 mg/kg多菌靈的降解率達(dá)到90%以上［22］。朱喜凱等也從土壤中分離出114株具有農(nóng)藥修復(fù)性能的細(xì)菌［23］。崔中利等總結(jié)了近10年分離獲得的60株農(nóng)藥降解微生物，其中有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑、菊酯類殺蟲(chóng)劑、磺酰胺類除草劑、對(duì)硝基苯酚降解菌資源相對(duì)豐富，Pseudomonas sp.菌株數(shù)量最多，Sphingomonas sp.和 Paracoccus sp.的種類也較為豐富［24］。

3 農(nóng)藥污染微生物修復(fù)的影響因素

微生物對(duì)農(nóng)藥污染的修復(fù)效果，一方面取決于微生物本身的特性和能力，如微生物的種類、生長(zhǎng)速率、環(huán)境適應(yīng)性、對(duì)污染物的利用能力等。第二方面則取決于農(nóng)藥本身的結(jié)構(gòu)和特性，如農(nóng)藥的化學(xué)結(jié)構(gòu)、在環(huán)境介質(zhì)中的濃度、溶解性、生物可利用性、吸附性等。正是由于農(nóng)藥的種類繁多，結(jié)構(gòu)和特性各不相同，所以微生物對(duì)農(nóng)藥的降解通常也具有特異性。一般情況下，農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)越簡(jiǎn)單、分子量越小，越易降解;聚合物和復(fù)合物較難降解;取代基多時(shí)較難降解;增加農(nóng)藥的溶解特性和生物可利用性，也能夠提高修復(fù)效果［25］。菊酯農(nóng)藥降解菌Sphingobium sp.對(duì)不同結(jié)構(gòu)菊酯類農(nóng)藥的降解速率差異很大，大小為:氯菊酯＞甲氰菊酯≈氯氰菊酯＞功夫菊酯＞氰戊菊酯＞溴氰菊酯＞聯(lián)苯菊酯。試驗(yàn)結(jié)果表明，Sphingobium sp.JZ-1對(duì)氯氰菊酯降解的初始反應(yīng)是在菊酯水解酶的催化下羧酸酯鍵斷裂生成二氯菊酸和3-苯氧基苯甲醛，3-苯氧基苯甲醛進(jìn)一步氧化成苯氧基苯甲酸，且Sphingobium sp.JZ-1細(xì)胞中菊酯水解酶活性不需要菊酯的誘導(dǎo)［26］。在美國(guó)明尼蘇達(dá)大學(xué)的數(shù)據(jù)庫(kù)Biocatalysis/Biodegradation Database(UM-BBD，http://umbbd.msi.umn.edu/)中已詳細(xì)闡明了許多農(nóng)藥的生物降解途徑，包括有機(jī)磷和有機(jī)氯殺蟲(chóng)劑(對(duì)硫磷、對(duì)硝基苯酚、六六六、滴滴涕)、除草劑(2，4-D、阿特拉津、草甘膦)等［27］。第三方面，微生物對(duì)農(nóng)藥污染的修復(fù)效果還與外界環(huán)境有關(guān)，如溫度、濕度、營(yíng)養(yǎng)可利用程度、酸堿度、氧化還原電位、修復(fù)菌株與環(huán)境中其他微生物的相互作用等。例如，Sphingobium屬細(xì)菌(YBL1、YBL2和YBL3)對(duì)異丙隆的降解效果與外界環(huán)境條件有關(guān)，所有菌株在pH 6.7的馬肝土中均能夠高效降解異丙隆，在pH 4.5的紅壤中均不能降解異丙隆，YBL3在pH 8.2的潮土中也能夠降解異丙隆;當(dāng)含水量低于40%時(shí)，細(xì)菌降解馬肝土中異丙隆的速率與土壤含水量呈正相關(guān);在16～37℃范圍內(nèi)，馬肝土中異丙隆的降解速率與溫度呈正相關(guān)［28］。

4 農(nóng)藥污染微生物修復(fù)前景與展望

隨著人們對(duì)環(huán)境問(wèn)題的關(guān)注和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的推進(jìn)，農(nóng)藥微生物修復(fù)技術(shù)將在農(nóng)藥環(huán)境污染治理中發(fā)揮更大的作用，但在修復(fù)過(guò)程中也存在以下問(wèn)題:微生物修復(fù)研究在實(shí)驗(yàn)室中取得很多理想效果，但將結(jié)果應(yīng)用于土壤污染現(xiàn)場(chǎng)時(shí)往往達(dá)不到預(yù)期效果，甚至與實(shí)驗(yàn)室結(jié)果相悖［29］;在試驗(yàn)過(guò)程中，微生物受外界影響大;還有很多情況下污染物并不能完全降解，可能會(huì)產(chǎn)生中間產(chǎn)物，有時(shí)中間產(chǎn)物的毒性大于母體化合物的毒性。在今后的研究中，土壤農(nóng)藥污染的微生物修復(fù)技術(shù)應(yīng)從以下幾個(gè)方面加強(qiáng)研究:①對(duì)污染修復(fù)微生物資源的篩選、收集、保護(hù)。②微生物對(duì)農(nóng)藥降解途徑及代謝機(jī)理研究。加強(qiáng)對(duì)高殘留、危害大、復(fù)雜結(jié)構(gòu)農(nóng)藥(如雜環(huán))及新農(nóng)藥降解途徑的研究;加強(qiáng)對(duì)農(nóng)藥污染修復(fù)過(guò)程中涉及的共代謝機(jī)理的研究。③在降解基因篩選和遺傳工程的基礎(chǔ)上，加速構(gòu)建高效修復(fù)菌株。④建立科學(xué)合理的生物修復(fù)評(píng)價(jià)指標(biāo)體系。⑤加速將理論研究應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)際的成果轉(zhuǎn)化。⑥環(huán)境微生物在生態(tài)環(huán)境中的相互作用及與其他環(huán)境生物的聯(lián)合修復(fù)研究。⑦微生物修復(fù)技術(shù)與其他環(huán)境污染治理技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用。⑧生物修復(fù)微生物的分子生物學(xué)和分子生態(tài)方面的相關(guān)研究。

［1］曹坳程，王秋霞，李園，等.我國(guó)農(nóng)藥使用中存在的問(wèn)題和建議［C］//吳孔明.植?？萍紕?chuàng)新與現(xiàn)代農(nóng)業(yè)建設(shè).北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2012:374－376.

［2］FU S，CHENG H X，LIU Y H.Levels and distribution of organochlorine pesticides in various media in a mega-city，China［J］.Chemosohere，2009，75(5):588－594.

［3］陳瑤.湖南省農(nóng)田土壤中HCH和DDT殘留狀況研究［J］.中國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè)，2012，28(5):44 －47.

［4］遲杰，魯逸人.六六六在海河沉積物中的自然生物降解［J］.天津大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，43(4):329 －332.

［5］馮雪，滕彥國(guó)，李劍，等.土壤中OCPs殘留特征及健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)——以松花江佳木斯段為例［J］.環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2012，35(3):182 －186.

［6］葉雪珠，趙燕申，王強(qiáng)，等.蔬菜農(nóng)藥殘留現(xiàn)狀及其潛在風(fēng)險(xiǎn)分析［J］.中國(guó)蔬菜，2012(14):76－80.

［7］CHATTERJEE K K，TALUKDER G，SHARMA A.Effects of synthetic pyrethroids on mammalian chromosomes:I.Sumicidin［J］.Mutation Research Letters，1982，105(1/2):101 －106.

［8］CHHILLAR N，SINGH N K，BANERJEE B D，et al.Beta hexachlorocyclohexane(β-HCH)and risk of alzheimer’s diseaseand parkinson’sdisease［C］//Ipcbee.2012 international conference on biological and life sciences.Singapore:Iacsit Press，2012:28 －33.

［9］楊景哲，胡大為，王芳.有機(jī)氯農(nóng)藥暴露與乳腺癌發(fā)生關(guān)系［J］.中國(guó)公共衛(wèi)生，2012，28(9):1153 －1155.

［10］孟慶忠，王貴春，李國(guó)榮，等.草甘膦作為棉花殺雄劑應(yīng)用研究初報(bào)［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，49(11):2706 －2709.

［11］ALEXANDERM.Biodegradation and bioremediation［M］.San Diego，California:Academic Press，1999.

［12］DE SOUZA M L，WACKETT L P，SADOWSKY M J.The atzACB genes encoding atrazine catabolism are located on a self-transmissible plasmid in Pseudomonas sp.strain ADP［J］.Appl Environ Microbiol，1998，64:2323－2326.

［13］代先祝，蔣建東，顧立峰，等.阿特拉津降解菌Arthrobacter sp.AG1降解基因研究［J］.生物工程學(xué)報(bào)，2007，23(5):789 －793.

［14］李順鵬，蔣建東.農(nóng)藥污染土壤的微生物修復(fù)研究進(jìn)展［J］.土壤，2004，36(6):577 －583.

［15］王莉，凌琪，湯利華，等.Methylobacterium sp.YAL-2對(duì)乙酰甲胺磷的降解特性［J］.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2012，18(3):438 －443.

［16］韓鵬，洪青，何麗娟，等.阿特拉津降解菌ADH-2的分離、鑒定及其特性研究［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2009，28(2):406 －410.

［17］方玲.降解有機(jī)氯農(nóng)藥的微生物菌株分離篩選及應(yīng)用效果［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2000，11(2):249 －252.

［18］劉長(zhǎng)風(fēng)，劉桂萍，王魯萍，等.開(kāi)放體系下霉菌7對(duì)偶氮染料的吸附降解［J］.紡織學(xué)報(bào)，2012，33(3):67 －73.

［19］段曉芹，鄭金偉，張雋，等.3-PBA降解菌BA3的降解特性及基因工程菌構(gòu)建［J］.環(huán)境科學(xué)，2011，32(1):240 －246.

［20］趙萍，亓文靜，王雅，等.兩株有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌的分離鑒定及降解特性［J］.蘭州理工大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，36(3):86 －92.

［21］王培蘭.高效氯氟氰菊酯降解菌分離鑒定及降解性能研究［D］.廈門:集美大學(xué)，2012.

［22］解林奇，劉君，高淼，等.多菌靈降解菌系的篩選與組成分析及其對(duì)土壤中多菌靈的降解［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45(23):4826 －4835.

［23］朱喜凱，于愛(ài)麗，朱永哲，等.農(nóng)業(yè)耕地土壤中114株農(nóng)藥降解菌的分離與篩選［J］.山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，44(6):88 －92.

［24］崔中利，崔利霞，黃彥，等.農(nóng)藥污染微生物降解研究及應(yīng)用進(jìn)展［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，35(5):93 －102.

［25］LUTHY RG，AIKENGR，BRUSSEAUM L，et al.Sequestration of hydrophobic organic contaminants by geosorbents［J］.Environmental Science ＆Technology，1997，31:3341 －3347.

［26］李戀，王保戰(zhàn)，周維友，等.Sphingobium sp.JZ-1對(duì)菊酯類農(nóng)藥的降解特性研究［J］.土壤學(xué)報(bào)，2011，48(2):389 －396.

［27］GAOJ，ELLISL B，WACKETTL P.The university of Minnesota biocatalysis/biodegradation database:Improving public access［J］.Nucleic Acids Research，2010，38:488 －491.

［28］孫紀(jì)全，梁斌，黃星，等.Sphingobium屬細(xì)菌土壤中降解異丙隆的特性［J］.土壤學(xué)報(bào)，2011，48(2):383 －388.

［29］HERKOVITS J，PEREZ COLL C，HERKOVITS F D.Ecotoxicological studies of environmental samples from Buenos Aires area using a standardized amphibian embryo toxicity test(AMPHITOX)［J］.Environmental Pollution，2002，116(1):177 －183.