王婕瓊，尹婷婷，李澤庚

（1．湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430065，2．安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230012）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）主要累及肺臟，但也可引起全身或肺外的不良效應(yīng)，是臨床常見病、多發(fā)病，嚴(yán)重危害人類健康［1］。COPD患者伴發(fā)肺動(dòng)脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）占80%左右，PAH是COPD發(fā)展到肺源性心臟病的中心環(huán)節(jié)，易導(dǎo)致右心衰竭和死亡，嚴(yán)重影響COPD患者的病程、生活質(zhì)量和預(yù)后。肺血管收縮是肺血管阻力增加引起肺動(dòng)脈高壓的主要機(jī)制，其形成過程較為復(fù)雜，正確認(rèn)識(shí)COPD的病程，抑制肺血管收縮，防止PAH等并發(fā)癥的產(chǎn)生對(duì)防治COPD具有重要現(xiàn)實(shí)意義［2］。有研究［3－5］表明，肺血管活性物質(zhì)的調(diào)節(jié)機(jī)制在肺血管重建和缺氧性肺動(dòng)脈收縮發(fā)病過程中作用重大，在COPD產(chǎn)生PAH 過程中產(chǎn)生重要作用。本研究通過應(yīng)用臨床防治COPD并發(fā)PAH的有效方藥，觀察其對(duì)模型大鼠血清鈣調(diào)節(jié)蛋白－2（calmodulin－2，CAM－2）及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的影響。

1 材料

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用清潔級(jí)健康Wistar雄性大鼠280只，雄性，6月齡，體質(zhì)量為（230±20）g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（皖）2012－0006。

1．2 藥物 芪白平肺膠囊：由黃芪、生曬參、川芎、薤白、葶藶子、五味子、地龍組成，每片0．4g，由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心提供，生產(chǎn)批號(hào)為BZ20080023；尼可地爾：每片5mg，中外制藥株式會(huì)社生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)為H20060401；0．9%生理鹽水。

1．3 主要試劑及儀器 動(dòng)物強(qiáng)迫游泳裝置、熏煙箱：安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院研制；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)低氧裝置：長(zhǎng)沙華曦電子科技有限公司；紅梅牌香煙：焦油含量13mg，煙堿含量1．0mg，紅塔卷煙集團(tuán)生產(chǎn)；洗板機(jī)：普朗DNX－9620型；37℃溫箱；酶標(biāo)儀：型號(hào) WD－2102A；大鼠 CAM－2、VEGF ELISA檢測(cè)試劑盒：美國(guó)Sigma公司。

2 方法

2．1 模型復(fù)制方法 參照李澤庚等［6］的方法，每日將大鼠放入（43±1）℃的恒溫水槽中強(qiáng)迫游泳30 min，后置于熏煙箱內(nèi)煙熏1h，最后將大鼠置于常壓低氧裝置內(nèi)7h，氧濃度控制在（10±0．5）%。每周6次，第7天暫停，連續(xù)4周。

2．2 動(dòng)物分組和處理方法 隨機(jī)將280只大鼠分為模型組60只、正常組60只、芪白平肺膠囊預(yù)防組（芪預(yù)組）40只、芪白平肺膠囊治療組（芪治組）40只、尼可地爾預(yù)防組（尼預(yù)組）40只，尼可地爾治療組（尼治組）40只。從實(shí)驗(yàn)第一天開始，對(duì)除正常組之外的各組大鼠按上述方法復(fù)制模型，每日模型復(fù)制結(jié)束后灌胃。模型組、正常組每日用生理鹽水10 mL／kg灌胃，于實(shí)驗(yàn)第4周末、第8周末、第12周末各取材20只。預(yù)防組在復(fù)制模型同時(shí)進(jìn)行藥物干預(yù)，灌胃4周后取材20只大鼠，剩下20只大鼠停止灌胃再正常喂養(yǎng)4周后（即實(shí)驗(yàn)第8周末）取材。模型復(fù)制成功后對(duì)治療組進(jìn)行藥物干預(yù)，灌胃4周后（即實(shí)驗(yàn)第8周末）取材20只大鼠，剩下20只停止灌胃再正常喂養(yǎng)4周后（即實(shí)驗(yàn)第12周末）取材。灌胃藥物劑量：芪白平肺膠囊藥液10mL／kg（每毫升含芪白平肺膠囊內(nèi)容物50mg，相當(dāng)于臨床劑量7倍），尼可地爾10mL／kg（每毫升含尼可地爾0．3mg，相當(dāng)于臨床劑量7倍）。取內(nèi)容物藥粉用生理鹽水配成所需濃度的混懸液，給藥容量均為10mL／kg。

2．3 血清CAM－2和VEGF的測(cè)定 大鼠經(jīng)腹腔注射3．4%水合氯醛（10mL／kg）麻醉后，于腹主動(dòng)脈采血2～3mL，低溫離心（3 000r／min，4℃）20 min，取上清液保存于－80℃冰箱待用，用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定。

2．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述。由于這是多因素非平衡設(shè)計(jì)的組合實(shí)驗(yàn)，因此按照研究目的拆分成3個(gè)組合分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。①對(duì)照組和模型組：采用兩因素方差分析考察時(shí)間和模型因素對(duì)相關(guān)指標(biāo)的影響；②模型組、芪預(yù)組、尼預(yù)組：采用兩因素方差分析考察時(shí)間和預(yù)防性給藥對(duì)相關(guān)指標(biāo)的影響；③模型組、芪治組、尼治組：采用兩因素方差分析考察時(shí)間和治療性給藥對(duì)相關(guān)指標(biāo)的影響。簡(jiǎn)單效應(yīng)分析采用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行均數(shù)的多重比較。P＜0．05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3．1 模型和時(shí)間因素對(duì)大鼠血清CAM－2、VEGF含量的影響 兩因素方差分析結(jié)果（表1）顯示，模型因素和時(shí)間因素對(duì)大鼠血清CAM－2和VEGF水平的主效應(yīng)及其交互作用均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。簡(jiǎn)單效應(yīng)分析結(jié)果（表2）顯示，實(shí)驗(yàn)第12周時(shí)，正常組CAM－2水平顯著高于第8周時(shí)和第4周時(shí)，而各時(shí)間VEGF水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）；模型組在實(shí)驗(yàn)第8周和第12周時(shí)，血清CAM－2和VEGF水平均較前一時(shí)點(diǎn)顯著變化（P＜0．05）；各時(shí)點(diǎn)模型組血清CAM－2水平均較對(duì)照組顯著降低（P＜0．05），VEGF水平均較對(duì)照組顯著升高（P＜0．05）。可以推斷，模型因素可以降低大鼠血清CAM－2水平，升高血清VEGF水平，模型因素對(duì)血清CAM－2和VEGF的影響與時(shí)間有關(guān)。

表1 模型和時(shí)間因素對(duì)大鼠血清CAM－2、VEGF影響的兩因素方差分析結(jié)果

3．2 藥物預(yù)防和時(shí)間因素對(duì)模型大鼠血清CAM－2、VEGF含量的影響 兩因素方差分析結(jié)果（表3）顯示，藥物預(yù)防和時(shí)間因素對(duì)模型大鼠血清CAM－2和VEGF的主效應(yīng)及其交互作用均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。簡(jiǎn)單效應(yīng)分析結(jié)果（表4）顯示，與同時(shí)間模型組比較，尼預(yù)組和芪預(yù)組大鼠血清CAM－2水平顯著升高（P＜0．05），而血清VEGF水平顯著降低（P＜0．05）。與同時(shí)間尼預(yù)組比較，芪預(yù)組CAM－2水平顯著升高（P＜0．05），VEGF水平顯著降低（P＜0．05）?？梢酝茢?，尼可地爾和芪白平肺膠囊預(yù)防給藥可升高模型大鼠血清CAM－2水平，降低血清VEGF水平，且以芪白平肺膠囊的作用為優(yōu)，芪白平肺膠囊的遠(yuǎn)期效應(yīng)較明顯。

表2 模型和時(shí)間因素對(duì)大鼠血清CAM－2、VEGF的影響（±s）

表2 模型和時(shí)間因素對(duì)大鼠血清CAM－2、VEGF的影響（±s）

注：與同時(shí)間正常組比較，＊P＜0．05；與同組4周末比較，＃P＜0．05；與同組8周末比較，△P＜0．05。

4周末 正常2 0 3 1．0 8±2．6 6 4 0．1 4±1．5 2模型 2 0 1 7．3 5±0．6 9＊ 1 7 1．9 4±3．4 2＊8周末 正常 2 0 3 0．9 2±1．9 3＃ 3 8．8 5±1．5 0模型 2 0 1 8．6 6±0．7 3＊＃ 1 7 7．8 2±2．7 1＊＃1 2周末 正常 2 0 2 9．5 1±1．8 8?！?3 9．1 1±1．6 1模型 2 0 1 2．1 4±0．6 6＊?！?1 8 1．4 0±2．2 0＊?！?/p>

3．3 藥物治療和時(shí)間因素對(duì)模型大鼠血清CAM－2、VEGF水平的影響 兩因素方差分析結(jié)果（表5）顯示，藥物治療和時(shí)間因素對(duì)模型大鼠血清CAM－2和VEGF的主效應(yīng)及其交互作用均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。簡(jiǎn)單效應(yīng)的方差分析結(jié)果（表6）顯示，與同一時(shí)點(diǎn)模型組比較，芪治組和尼治組大鼠血清 CAM－2水平顯著升高（P＜0．05），VEGF水平顯著降低（P＜0．05）；在實(shí)驗(yàn)第12周，芪治組大鼠血清VEGF水平顯著低于尼治組（P＜0．05）。與實(shí)驗(yàn)第8周時(shí)比較，模型組第12周時(shí)CAM－2水平顯著降低（P＜0．05），模型組和尼治組第12周時(shí)VEGF水平顯著升高（P＜0．05），而芪治組第12周時(shí)CAM－2和VEGF水平均無明顯變化（P＞0．05）?？梢酝茢?，芪白平肺膠囊和尼可地爾治療性給藥均可升高模型大鼠血清CAM－2水平，降低血清VEGF水平，芪白平肺膠囊降低血清VEGF的遠(yuǎn)期效應(yīng)優(yōu)于尼可地爾。

表3 藥物預(yù)防和時(shí)間因素對(duì)模型大鼠血清CAM－2、VEGF影響的兩因素方差分析結(jié)果

表4 藥物預(yù)防和時(shí)間因素對(duì)模型大鼠血清CAM－2、VEGF的影響（±s）

表4 藥物預(yù)防和時(shí)間因素對(duì)模型大鼠血清CAM－2、VEGF的影響（±s）

注：與同時(shí)間模型組比較，＊P＜0．05；與同時(shí)間尼預(yù)組比較，＃P＜0．05；與同組4周末比較，△P＜0．05。

時(shí)間 分組 n C A M－2／（p g／m L） V E G F／（p g／m L）4周末 模型2 0 1 7．3 5±0．6 9 1 7 1．9 4±3．4 2尼預(yù) 2 0 2 0．8 5±1．1 1＊ 5 0．3 3±3．0 9＊芪預(yù) 2 0 2 6．8 3±1．2 5＊＃ 5 1．0 5±2．3 9＊8周末 模型 2 0 1 8．6 6±0．7 3△ 1 7 7．8 2±2．7 1△尼預(yù) 2 0 2 3．3 9±2．3 0＊△ 7 0．5 2±2．3 4＊△芪預(yù) 2 0 2 8．2 8±2．2 8＊?！?5 0．9 9±2．6 7＊＃

4 討論

《素問·靈蘭秘典論》記載：“肺者，相傅之官，治節(jié)出焉。”意指肺氣具有治理調(diào)節(jié)呼吸及全身氣血津液運(yùn)行的作用。COPD反復(fù)發(fā)作、長(zhǎng)期不愈，傷肺耗氣，陽氣微弱而失助心行血之職，致使肺氣虛而失治節(jié)，水液不循常道而凝聚為痰，血液運(yùn)行無力而停滯為瘀，終成痰瘀阻肺之證。因此，COPD的治節(jié)失常的典型證候?yàn)樘叼鲎璺巫C，符合COPD并發(fā)PAH階段的臨床證候表現(xiàn)。益氣化痰祛瘀方“芪白平肺膠囊”，以“治節(jié)重建”為理念，由黃芪、生曬參、川芎、薤白、葶藶子、五味子、地龍組成。方中黃芪、生曬參補(bǔ)益脾肺之元?dú)?，合為君藥，共奏益氣之功；“血中氣藥”川芎具有行氣活血之效，薤白理氣通陽，葶藶子行水消腫，瀉肺平喘，三者共為臣藥。五味子酸甘斂陰，能上斂肺氣，下滋腎陰，為治療久咳虛喘之要藥。地龍通行經(jīng)絡(luò)，清肺定喘，功在佐使。諸藥合用，共奏益氣、溫陽、化痰、散瘀之功［7］。

結(jié)合既往研究成果，筆者認(rèn)為COPD痰瘀阻肺證相當(dāng)于COPD致PAH階段。肺血管內(nèi)皮細(xì)胞通過多種途徑分泌各種血管活性物質(zhì)調(diào)節(jié)自身生長(zhǎng)，這在肺血管收縮導(dǎo)致PAH的發(fā)病機(jī)制中作用十分重要。研究［8］表明，當(dāng)血管活性物質(zhì)一旦被激活，氣道、肺實(shí)質(zhì)和肺血管釋放大量炎性遞質(zhì)，肺小動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞受到損害，發(fā)生功能紊亂，調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞異常增生肥大，引起管壁增生、管腔狹窄、平滑肌增殖、管壁膠原纖維沉積，導(dǎo)致肺血管收縮，最終形成低氧性PAH。因此，有必要深入研究肺血管活性物質(zhì)在PAH產(chǎn)生過程中的作用機(jī)制。

表5 藥物治療和時(shí)間因素對(duì)模型大鼠血清CAM－2、VEGF影響的兩因素方差分析結(jié)果

表6 藥物治療和時(shí)間因素對(duì)模型大鼠血清CAM－2、VEGF的影響（±s）

表6 藥物治療和時(shí)間因素對(duì)模型大鼠血清CAM－2、VEGF的影響（±s）

注：與同時(shí)間模型組比較，＊P＜0．05；與同時(shí)間尼治組比較，＃P＜0．05；與同組8周末比較，△P＜0．05。

時(shí)間 分組 n C A M－2／（p g／m L） V E G F／（p g／m L）8周末 模型2 0 1 8．6 6±0．7 3 1 7 7．8 2±2．7 1尼治 2 0 2 0．2 3±2．7 0＊ 5 2．1 3±2．3 8＊芪治 2 0 2 0．3 5±1．9 2＊ 5 1．4 2±2．6 4＊1 2周末 模型 2 0 1 2．1 4±0．6 6△ 1 8 1．4 0±2．2 0△尼治 2 0 2 0．3 5±2．4 1＊ 7 1．7 2±2．7 7＊△芪治 2 0 1 9．5 0±1．5 2＊ 5 0．2 3±2．9 8＊＃

CAM－2是存在于肺血管平滑肌真核細(xì)胞中的一種調(diào)節(jié)蛋白，參與平滑肌細(xì)胞的興奮－收縮偶聯(lián)過程。在維持平滑肌細(xì)胞膜的穩(wěn)定性方面有重要的作用。CAM－2能調(diào)節(jié)平滑肌的收縮和舒張。靜息狀態(tài)下CAM－2無活性，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度升高到一定程度，與其細(xì)胞內(nèi)受體鈣調(diào)素結(jié)合形成Ca2＋－CaM復(fù)合物才具有生物活性。后者通過一系列磷酸化過程引起肺血管平滑肌細(xì)胞收縮，使血管平滑肌對(duì)各種刺激的敏感性增高，收縮力加強(qiáng)。引起肺血管平滑肌的肥厚和細(xì)胞增殖［9］。

VEGF是可以促進(jìn)肺部平滑肌內(nèi)血管形成的一種多肽。其有兩大生物學(xué)功能：一是增加肺血管通透性，是已知最強(qiáng)的肺血管通透劑，二是生成肺血管功能。研究［10］發(fā)現(xiàn)，VEGF越高，肺血管平滑肌收縮的速度越快，并且VEGF拮抗物的應(yīng)用能直接抑制肺血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和分化，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，分泌多種組織蛋白酶，介導(dǎo)遷移和浸潤(rùn)，抑制肺血管收縮。

本研究表明，芪白平肺膠囊和尼可地爾均可調(diào)節(jié)COPD痰瘀阻肺證模型大鼠血清CAM－2和VEGF的異常，且芪白平肺膠囊預(yù)防性給藥和治療性給藥的效果均優(yōu)于尼可地爾，說明益氣化痰祛瘀方藥芪白平肺膠囊的近期療效和遠(yuǎn)期效應(yīng)更佳，作用效果更持久。臨床上長(zhǎng)期應(yīng)用芪白平肺膠囊治療COPD取得較好療效［11－13］，可降低PAH，提高生活質(zhì)量。其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)肺血管活性物質(zhì)，干預(yù)肺血管收縮有關(guān)，這尚需進(jìn)一步深入探討。

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