蔣林惠，姜　麗，徐　銀，許　昕，郁志芳

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京210095）

甜椒果實總蛋白質(zhì)雙向電泳優(yōu)化體系的建立

蔣林惠，姜麗，徐銀，許昕，郁志芳*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京210095）

以甜椒果實“紅方”為實驗材料，對其果實總蛋白制備方法、蛋白提取液的pH、總蛋白的上樣量、IPG膠條的pH范圍及等電聚焦程序進(jìn)行條件優(yōu)化，建立了適用于甜椒果實總蛋白分析的雙向電泳體系。結(jié)果表明，采用提取液為pH7.8的酚提法制備的甜椒果實總蛋白、17cm pH5～8的IPG膠條、上樣1200μg進(jìn)行66000VH等電聚焦和垂直凝膠電泳，經(jīng)過考馬斯亮藍(lán)G-250膠體考染后得到可用于進(jìn)一步質(zhì)譜分析的電泳圖譜，圖譜的蛋白點分布均勻、背景清晰、分辨率高。經(jīng)統(tǒng)計，其總蛋白點達(dá)到703±17個。

甜椒果實，蛋白質(zhì)組學(xué)，雙向電泳

甜椒（Capsicum annuum L.）又名菜椒，是茄科辣椒屬辣椒的一個變種，分布較廣，屬于“非人工引種栽培”類型植物[1]。甜椒果實富含維生素C、微量元素和維生素K，是餐桌上的常見蔬菜。甜椒果實因采后仍是一個生命有機體故生理代謝活動依舊旺盛，貯運過程中易出現(xiàn)失水、衰老、腐爛等現(xiàn)象[2-3]，嚴(yán)重影響果實的食用品質(zhì)和商品性。目前，甜椒果實采后的相關(guān)研究主要集中在不同保藏方式對甜椒果實保鮮的影響，其內(nèi)容涉及到貨架期[4]、感官品質(zhì)[5]、抗氧化成分[6-7]、能量代謝產(chǎn)物[8]等。

近年來，果實采后相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)的研究已經(jīng)開展起來。Linda等[9]對不同成熟度的草莓進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)研究，鑒定出8種與成熟相關(guān)的蛋白。Yun等[10]研究發(fā)現(xiàn)4℃下不同貯藏期的柑橘有56個差異蛋白，其與糖代謝、氨基酸代謝、環(huán)境脅迫等有關(guān)。Zhang等[11]對桃果實進(jìn)行熱處理實驗，其30個差異蛋白主要與脅迫反應(yīng)和防御、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、蛋白代謝、能量代謝、成熟衰老相關(guān)，還有大概17%為功能未知。利用雙向電泳技術(shù)將會為果蔬采后生理的研究帶來更多的便利，然而原料品種的差異性需要針對性地優(yōu)化雙向電泳體系，以便獲得優(yōu)質(zhì)的電泳圖譜和可靠的實驗結(jié)果。

目前對于辣椒蛋白質(zhì)組學(xué)的研究僅有植株葉片病害蛋白質(zhì)變化[12]、果實發(fā)育過程辣胎盤的蛋白差異[13]、有色體蛋白組分析[14]及甜椒果實的冷害機制研究[15]等，適用于甜椒果實的雙向電泳體系仍有待優(yōu)化。本研究期望通過甜椒果實總蛋白制備、雙向電泳程序、上樣量等雙向電泳體系優(yōu)化為后續(xù)果實成熟衰老機理和調(diào)控機制的深入研究提供技術(shù)平臺。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

實驗材料為“紅方”甜椒果實，甜椒采后立即運回實驗室，充分散去田間熱后，選擇果形整齊、大小均勻一致、無病蟲害、無機械損傷且成熟度一致的果實作為實驗材料；固化pH梯度干膠條（IPG）、兩性電解質(zhì)（Bio-Lyte）、碘代乙酰胺（IAA）、四甲基乙二胺（TEMED）等購自美國Bio-Rad公司；二硫蘇糖醇（DTT）、丙烯酰胺（Arc）、NN-甲叉雙丙烯酰胺（Bis）、二甲氨基丙磺酸（CHAPS）、低熔點瓊脂糖（LMP）、考馬斯亮藍(lán)G-250、尿素（Urea）、硫脲（Thiourea）、甘氨酸（Glycine）、β-巰基乙醇（β-Me）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、礦物油（Mineral oil）、過硫酸銨（Aps）、Tris-平衡酚等購自Sigma公司；三氯乙酸（TCA）、丙酮、甲醇、乙酸銨、硫酸銨、牛血清蛋白（BSA）等購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，分析純。

等電聚焦電泳系統(tǒng)Protein I 12 IEF美國伯樂公司；高重復(fù)性高通量大型垂直電泳EttanDALT Twelve GE-061-TY7119、Image ScannerⅢ掃描儀28-9076-07美國通用電氣公司；DJ300精密電子天平北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；GL-20G-Ⅱ高速冷凍離心機上海安亭科學(xué)儀器廠；85-1恒溫磁力攪拌器、HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋常州國華電器有限公司；Orion86802臺面式pH/ISE測試儀上海納锘儀器有限公司；XW-80A微型旋渦混合儀上海滬西分析儀器廠有限公司；WFJ UV-2802 PC紫外-可見分光光度計尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1蛋白質(zhì)制備方法

1.2.1.1TCA-丙酮法[16]果實樣品在進(jìn)行液氮研磨時加入2%（w/w）PVPP除酚。

1.2.1.2TCA丙酮-SDS法參照張麗等[17]的方法并稍加改進(jìn)。用液氮研磨果肉時加2%（w/w）PVPP除酚。SDS緩沖液稍有改動（緩沖液中含有33mmol·L-1Tris-HCl（pH7.8），7.5%（w/v）蔗糖，5%（v/v）β-巰基乙醇，2%（w/v）SDS）。

1.2.1.3酚提法結(jié)合Shi Y等[18]的方法。果實樣品進(jìn)行液氮研磨是加入2%（w/w）PVPP除酚，蛋白提取液pH7.8。

1.2.1.4TCA丙酮-酚提法根據(jù)Wang等[19]的方法加以改進(jìn)。果實樣品在用液氮研磨時加入2%（w/w）PVPP除酚。SDS提取液pH7.8，配方同1.2.1.2。

1.2.2蛋白質(zhì)的溶解每5g樣品所得蛋白干粉加入400μL的蛋白質(zhì)裂解液（7mol/L urea，2mol/L thiourea，4%（w/v）CHAPS，1%（w/v）DTT和0.5%（v/v）pH3～10IPG Buffer），在4℃下至沉淀完全溶解，4℃下10000×g離心30min，取上清液進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，其余上清液分離備用。

1.2.3蛋白質(zhì)含量的測定采用Bradford[20]方法（略有修改）進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測定。

標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：1mg/mL牛血清蛋白，-20℃分裝1mL離心管中，每次使用取一份。

每次定量取10只10mL的試管，每管加入3mL染色劑1～7管中分別加入0～100μL不等的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，另外3個管子分別加入10μL的待測樣品，并用超純水將反應(yīng)體系補全至3.1mL。避光反應(yīng)10min，在5～20min內(nèi)595nm下測定反應(yīng)液的吸光值。根據(jù)前7管的濃度和吸收值的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2＞0.999。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=3.3507x2+4.8259x-0.0447計算樣品蛋白質(zhì)含量。

1.2.4雙向電泳

1.2.4.1等電聚焦[17]第一向等電聚焦在等電聚焦儀上進(jìn)行，其上樣水化液體積為340μL，泡漲30min之后，每根膠條上覆蓋3mL礦物油，50V電壓下進(jìn)行13h的泡漲。泡漲之后設(shè)置好等電聚焦程序，開始聚焦。聚焦結(jié)束的膠條，立即進(jìn)行平衡及第二向垂直電泳。

表1　17cm膠條的甜椒果實總蛋白雙向電泳等電聚焦程序Table.1　The isoelectric focusing programme of the sweet pepper fruit’s total protein 2-DE with 17cm IPG strips

1.2.4.2IPG膠條的平衡[17]取出IPG膠條，超純水清洗，濾紙晾干，后置于5mL膠條平衡緩沖液Ⅰ搖晃15min；平衡液Ⅱ進(jìn)行平衡也是同樣的操作。

表2　甜椒果實總蛋白雙向電泳等電聚焦優(yōu)化程序Table.2　The isoelectric focusing programme of the sweet pepper fruit’s total protein 2-DE

1.2.4.3第二向SDS-PAGE平衡結(jié)束后，進(jìn)行第二向SDS-PAGE垂直電泳。膠濃度為12g/dL，電泳方式為恒功率，16℃冷水循環(huán)。起始恒功率1W/gel，1h后恒功率15W/gel進(jìn)行到溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到底部邊緣時即可。

1.2.4.4染色染色方法采用改良膠體考馬斯亮藍(lán)G-250染色法。在超純水清洗后，加入固定液（甲醇∶乙酸∶水=4∶1∶5）固定2h，之后加入染色液（0.12%G-250、10%（v/v）磷酸、10%（w/v）硫酸銨、20%（v/v）甲醇）染色過夜，然后用脫色液（甲醇∶乙酸∶水=1∶1∶8）脫色至蛋白點清晰可見，凝膠背景清晰為止。

1.2.5凝膠圖像采集與分析采用美國GE公司凝膠成像系統(tǒng)（Image ScannerⅢ掃描儀）對凝膠進(jìn)行圖像掃描，并用PDQuest 2-DE 8.0分析軟件對圖像進(jìn)行分析。

1.2.6數(shù)據(jù)處理與分析雙向電泳實驗進(jìn)行3次重復(fù)實驗，實驗數(shù)據(jù)采用EXCEL軟件進(jìn)行誤差分析，數(shù)值表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。

2　結(jié)果與分析

2.1不同總蛋白的制備方法對甜椒果實蛋白質(zhì)2-DE圖譜的影響

采用四種蛋白制備方法獲取甜椒果實總蛋白，所得果實蛋白質(zhì)含量如表3所示。從蛋白提取量來看，相對于其他方法，酚提法所得蛋白含量最高，而TCA-丙酮法所得蛋白含量低，無法獲得足夠的量進(jìn)行雙向電泳實驗。

結(jié)合圖1發(fā)現(xiàn)，酚提法所得雙向電泳圖譜橫紋較少，蛋白點分布均勻、清晰且無明顯的拖尾現(xiàn)象；TCA丙酮-酚法電泳圖譜蛋白點稍有縱向拖尾，整體分離效果略次于酚提取法；TCA丙酮-SDS法電泳圖譜蛋白點比較淺，不夠清晰，不利于后期進(jìn)行蛋白差異點的質(zhì)譜分析。本實驗選擇酚提法進(jìn)行甜椒果實總蛋白的制備，這與蘋果果實[18]的研究結(jié)果相一致，而桃果實[17]和茭白[21]總蛋白所使用的也是酚提法，但其蛋白提取液的成分等與本實驗仍有差異。番茄果實[22]的蛋白提取方法又不同于本實驗所研究的提取方法。番茄子葉[23]的實驗研究則發(fā)現(xiàn)，TCA丙酮沉淀法較適用。因此，不同的材料適用的蛋白提取方法是有差別的。本研究的以下實驗均以酚提法獲得的蛋白進(jìn)行電泳體系研究。另外，在進(jìn)行總蛋白提取時，根據(jù)樣品含有酚類物質(zhì)的情況考慮適當(dāng)添加PVPP，用于去除酚類物質(zhì)，提高總蛋白的純度。總蛋白提取的緩沖液成分也可以根據(jù)材料的特殊性進(jìn)行適當(dāng)?shù)男薷?，例如更換不同的蛋白酶抑制劑從而提高總蛋白的產(chǎn)量及質(zhì)量。

圖1　3種不同提取方法所得甜椒果實雙向電泳圖譜Fig.1　Comparison of 2-DE maps of sweet pepper fruit with different protein extraction

2.2提取液不同pH條件對甜椒果實蛋白質(zhì)2-DE圖譜的影響

提取液pH對蛋白提取率及后續(xù)雙向電泳實驗均有顯著影響，進(jìn)行材料的總蛋白提取時，提取液pH會因?qū)ο蟛煌兴町?。參考Paloma Sánchez-Bel[15]提取液pH，并結(jié)合文獻(xiàn)Mariapina Rocco[24]、Cristina Barsan[25]設(shè)定蛋白提取液pH梯度7.5、7.8、8.5。實驗結(jié)果表明，3種蛋白提取液對蛋白得率的影響不大，具體得率分別是（835.41±33.52）、（830.72±11.41）、（882.93±42.00）μg/g。以提取所得蛋白進(jìn)行雙向電泳，pH7.5、7.8、8.5的條件提取的蛋白點分別約521± 33、696±15、622±18（圖2）。pH7.8的蛋白提取液所提蛋白進(jìn)行雙向電泳之后所得蛋白點個數(shù)最多。提取液的pH為7.8時，其所提蛋白的雙向電泳圖譜的清晰度及蛋白點的質(zhì)量均為優(yōu)良，無明顯的橫紋和低分子蛋白的縱向拖尾的現(xiàn)象（圖2）。選擇pH7.8作為甜椒總蛋白提取液的pH，與Sánchez-Bel的研究結(jié)果一致[15]。其他的研究發(fā)現(xiàn)，番茄果實[22]的蛋白提取液pH為7.5，桃果實[17]為8.35，香蕉果實[26]為9.0，不同材料所選用的較適合的蛋白提取液pH有所差異，具體pH需根據(jù)實際實驗確定。

圖2　提取液不同pH條件對甜椒果實蛋白質(zhì)2-DE圖譜的影響Fig.2　Comparison of 2-DE maps of sweet pepper fruit with different extracts pH conditions

表3　不同制備方法所獲總蛋白質(zhì)產(chǎn)量Table.3　The totel protein output of different protein extraction

2.3不同上樣量對甜椒果實蛋白質(zhì)2-DE圖譜的影響

上樣量不僅關(guān)系到蛋白點的個數(shù)、圖譜的分辨率和清晰度等，同時也關(guān)系到實驗結(jié)果的可靠性。因植物果實的特殊性，低豐度蛋白不容易在圖譜中表現(xiàn)，適當(dāng)增加上樣量有利于低豐度蛋白出現(xiàn)。相反上樣量過高則使高豐度蛋白斑點掩蓋低豐度蛋白斑點，反而檢測到的蛋白點減少[23]。蛋白樣品的上樣量與膠條的長度及pH范圍有一定的聯(lián)系，本實驗所使用的IPG膠條的長度為17cm，根據(jù)產(chǎn)品說明書其承載蛋白樣品水化液不大于400μL，蛋白樣品約含量1000μg。同時參考文獻(xiàn)[17，27]，本研究設(shè)定800、1200、1400μg三個上樣量進(jìn)行雙向電泳實驗，2-DE圖譜分析得三個上樣量檢出的蛋白點個數(shù)分別約706±10、717±17、655±26。圖3表明，上樣量為1200μg時，蛋白點數(shù)目最多、低豐度蛋白點也能被檢出，且蛋白點分布均勻、沒有明顯拖尾現(xiàn)象、圖譜最為清晰，能滿足后續(xù)質(zhì)譜分析的需要。文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，桃果實[17]的上樣量選定為800μg，蘋果果實[18]的上樣量是1800μg，不同的物種進(jìn)行雙向電泳實驗時，其上樣量有所差異，這可能與總蛋白的成分有關(guān)。

2.4不同pH范圍膠條對甜椒果實蛋白質(zhì)2-DE圖譜的影響

由圖4可見，pH3～10的電泳圖譜上蛋白點個數(shù)約456±27，其蛋白點較為集中，多點重疊，不能盡可能多的將蛋白點檢測出來；pH5～8和pH4～7的電泳圖譜蛋白點數(shù)分別約731±11和720±20。pH梯度為5～8和4～7的IPG膠條比pH梯度3～10的蛋白點增加了60.3%和57.8%。由此可見，窄pH梯度的IPG膠條能大幅度的提高蛋白的分辨率。對pH4～7和pH5～8的雙向電泳圖譜進(jìn)一步分析，pH4～7的電泳圖譜在pH4～5部分基本無蛋白點，蛋白點在pH5～7部分較為密集，使得一些等電點相近的蛋白難以得到有效的分離；而pH5～8的雙向電泳圖譜其蛋白點分布均勻，故而pH 5～8更適合用于辣椒的雙向電泳。另外，pH4～7和pH5～8的電泳圖譜堿性端出現(xiàn)垂直的條紋，這種垂直的條紋是膠條pH范圍的限制。當(dāng)pH＞7或8時圖譜中黑色垂直條紋是蛋白質(zhì)被壓縮的現(xiàn)象。雖然這會使得一部分蛋白信息丟失，但其圖譜的分辨率和靈敏率得到一定的提高。綜合以上分析表明，甜椒果實總蛋白在pH5～8的區(qū)域有最好的展現(xiàn)，因此選用pH5～8的IPG膠條進(jìn)行后續(xù)的實驗分析。本實驗結(jié)果與黃勁松等[27]在蕨菜總蛋白雙向電泳的研究結(jié)果相一致，而不同于桃[17]和番茄[22]果實總蛋白雙向電泳體系中IPG膠條的選擇。

圖3　不同上樣量對甜椒果實蛋白質(zhì)2-DE圖譜的影響Fig.3　Comparison of 2-DE maps of sweet pepper fruit with different different loading amount

圖4　不同pH范圍的IPG膠條對甜椒果實總蛋白雙向電泳圖譜的影響Fig.4　Comparison of 2-DE maps of sweet pepper fruit with three IPG strips with different gradients

2.5不同等電聚焦程序?qū)μ鸾饭麑嵉鞍踪|(zhì)2-DE圖譜的影響

第一向的等電聚焦程序是關(guān)鍵步驟，其從膠條進(jìn)行水化泡漲到快速升壓都可以根據(jù)樣品的實際情況進(jìn)行分步設(shè)定，從而將不同等電點的蛋白較好的分離。等電聚焦電泳是在連續(xù)、穩(wěn)定的pH梯度中進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離，等電聚焦時間的長短對蛋白質(zhì)的分離有直接的影響。雙向電泳圖譜上橫向或縱向的條紋，蛋白點形狀、圖譜的分辨率和重復(fù)性等都與之相關(guān)。本實驗設(shè)定了三種聚焦程序，主要研究高壓聚焦時間對雙向電泳圖譜的影響，三種等電聚焦程序所得的雙向電泳圖譜蛋白點個數(shù)分別約Ⅰ617±22、Ⅱ703±17、Ⅲ592±16（表2和圖5）。分析圖5，聚焦程序Ⅰ的電泳圖譜上蛋白點的橫向拖尾及橫紋略多于程序Ⅱ，Ⅱ和Ⅲ這方面的差異不明顯。結(jié)合蛋白點個數(shù)及圖譜的分辨率、清晰程度及實驗成本等，發(fā)現(xiàn)程序Ⅱ更適合甜椒總蛋白的雙向電泳實驗。其等電聚焦程序與植物方面的相關(guān)研究[28]接近，但因植物的個體特異性具體的程序并不完全一致。相關(guān)文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，Chiara D’Ambrosio等[29]在杏果實的蛋白組學(xué)研究中采用52000VH，蘋果果實[18]采用60000VH，不同的品種根據(jù)其研究選擇合適的等電聚焦程序。

圖5　不同等電聚焦程序?qū)μ鸾饭麑嵉鞍踪|(zhì)2-DE圖譜的影響Fig.5　Comparison of 2-DE maps of sweet pepper fruit with different isoelectro-focusing procedures

3　結(jié)論

采用提取液為pH7.8的酚提取法提取甜椒果實總蛋白，在等電聚焦66000VH條件下，用17cm pH5～8的IPG膠條上樣1200μg進(jìn)行等電聚焦電泳。SDSPAGE的凝膠濃度為12g/dL，經(jīng)過考馬斯亮藍(lán)G-250膠體考染后得到電泳圖譜。經(jīng)分析，這種雙向電泳條件檢測出的蛋白點個數(shù)約有703±17，蛋白點分布均勻，無明顯拖尾現(xiàn)象，橫向和縱向的條紋不明顯，背景清晰且分辨率高，重復(fù)性較好，能滿足后續(xù)質(zhì)譜分析的需要，同時也可以為辣椒蛋白組研究提供借鑒。

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Optimization of two-dimensional electrophoresis conditions for total protein study of sweet pepper fruit（Capsicum annuum L.）

JIANG Lin-hui，JIANG Li，XU Yin，XU Xin，YU Zhi-fang*
（College of Food Science&Technology，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China）

A two-dimensional electrophoresis system for total protein from sweet pepper（cv.‘Hongfang’）fruits was established，including optimal conditions of total protein extraction method，pH value of the extract buffer，pH range of IPG strips，loading amount and isoelectric focusing procedure.The results showed that the best image of picture as indicated by protein spot uniformity and background clearness as well as protein point resolution was obtained at pH7.8 for extract buffer and by adopting phenol extraction method，and loading 1200μg protein to 17cm IPG strip of pH5～8 and isoelectric focusing at 66000VH followed by SDS-PAGE，and finally detecting proteins with coomassie brilliant blue G-250 staining.The established two-dimensional electrophoresis system could meet the needs of the subsequent mass spectrometry analysis.The total protein spots in the image of pictures were around 703±17.

sweet pepper fruit；proteomics；two-dimensional electrophoresis

TS255.1

A

1002-0306（2015）04-0084-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.009

2014－05－26

蔣林惠（1990-），女，在讀碩士研究生，研究方向：采后生物學(xué)。

郁志芳（1960-），男，博士，教授，研究方向：果蔬采后生物學(xué)與貯藏加工研究。

長三角地區(qū)設(shè)施蔬菜高產(chǎn)高效生產(chǎn)（2014030232）。