朱麗丹 王 莉 徐逸木 王 韌 李亞男 陳正行

（江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室1，無(wú)錫 214122）（江南大學(xué)食品學(xué)院2，無(wú)錫 214122）

米糠多糖及硫酸酯化米糠多糖的體外免疫應(yīng)答和抗腫瘤活性研究

朱麗丹1，2王 莉1，2徐逸木1，2王 韌1，2李亞男1陳正行1，2

（江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室1，無(wú)錫 214122）（江南大學(xué)食品學(xué)院2，無(wú)錫 214122）

以小鼠黑色素瘤細(xì)胞（B16）為抗腫瘤模型，通過(guò)MTT比色法評(píng)價(jià)米糠多糖及硫酸酯化米糠多糖對(duì)B16增殖抑制能力。以小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7細(xì)胞系為免疫模型，通過(guò)MTT比色法評(píng)價(jià)Raw264.7增殖能力，中性紅吞噬試驗(yàn)評(píng)價(jià)巨噬細(xì)胞活性，Griess方法檢測(cè)一氧化氮（NO）釋放量，以及酶聯(lián)免疫（ELISA）檢測(cè)腫瘤壞死因子（TNF－α）分泌量，考察米糠多糖及硫酸酯化米糠多糖的免疫活性。研究發(fā)現(xiàn)：米糠粗多糖（RBP）和米糠多糖純化組分（RBP2a）主要通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能而間接抑制腫瘤細(xì)胞。質(zhì)量濃度為250 μg／mL時(shí)，RBP和RBP2a樣品組的NO釋放量分別為對(duì)照組的4.67、6.36倍，TNF－α分泌量為對(duì)照組的441.1、465.5倍；RBP直接組和間接組的B16抑制率分別為8.16%、45.55%，間接組的B16抑制率比直接組增長(zhǎng)458%。硫酸酯化米糠多糖（SRBP－B，SRBP－D，SRBP2a－B）一方面可以直接抑制B16增殖，質(zhì)量濃度為1 000μg／mL時(shí)，對(duì)B16抑制率達(dá)73.65%、65.53%、78.43%，另一方面也可通過(guò)免疫途徑提高NO和TNF－α等細(xì)胞因子釋放，進(jìn)一步提高抗腫瘤活性。但高濃度SRBP－B，SRBP－D，SRBP2a－B能抑制Raw264.7增殖，在500μg／mL時(shí)，Raw264.7存活率僅為83.26%、81.8%、79.78%。

米糠多糖 硫酸酯化米糠多糖 免疫調(diào)節(jié) 抗腫瘤活性

米糠是稻米加工的副產(chǎn)物，含有優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)、多糖、脂肪、生育酚等生物活性物質(zhì)［1］。研究表明，米糠中活性多糖具有提高免疫能力［1］，抗腫瘤［2－5］，降血脂［6］等功能。生物活性多糖的抗腫瘤途徑主要有2種：一方面通過(guò)宿主介導(dǎo)提高抗腫瘤活性，即多糖作為生物免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)劑，通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能而間接抑制或殺死腫瘤細(xì)胞；另一方面多糖對(duì)細(xì)胞有毒性，直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖［7］。目前米糠多糖的活性研究主要集中在對(duì)腫瘤的直接抑制作用或提高免疫活性等單一方面，將腫瘤直接抑制作用和免疫活性聯(lián)系起來(lái)對(duì)米糠多糖抗腫瘤途徑的研究很少。有研究表明［2］：對(duì)米糠多糖進(jìn)行硫酸酯化修飾，可以提高多糖的抗腫瘤活性，對(duì)體外人肝癌細(xì)胞Hep G2和小鼠乳腺癌細(xì)胞EMT－6抑制能力有顯著增強(qiáng)。但是米糠多糖經(jīng)硫酸酯化后免疫活性是否有所變化，抗腫瘤途徑是否有所轉(zhuǎn)變，尚鮮見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，本試驗(yàn)旨在研究米糠多糖及硫酸酯化米糠多糖對(duì)體外小鼠黑色素瘤細(xì)胞（B16）抑制能力及小鼠巨噬細(xì)胞（Raw264.7）免疫應(yīng)答作用。

1 材料與方法

1.1 材料及試驗(yàn)細(xì)胞

脫脂米糠：萬(wàn)福生科（湖南）農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)股份有限公司；小鼠黑色素瘤細(xì)胞（B16）、Raw264.7（小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞）：中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；胎牛血清：美國(guó)Gibico公司；RPMI1640培養(yǎng)基、青霉素／鏈霉素、胰蛋白酶：美國(guó)Cellgro公司；DMEM（HighGlucose）：美國(guó)Thermo公司；3－（4，5－二甲基噻唑－2）－2，5－二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、脂多糖（LPS）：美國(guó)Sigma公司；TNF－α檢測(cè)試劑盒：美國(guó)eBoscience公司；Sepharose Big Beads、Sepharose CL－6B：美國(guó)通用電氣（GE）公司；淀粉酶、糖化酶、中性蛋白酶：無(wú)錫杰能科生物工程有限公司；注射用香菇多糖：山西振東泰盛制藥有限公司；注射用順鉑：齊魯制藥有限公司。

1.2 主要儀器

SH－1000酶標(biāo)儀：日本Corona公司；TH－1000型梯度混合器、HL－2S型恒流、HD－5電腦紫外檢測(cè)儀：上海青浦滬西分析儀器廠(chǎng)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 米糠多糖的制備及分離純化

米糠多糖的提取及分離純化方法參考文獻(xiàn)［1－2］。采用熱水浸提，氫氧化鈣、α－高溫淀粉酶、糖化酶、中性蛋白酶除去植酸、淀粉、蛋白等雜質(zhì)，工業(yè)酒精醇沉多糖（酒精體積濃度為70%）。將離心得到沉淀利用透析除去殘留的鹽，濃縮后冷凍干燥即為米糠粗多糖（RBP）。將RBP復(fù)溶液上樣于Sepharose Big Beads離子交換柱，以含0、0.5 mol／L氯化鈉的磷酸鹽緩沖液（0.1 mol／L，pH＝8.5）作為洗脫劑洗脫柱子，根據(jù)多糖含量繪制洗脫曲線(xiàn)，得到組分RBP1、RBP2、RBP3。根據(jù)抗腫瘤和免疫活性綜合指標(biāo)評(píng)價(jià)RBP1、RBP2、RBP3，選取RBP2作為進(jìn)一步純化組分。將RBP2復(fù)溶液上樣于Sepharose CL－6B凝膠柱，以磷酸鹽緩沖液（0.1 mol／L，pH＝7.6）作為洗脫劑洗脫柱子，根據(jù)多糖含量繪制洗脫曲線(xiàn)，得到RBP2a、RBP2b。由于RBP2b組分含量少，故選取RBP2a作為純化米糠多糖。

1.3.2 硫酸酯化米糠多糖的制備

以RPB為反應(yīng)底物，1－丁基－3－甲基咪唑四氟硼酸鹽（［BMIM］BF4）或N，N－二甲基甲酰胺（DMF）為反應(yīng)介質(zhì)，根據(jù)吡啶－氯磺酸法制備得到硫酸酯化米糠多糖，分別命名為SRPB－B、SRPBD。以RPB2a為反應(yīng)底物，［BMIM］BF4反應(yīng)介質(zhì)，根據(jù)吡啶－氯磺酸法制備得到硫酸酯化米糠多糖，命名為SRBP2a－B。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16置于1640完全培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、100 U／mL的青霉素和100 U／mL的鏈霉素），在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。

小鼠巨噬細(xì)胞Raw267.4置于高糖DMEM完全培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、100 U／mL的青霉素和100 U／mL的鏈霉素），在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。

1.3.4 試驗(yàn)分組

取對(duì)數(shù)期的B16或Raw264.7經(jīng)胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度，接種于96孔板中，每孔100μL，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)12 h，吸取上清液，加入不同溶液200μL。其中無(wú)細(xì)胞孔作為空白組，僅加完全培養(yǎng)液孔為對(duì)照組，含1μg／mL脂多糖（LPS）的完全培養(yǎng)液孔為L(zhǎng)PS模型組，含50μg／mL香菇多糖的完全培養(yǎng)液孔為香菇多糖模型組，含5μg／mL順鉑的完全培養(yǎng)液孔為順鉑模型組（cisplatin），加不同濃度的米糠多糖（RBP、RBP2a）及硫酸酯化米糠多糖（SRBP－B、SRBP－D、SRBP2a－B）孔為樣品組。

1.3.5 對(duì)B16增殖直接抑制的影響

調(diào)整B16細(xì)胞密度為5×104～10×104個(gè)／mL，按照1.3.3培養(yǎng)48 h，加入5mg／mL MTT 20μL，培養(yǎng)4 h，小心的吸出上清液，加入150μL二甲亞砜，在平板震蕩儀上震蕩10 min，在570 nm測(cè)定96孔板各孔的吸光值。

1.3.6 對(duì)Raw264.7增殖的影響

調(diào)整Raw264.7細(xì)胞密度為1×105個(gè)／mL，按照1.3.3培養(yǎng)24 h，加入5mg／mL MTT 20μL，培養(yǎng)4 h，小心的吸出上清液，加入150μL二甲亞砜，震蕩10 min，在570 nm測(cè)定96孔板各孔的吸光值。

1.3.7 對(duì)Raw264.7吞噬能力的影響［8］

調(diào)整Raw264.7細(xì)胞密度為1×105個(gè)／mL，按照1.3.3培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，然后每孔加入100μL 0.05%中性紅溶液繼續(xù)培養(yǎng)1 h。細(xì)胞用37℃溫浴的PBS洗滌3次，以除去未被吞噬的中性紅，最后每孔加入100μL細(xì)胞裂解液（50%乙酸和50%乙醇）裂解過(guò)夜，于550 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定各孔中性紅吸光度值。按下式計(jì)算Raw264.7吞噬指數(shù)和平均吞噬指數(shù)：

1.3.8 對(duì)Raw264.7 NO產(chǎn)生量的影響［9］

調(diào)整Raw264.7細(xì)胞密度為5×105個(gè)／mL，按照1.3.3培養(yǎng)48 h，取上清液50μL于新的96孔中，加入50μL Griess試劑，震蕩10 min，在550 nm測(cè)定各孔的吸光值。根據(jù)NaNO2制得的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算培養(yǎng)液中的NO生成量（μmol／L）。

NO標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作：配置100μmol／L的NaNO2標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取0、10、20、30、40、50μL NaNO2標(biāo)準(zhǔn)溶液，超純水補(bǔ)足至50μL，加入50μL Griess試劑，震蕩10 min，在550 nm測(cè)定其吸光值。

1.3.9 對(duì)Raw 264.7TNF－α產(chǎn)生量的影響

調(diào)整Raw264.7細(xì)胞密度為5×105個(gè)／mL，按照1.3.3培養(yǎng)24 h。上清液的TNF－α含量按照eB-osience試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行ELISA試驗(yàn)。

1.3.10 對(duì)B16增殖間接抑制能力的影響［10］

調(diào)整Raw264.7細(xì)胞密度為5×105個(gè)／mL，按照1.3.3培養(yǎng)24 h，收集200μL上清液于離心管中備用。按照1.3.5測(cè)定不同溶液處理Raw264.7上清液對(duì)B16細(xì)胞體外抑制率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVE方差分析，并以檢驗(yàn)比較組間差異性，顯著性水平為P＝0.05，極顯著性水平為P＝0.01。數(shù)據(jù)±SD表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 對(duì)B16直接增殖抑制能力的影響

采用MTT比色法測(cè)定細(xì)胞的活性，MTT能和活細(xì)胞線(xiàn)粒體脫氫酶生成藍(lán)紫色的甲臜，甲臜在最大吸收波長(zhǎng)550 nm的吸光值與活性細(xì)胞數(shù)成正比。從圖1可以看出：和對(duì)照組相比，LPS模型組對(duì)B16抑制率較低，僅為3.66%；香菇多糖和順鉑模型組對(duì)B16有良好的體外抑制作用，抑制率分別為60.42%，73.12%。RBP、RBP2a、SRBP－B、SRBP－D、SRBP2a－B樣品組對(duì)B16抑制率都隨樣品濃度的增加而增加，在質(zhì)量濃度為1 000μg／mL，抑制率分別為15.32%、44.92%、73.65%、65.53%、78.43%。與RBP樣品組相比，RBP2a樣品組顯著提高了對(duì)B16細(xì)胞體外抑制能力（P＜0.05），說(shuō)明利用離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析可以有效富集抗腫瘤活性組分。SRBP－B、SRBP－D、SRBP2a－B對(duì)B16抑制作用優(yōu)于RBP、RBP2a，這和文獻(xiàn)報(bào)道的多糖經(jīng)硫酸化修飾后能有效提高其抗腫瘤活性一致［9］。在不同添加濃度下，SRBP－B，SRBP－D樣品組對(duì)B16抑制率有所差別，這可能是因?yàn)榉磻?yīng)介質(zhì)不同，影響了硫酸酯化米糠多糖的取代度、取代位置、空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響其對(duì)癌細(xì)胞的直接抑制能力。

圖1 米糠多糖及硫酸酯化米糠多糖對(duì)B16直接抑制能力

2.2 對(duì)Raw264.7增殖的影響

從圖2可看出：和對(duì)照組相比，LPS模型組和香菇多糖模型組顯著增強(qiáng)了Raw264.7體外細(xì)胞增殖能力（P＜0.05），增殖刺激指數(shù)分別為115.15%，105.87%；順鉑模型組嚴(yán)重抑制了Raw264.7體外生長(zhǎng)，在質(zhì)量濃度為5μg／mL，Raw264.7增殖刺激指數(shù)只有36.75%，說(shuō)明順鉑對(duì)Raw264.7有較大毒性。

圖2 米糠多糖及硫酸酯化米糠多糖對(duì)Raw264.7增殖能力的影響

在低質(zhì)量濃度（31.75～125μg／mL），RBP、RBP2a對(duì)Raw264.7增殖無(wú)顯著性影響（P＞0.05）；在高質(zhì)量濃度（500μg／mL），RBP、RBP2a樣品組的Raw264.7增殖刺激指數(shù)分別為91.47%、92.84%，說(shuō)明高濃度的RBP、RBP2a對(duì)細(xì)胞有一定抑制作用。SRBP－B、SRBP－D、SRBP2a－B樣品組，在高質(zhì)量濃度（500μg／mL），對(duì)Raw264.7有較大抑制作用，Raw264.7增殖刺激指數(shù)分別為83.26%、81.8%、79.78%。這說(shuō)明了多糖經(jīng)硫酸酯化后對(duì)Raw264.7增殖抑制作用增強(qiáng)，可能是硫酸酯化修飾改變了多糖空間結(jié)構(gòu)，影響多糖和巨噬細(xì)胞結(jié)合的靶點(diǎn)。

2.3 對(duì)Raw264.7吞噬能力的影響

正常生長(zhǎng)的巨噬細(xì)胞具有吞噬中性紅的功能，中性紅可滯留在溶酶體內(nèi)而不被洗滌液洗脫。正常情況下，巨噬細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，受到藥物刺激后，吞噬能力增強(qiáng)，吞噬能力可以衡量藥物的免疫活性［11］。圖3和圖4可以看出：相比對(duì)照組，1）LPS模型組的吞噬指數(shù)有顯著提高（P＜0.05），為1.21，但平均吞噬指數(shù)則無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；2）香菇多糖模型組的吞噬指數(shù)和平均吞噬指數(shù)均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；3）順鉑模型組的吞噬能力受到嚴(yán)重抑制（P＜0.01）。這說(shuō)明：LPS模型組主要通過(guò)促進(jìn)Raw264.7細(xì)胞增殖從而增強(qiáng)其吞噬能力；香菇多糖對(duì)Raw264.7吞噬能力的影響不大；順鉑可能對(duì)Raw264.7產(chǎn)生了毒性，影響了細(xì)胞的活性，從而使Raw264.7吞噬能力顯著下降。

圖3 米糠多糖及硫酸酯化米糠多糖對(duì)Raw264.7吞噬能力的影響

圖4 米糠多糖及硫酸酯化米糠多糖對(duì)平均吞噬能力的影響

和對(duì)照組相比，RBP、RBP2a低質(zhì)量濃度（31.75～62.5μg／mL）能提高Raw264.7吞噬指數(shù)（P＜0.05），高質(zhì)量濃度（125～500μg／mL）對(duì)Raw264.7吞噬指數(shù)影響不明顯（P＞0.05）。RBP增強(qiáng)Raw 264.7平均吞噬能力，且平均吞噬指數(shù)顯著高于對(duì)照組和香菇多糖模型組（P＜0.05）。通過(guò)觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，RBP和RBP2a樣品組的Raw264.7體積變大，偽足增加，可能是因?yàn)镽BP和RBP2a通過(guò)激活靜息狀態(tài)的Raw264.7，增強(qiáng)Raw264.7平均吞噬指數(shù)。

米糠多糖的硫酸酯化修飾對(duì)提高Raw264.7吞噬能力基本沒(méi)有作用，隨著濃度的增加，Raw264.7的平均吞噬指數(shù)差異不顯著，吞噬指數(shù)反而有下降的趨勢(shì)，這可能和硫酸酯化米糠多糖樣品組相對(duì)低的細(xì)胞增殖刺激指數(shù)有關(guān)。在不同添加濃度下，SRBP－B，SRBP－D樣品組的Raw264.7的吞噬能力和平均吞噬能力均有差別，這可能是因?yàn)榉磻?yīng)介質(zhì)不同，影響了米糠多糖硫酸酯的取代度、取代位置、空間結(jié)構(gòu)，從而影響免疫活性。

2.4 對(duì)Raw264.7 NO釋放量的影響

NO是巨噬細(xì)胞分泌的一種信號(hào)分子，是激活靜息的巨噬細(xì)胞，吞噬病原微生物的主要效應(yīng)分子。從圖5可以看出：和對(duì)照組相比，LPS和香菇多糖模型組顯著提高了Raw264.7 NO釋放量（P＜0.01），且香菇多糖模型組NO釋放量要明顯高于LPS模型組；而順鉑模型組顯著降低了Raw264.7 NO釋放量（P＜0.05），這可能是順鉑對(duì)Raw264.7細(xì)胞產(chǎn)生毒性，影響Raw264.7細(xì)胞活性。

RBP、RBP2a、SRBP－B、SRBP－D、SRBP2a－B樣品組的NO釋放量顯著高于對(duì)照組，這可能是因?yàn)槊卓范嗵羌傲蛩狨セ卓范嗵羌せ铎o息狀態(tài)的Raw264.7，誘導(dǎo)iNOS表達(dá)。隨著RBP添加濃度的增加，Raw264.7的NO釋放量有所增加，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到125μg／mL，NO釋放量達(dá)到最大，為15.15 μmol／L；當(dāng)質(zhì)量濃度超過(guò)125μg／m L，隨著添加濃度的增加，NO釋放量反而有所下降，可能與在高濃度下，Raw264.7相對(duì)低的增殖刺激指數(shù)有關(guān)。RBP2a樣品組的NO釋放量明顯高于RBP樣品組，且當(dāng)RBP2a質(zhì)量濃度在62.5～250μg／m L的濃度范圍內(nèi)，Raw264.7的NO釋放量顯著高于LPS模型組和香菇模型組（P＜0.05）。與RBP、RBP2a樣品組相比，SRBP－B，SRBP－D，SRBP2a－B樣品組的NO釋放量顯著降低（P＜0.05），但組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。這表明米糠多糖及硫酸酯化米糠多糖可以刺激Raw264.7 NO釋放，而NO釋放量可能和多糖的結(jié)構(gòu)、氫鍵數(shù)量有關(guān)。

圖5 米糠多糖及硫酸酯化米糠多糖對(duì)NO釋放量的影響

2.5 對(duì)Raw264.7 TNF－α釋放量的影響

TNF－α為巨噬細(xì)胞分泌主要細(xì)胞因子，是巨噬細(xì)胞發(fā)揮免疫功能的重要活性蛋白分子。TNF可以誘導(dǎo)IL－1及IL－6合成，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、抗感染、上調(diào)節(jié)組織修復(fù)、引起腫瘤細(xì)胞凋亡等［7］。從圖6可以看出：與對(duì)照組相比，LPS和香菇多糖模型組可以顯著提高Raw264.7 TNF－α釋放量（P＜0.01），且LPS模型組的TNF－α釋放量明顯高于香菇多糖模型組（P＜0.05）；而順鉑模型組TNF－α釋放量有所增加，相比對(duì)照組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

圖6 米糠多糖及硫酸酯化米糠多糖對(duì)TNF－α釋放量的影響

RBP、RBP2a、SRBP－B、SRBP－D、SRBP2a－B樣品組TNF－α釋放量明顯高于對(duì)照組（P＜0.01），且與添加濃度呈正相關(guān)，當(dāng)質(zhì)量濃度250μg／mL時(shí)，TNF－α釋放量分別為19.85、24.52、15.03、13.75、14.58 ng／mL，是對(duì)照組的441.1、465.5、333、305.6、324倍。RBP2a和RBP樣品組的TNF－α釋放量，當(dāng)質(zhì)量濃度在31.75～125μg／mL范圍內(nèi)，組間差異顯著（P＜0.05），當(dāng)質(zhì)量濃度高于125μg／mL，組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。與RBP、RBP2a樣品組相比，SRBP－B，SRBP－D，SRBP2a－B樣品組的TNF－α釋放量顯著降低（P＜0.05），但組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。這表明米糠多糖及硫酸酯化米糠多糖可以刺激Raw264.7分泌TNF－α，而TNF－α釋放量可能和多糖的結(jié)構(gòu)、氫鍵數(shù)量有關(guān)。

2.6 對(duì)B16增殖間接抑制能力的影響

從圖7可以看出：隨著濃度的增加，RBP直接組和間接組對(duì)B16增殖抑制作用也隨之增強(qiáng)。與RBP直接組相比，RBP間接組的B16增殖受到明顯抑制（P＜0.01）。當(dāng)質(zhì)量濃度為250μg／mL，RBP直接組和間接組的B16抑制率分別為8.16%、45.55%，間接組對(duì)B16抑制能力是直接組的5.58倍。文獻(xiàn)報(bào)道［3］米糠多糖可以抑制小鼠體內(nèi)S－180肉瘤細(xì)胞的增殖，這可能主要通過(guò)增加機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)活性，如激活巨噬細(xì)胞，促進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，從而增加其抗腫瘤活性。

圖7 RBP直接和間接處理對(duì)B16增殖的影響

從圖8可以看出：隨著濃度的增加，SRBP2a－B直接組和間接組對(duì)B16增殖抑制作用也隨之增強(qiáng)，且間接組的B16抑制率顯著高于直接組（P＜0.05）。當(dāng)質(zhì)量濃度為31.75μg／mL，SRBP2a－B直接組和間接組的B16抑制率分別為9.90%、42.30%，這說(shuō)明低濃度的硫酸酯化米糠多糖還是主要通過(guò)增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)從而提高抗腫瘤活性。當(dāng)質(zhì)量濃度為500μg／mL時(shí)，SRBP2a－B直接組和間接組的B16抑制率分別為69.29%、80.10%，這說(shuō)明高濃度的硫酸酯化米糠多糖一方面可以直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖，另一方面可以通過(guò)釋放細(xì)胞因子和NO間接提高抗腫瘤活性。

圖8 SRBP2a－B直接和間接處理對(duì)B16增殖的影響

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7和小鼠黑色瘤細(xì)胞B16為研究模型，發(fā)現(xiàn)米糠多糖和米糠多糖硫酸酯具有免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤活性。研究發(fā)現(xiàn)：米糠多糖主要通過(guò)宿主介導(dǎo)提高抗腫瘤活性，在多糖誘導(dǎo)下，Raw264.7由靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ顮顟B(tài)，細(xì)胞吞噬能力、NO和TNF－α釋放能力都有所提高，通過(guò)巨噬細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒性，對(duì)腫瘤細(xì)胞起到抑制作用；米糠多糖經(jīng)過(guò)硫酸酯化后多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性有所增加，可以在體外直接抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，同時(shí)也可以刺激巨噬細(xì)胞NO和TNF－α釋放間接提高其抗腫瘤活性，但是硫酸酯化多糖在高濃度可能會(huì)對(duì)巨噬細(xì)胞也產(chǎn)生一定毒性，抑制巨噬細(xì)胞的增殖。

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Immunomodulatory and Anti－Tumor Activity of
Polysaccharides and Sulfated Polysaccharides from Rice Bran

Zhu Lidan1，2Wang Li1，2Xu Yimu1，2Wang Ren1，2Li Yanan1Chen Zhengxing1，2
（National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，Jiangnan University1，Wuxi 214122）（School of Food Science and Technology，Jiangnan University2，Wuxi 214122）

Anti－tumor activity of rice bran polysaccharides（RBP and RBP2a）and sulfated polysaccharides（SRBP－B，SRBP－D and SRBP2a－B）on themousemelanoma cells（B16）has been evaluated by MTTmethod in the paper.In addition，the proliferation activity，stimulation activity on phagocytosis，NO and tumor necrosis factor－α（TNF－α）production of Raw264.7 cells have been also studied by MTT Method，Neutral Red Method，Griess Reaction and Enzyme－Linked Immunosorbent Method（ELISA）.The results indicated that RBP and RBP2a could increase anti－tumor effect through the hostmediated pathway.Compared with the control group，RBP and RBP2a significantly enhanced the release of NO（4.67 times and 6.36 times）and TNF－α（441.1 times and 465.5 times）at 250μg／mL.Therefore，immune－mediated inhibition rate（45.55%）on B16 was 4.58 times higher than the direct inhibition rate（8.16%）at250μg／mL of RBP.Further，sulfated polysaccharide（SRBP－B，SRBP－D and SRBP2a－B）enhanced the anti－tumor activity by directly inhibiting B16.Sulfated polysaccharide（SRBP－B，SRBP－D and SRBP2a－B）could inhibit B16 proliferation while exhibit remarkably tumor－inhibitory rates（73.65%，65.53%and 82.43%）at1 000μg／mL.Meanwhile，SRBP－B，SRBP－D and SRBP2a－B significantly enhanced the release of NO and TNF－α.However，nonetheless，Raw 264.7 cellswere inhibited and revealed relatively lower survival rates（83.26%，81.80%and 79.78%）at500μg／mL.

rice bran polysaccharide，sulfated polysaccharide rice bran polysaccharide，immunomodulatory，anti－tumor activity

Q2

A

1003－0174（2015）03－0035－06

國(guó)家自然科學(xué)基金（31101383）

2013－11－20

朱麗丹，女，1988年出生，碩士，谷物活性物質(zhì)

陳正行，男，1960年出生，教授，糧食精深加工