董克武 黎 路

（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司，上海 200233）

發(fā)酵食品是利用有益微生物加工制造的一類食品，具有獨(dú)特的風(fēng)味和一些特異性營養(yǎng)因子，有些功能性發(fā)酵食品因具有某種生理活性物質(zhì)還可以起到調(diào)節(jié)機(jī)體生理功能的作用［1］。常見的發(fā)酵食品有氨基酸、有機(jī)酸、酶制劑、酵母、淀粉及淀粉糖、多元醇和特種功能的發(fā)酵制品等。發(fā)酵食品的生產(chǎn)過程需要利用微生物體的代謝作用，并借助于對(duì)代謝過程的控制來獲得所需產(chǎn)品，其中包括大量復(fù)雜的生化反應(yīng)和遷移現(xiàn)象，不同種類的微生物利用碳水化合物、蛋白質(zhì)等原料，采用不同的代謝途徑產(chǎn)生各種代謝產(chǎn)物［2］。生物發(fā)酵反應(yīng)代謝過程中的參數(shù)變化，如：溫度、酸堿性、氧化還原電位、溶解氧、尾氣組分等，是發(fā)酵過程狀態(tài)的實(shí)時(shí)反映。在現(xiàn)代化的食品研究和生產(chǎn)中，為了獲得更好的產(chǎn)品和更高的產(chǎn)率，提升市場(chǎng)競爭力，就需要通過在線監(jiān)測(cè)實(shí)時(shí)跟蹤這些發(fā)酵過程關(guān)鍵參數(shù)的變化，實(shí)施調(diào)控優(yōu)化發(fā)酵過程［3］。

1 尾氣分析的意義

在溫度、pH、溶解氧、尾氣組分等參數(shù)中，尾氣組分濃度的變化反映了整個(gè)發(fā)酵過程中物質(zhì)的變化情況，尤其對(duì)于耗氧和兼性好氧發(fā)酵來說，尾氣中CO2和O2的變化，反映了發(fā)酵過程中微生物的代謝狀態(tài)和代謝途徑，已經(jīng)被作為衡量發(fā)酵水平的重要指標(biāo)氣體［4，5］。通過在線檢測(cè)CO2和O2的變化，可以計(jì)算獲得攝氧率（oxygen uptake rate，OUR）、二氧化碳釋放速率（carbon-dioxide escape rate，CER）、呼吸熵（respiratory quotient，RQ）等呼吸代謝參數(shù)。OUR是單位時(shí)間、單位體積發(fā)酵液中細(xì)胞消耗的氧氣量，CER是單位時(shí)間、單位體積發(fā)酵液中細(xì)胞釋放的二氧化碳量，RQ是CER除以O(shè)UR所得的商［6］，這些指標(biāo)直接反映了細(xì)胞的生長代謝狀態(tài)，對(duì)于發(fā)酵狀態(tài)識(shí)別、供氧控制優(yōu)化、流加補(bǔ)料以及故障預(yù)判等，都具有指導(dǎo)意義。尤其在工業(yè)發(fā)酵的放大過程中，大罐和小罐的細(xì)胞代謝特性是否一致是放大成功與否的關(guān)鍵，而要達(dá)到此目標(biāo)，細(xì)胞代謝相關(guān)的宏觀生理參數(shù)尤為重要，這些參數(shù)在工業(yè)規(guī)模的發(fā)酵大罐中與實(shí)驗(yàn)小罐一致時(shí)，發(fā)酵過程的放大就會(huì)取得成功［7］。

2 尾氣分析的主要方法

目前，發(fā)酵尾氣的檢測(cè)方法主要有基于紅外和順磁原理的尾氣分析儀［8］和過程氣體質(zhì)譜分析儀［9，10］。尾氣分析儀只能檢測(cè)氧氣和二氧化碳的含量，采樣密度也不能太大，一臺(tái)儀器一般僅能同時(shí)監(jiān)測(cè)四路發(fā)酵尾氣。而近年來，過程氣體質(zhì)譜分析技術(shù)悄然興起，并具有很好的應(yīng)用潛力。與尾氣分析儀相比，過程氣體質(zhì)譜分析儀具有分析速度快、檢測(cè)精度高、可監(jiān)測(cè)通道數(shù)多、可同時(shí)檢測(cè)多種氣體組分等優(yōu)勢(shì)［11］。早在20世紀(jì)90年代，就已經(jīng)有質(zhì)譜儀應(yīng)用于啤酒酵母的研究中［9］，對(duì)攝氧率進(jìn)行測(cè)定。

過程氣體質(zhì)譜分析儀是基于先進(jìn)的質(zhì)譜技術(shù)原理，不僅能夠進(jìn)行快速、準(zhǔn)確和高靈敏度的檢測(cè)，還提供了解未知物質(zhì)結(jié)構(gòu)的途徑，在研究反應(yīng)機(jī)理和監(jiān)測(cè)反應(yīng)過程的應(yīng)用中發(fā)揮重要作用。其基本原理和分析過程是：氣體分子進(jìn)入離子源，經(jīng)電離形成不同質(zhì)荷比（m/z）的離子，由于不同離子在磁場(chǎng)或電場(chǎng)的運(yùn)動(dòng)軌跡不同，離子在質(zhì)量分析器中按照質(zhì)荷比分開，依次到達(dá)檢測(cè)器而得到質(zhì)譜圖，根據(jù)離子豐度及豐度比得到樣品的分析結(jié)果［12］。因此質(zhì)譜儀的分析速度非?？?，可達(dá)到ms級(jí)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于尾氣分析儀的響應(yīng)速度，在多通道檢測(cè)應(yīng)用中具有顯著優(yōu)勢(shì)。一臺(tái)質(zhì)譜儀即可同時(shí)監(jiān)測(cè)多臺(tái)發(fā)酵罐，根據(jù)發(fā)酵尾氣檢測(cè)周期的需要，可以同時(shí)監(jiān)測(cè)十幾甚至幾十個(gè)發(fā)酵位點(diǎn)（見圖1）。對(duì)于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)來說，大大降低了設(shè)備的購置費(fèi)用。除此以外，質(zhì)譜技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)全組分氣體分析，除了O2、CO2之外，還可同時(shí)提供N2、Ar等無機(jī)氣體及多種有機(jī)氣體定性定量結(jié)果，為研究發(fā)酵食品尾氣組分，指導(dǎo)和調(diào)控產(chǎn)品生產(chǎn)，提供更全面的數(shù)據(jù)支持。

圖1 質(zhì)譜儀多通道監(jiān)測(cè)示意圖Figure 1 Online multi-stream off-gas analysis with process mass spectrometer

3 尾氣分析在發(fā)酵食品中的應(yīng)用

3.1 氨基酸

氨基酸發(fā)酵在發(fā)酵工業(yè)中占有重要地位，其發(fā)酵生產(chǎn)菌大多數(shù)為需氧菌或兼性厭氧菌，發(fā)酵液中的氧是菌體生長與代謝的必需品，因此，對(duì)發(fā)酵過程中氧的調(diào)控極為重要，尾氣中O2和CO2的含量可作為實(shí)際控制的參考指標(biāo)［13］。

谷氨酸是目前世界上產(chǎn)量最大的氨基酸，它不僅是日用調(diào)味品味精、雞精的主體，同時(shí)也是其他氨基酸制品、多種化學(xué)品、醫(yī)藥品、保健食品的重要原料，應(yīng)用非常廣泛［14］。肖杰等［15］在對(duì)RQ控制在谷氨酸發(fā)酵過程中的應(yīng)用研究中發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)節(jié)操作條件，可改變產(chǎn)酸期的RQ水平，如果將發(fā)酵過程中的RQ值控制在較低水平（0.5），TCA循環(huán)通量可被控制在合理水平上，谷氨酸脫氫酶的高活力同時(shí)也得到保持，在這種較低水平的RQ調(diào)控條件下，可以獲得較高水平的谷氨酸發(fā)酵產(chǎn)酸率和糖轉(zhuǎn)化率。

賴氨酸是人體所必須的8種氨基酸之一，目前采用最多的是液態(tài)生物發(fā)酵法進(jìn)行生產(chǎn)，亦屬于耗氧發(fā)酵，檢測(cè)氧的含量對(duì)發(fā)酵工藝優(yōu)化和放大具有重要意義［16］。在發(fā)酵過程中，通過提高初始糖濃度和選育解除反饋抑制的高產(chǎn)菌株兩種方式，都可以將發(fā)酵單位提高一定水平，但是如果在發(fā)酵過程中進(jìn)行控制，將基質(zhì)更多地轉(zhuǎn)化為目標(biāo)產(chǎn)物，提高發(fā)酵過程的轉(zhuǎn)化率，不僅提升了效率，發(fā)酵成本也進(jìn)一步降低［17，18］。

3.2 酶制劑

酶制劑由于具有高效、專一和作用條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，在食品加工等行業(yè)得到越來越廣泛的應(yīng)用。國內(nèi)外正在使用或開發(fā)的酶制劑常用有α－淀粉酶、半纖維素酶、葡萄糖氧化酶、蛋白酶、脂酶、植酸酶等［19］。

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是近年迅速發(fā)展起來的一種優(yōu)秀的真核表達(dá)系統(tǒng)，在表達(dá)異源蛋白上具有諸多優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于酶制劑發(fā)酵生產(chǎn)中，在高密度發(fā)酵方面具有巨大潛力［20］。畢赤酵母具有強(qiáng)烈的好氧生長偏愛性，在發(fā)酵過程中保證氧的供給是提高發(fā)酵產(chǎn)量的重要因素，僅靠溶氧往往不能獲得足夠的供氧信息，尤其在溶氧為零的時(shí)候。質(zhì)譜儀測(cè)定OUR可直接反映出供氧狀態(tài)，既可避免細(xì)胞因供氧不足發(fā)生代謝異常從而導(dǎo)致產(chǎn)率降低，也可避免過供氧引起的能量消耗以及對(duì)細(xì)胞可能造成的傷害。另外，畢赤酵母在發(fā)酵過程中需要利用甲醇誘導(dǎo)外源蛋白的表達(dá)［21］，而甲醇由于其沸點(diǎn)低、易揮發(fā)的特點(diǎn)導(dǎo)致其易隨尾氣帶出，質(zhì)譜儀是通用型檢測(cè)儀器，可以通過增加特征監(jiān)測(cè)離子實(shí)現(xiàn)對(duì)尾氣中甲醇含量的測(cè)定，為畢赤酵母發(fā)酵過程控制提供更為豐富的參考數(shù)據(jù)［22］。

木聚糖酶是一類水解植物材料中半纖維素的內(nèi)切酶，可用于食品、保健品等。張潔等［23］在以木霉菌作為生產(chǎn)菌株，以麩皮和木屑為培養(yǎng)基，在2L柱式反應(yīng)器中固態(tài)培養(yǎng)木聚糖酶的過程研究中，在線監(jiān)測(cè)尾氣中CO2，發(fā)現(xiàn)其含量變化與菌體生長和產(chǎn)酶均有密切關(guān)系。對(duì)尾氣中的CO2進(jìn)行在線檢測(cè)，獲得固態(tài)發(fā)酵過程中菌體生長和酶生產(chǎn)的動(dòng)態(tài)信息，從而可以進(jìn)一步建立過程控制模型，為工藝優(yōu)化提供可靠依據(jù)。

3.3 有機(jī)酸

有機(jī)酸包括乳酸、檸檬酸、葡萄糖酸等，均是常用的食品添加劑。

乳酸具有很強(qiáng)的防腐保鮮功效，不但可以抑菌、延長食品保鮮期，還有調(diào)味、保持食品色澤和提高產(chǎn)品質(zhì)量等作用。王然明等［24］在乳酸發(fā)酵工藝控制研究中，應(yīng)用過程質(zhì)譜儀分析尾氣，對(duì)于乳酸發(fā)酵過程代謝進(jìn)行分析，利用質(zhì)譜儀分析尾氣對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵乳酸過程進(jìn)行微耗氧發(fā)酵供氧水平的精確控制，將菌體的攝氧率控制在0.70mmol/（L·h）時(shí)，凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵乳酸的最佳合成速率可以達(dá)到2.78g/（L·h）。該研究還發(fā)現(xiàn)，尾氣數(shù)據(jù)也是乳酸發(fā)酵終點(diǎn)判斷的有力依據(jù)，根據(jù)實(shí)時(shí)尾氣數(shù)據(jù)獲得生理參數(shù)的趨勢(shì)變化，及時(shí)判定發(fā)酵終點(diǎn)，并對(duì)發(fā)酵過程副產(chǎn)物的代謝進(jìn)行分析，對(duì)提升乳酸產(chǎn)品質(zhì)量控制起到了非常關(guān)鍵的作用。質(zhì)譜儀提供的尾氣數(shù)據(jù)對(duì)于乳酸發(fā)酵產(chǎn)量和質(zhì)量均有提高，并可實(shí)現(xiàn)在線控制。

檸檬酸在食品工業(yè)上廣泛用作酸味劑、增溶劑、緩沖劑、抗氧化劑等，被稱為第一食用酸味劑，主要通過黑曲霉利用糖類發(fā)酵生成。對(duì)其代謝途徑分析，發(fā)現(xiàn)RQ是關(guān)鍵參數(shù)，反映了底物利用情況、胞內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)通量，與檸檬酸的產(chǎn)量明顯相關(guān)，二氧化碳的釋放速率隨著檸檬酸合成速率的增加而迅速下降［25］。因此在檸檬酸的合成過程中，通過在線監(jiān)測(cè)尾氣數(shù)據(jù)來指導(dǎo)供氧，以控制二氧化碳的羧化利用，從而提高檸檬酸產(chǎn)量和增加轉(zhuǎn)化率，對(duì)于檸檬酸的生產(chǎn)效率和成本控制有重要指導(dǎo)意義［26］。

4 結(jié)論與展望

通過監(jiān)測(cè)食品發(fā)酵過程的尾氣含量，尋找其中的敏感參數(shù)，從而獲得發(fā)酵過程的最佳干預(yù)點(diǎn)，對(duì)于優(yōu)化發(fā)酵過程、提高產(chǎn)量有著重要的指導(dǎo)意義。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，質(zhì)譜儀為發(fā)酵食品過程監(jiān)測(cè)提供了更為豐富的數(shù)據(jù)［27］。另一方面，隨著中國科學(xué)儀器行業(yè)的快速發(fā)展，國產(chǎn)過程氣體質(zhì)譜分析儀也已在生物發(fā)酵尾氣監(jiān)測(cè)中廣泛應(yīng)用，如：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司自主研發(fā)的SHP8400PMS過程氣體質(zhì)譜分析儀，不僅性能達(dá)到了國際先進(jìn)水平，還針對(duì)發(fā)酵行業(yè)的應(yīng)用特點(diǎn)完善了系統(tǒng)解決方案。過程氣體質(zhì)譜分析儀由于其快速響應(yīng)、數(shù)據(jù)全面的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，在發(fā)酵食品在線尾氣分析中的應(yīng)用必將越來越受到關(guān)注，為食品發(fā)酵工藝優(yōu)化和過程控制提供可靠的數(shù)據(jù)支持。

1 杜鵬，霍貴成.傳統(tǒng)發(fā)酵食品及其營養(yǎng)保健功能［J］.中國釀造，2004（3）：6～8.

2 梁華正，張燮，饒軍，等.微生物揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生途徑及其質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)［J］.中國生物工程雜志，2008，28（1）：124～133.

3 高暢，高樹賢，李華，等.發(fā)酵過程檢測(cè)技術(shù)［J］.中外葡萄與葡萄酒，2002（5）：56～58.

4 Wang Yong，Chu Ju，Zhuang Ying－ping，et al.Industrial bioprocess control and optimization in the context of systems biotechnology［J］.Biotechnology Advances，2009，27（6）：989～995.

5 張嗣良.發(fā)酵過程多水平問題及其生物反應(yīng)器裝置技術(shù)研究——基于過程參數(shù)相關(guān)的發(fā)酵過程優(yōu)化與放大技術(shù)［J］.中國工程科學(xué)，2001（3）：37～45.

6 劉仲匯，史建國，朱思榮，等.尾氣在線檢測(cè)分析在發(fā)酵中的應(yīng)用［J］.發(fā)酵科技通訊，2014，41（4）：32～35.

7 張嗣良.發(fā)酵工程原理［M］.北京：高等教育出版社，2013.

8 姜長洪，宗學(xué)軍，姜楠，等.在線分析儀表在發(fā)酵工程中的應(yīng)用［J］.儀表技術(shù)與傳感器，2000（12）：39～41.

9 范代娣，俞俊棠.以搖瓶所得攝氧率為基準(zhǔn)進(jìn)行發(fā)酵放大［J］.生物工程學(xué)報(bào)，1996，12（3）：301～306.

10 Patrick N Royce，Nina F Thornhill.Analysis of noise and bias in fermentation oxygen uptake rate data［J］.Biotechnology and Bioengineering，1992（40）：634～637.

11 黎亮，張嗣良，莊英萍，等.在線質(zhì)譜儀在工業(yè)發(fā)酵過程優(yōu)化與放大中的應(yīng)用［J］.分析儀器，2012（4）：103～105.

12 陳耀祖，涂亞平.有機(jī)質(zhì)譜原理及應(yīng)用［M］.北京：科學(xué)出版社，2004.

13 于信令，于軍.氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)的調(diào)控優(yōu)化［J］.發(fā)酵科技通訊，2006，35（1）：28～30.

14 張克旭.氨基酸發(fā)酵工藝學(xué)［M］.北京：中國輕工業(yè)出版社，1992.

15 Xiao Jie，Shi Zhong－ping，Gao Pei，et al.On-line optimization of glutamate production based on balanced metabolic control by RQ［J］.Bioprocess Biosyst Eng，2006（29）：109～117.

16 Zimmermann H F，Anderleit，Büchs J，et al.Oxygen limitation is a pitfall during screening for industrial strains［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2006，72（6）：1 157～1 160.

17 Hua Qiang，F(xiàn)u Peng-Cheng，Yang Chen，et al.Microaerobic lysine fermentations and metabolic flux analysis［J］.Biochemical Engineering Journal，1998（2）：89～100.

18 Teresa Lopez-Arenas，Omar Anaya-Reza，Rodolfo Quintero-Ramírez，et al.Modelling，simulation and dynamic analysis of the L-lysine production process［J］.Computer Aided Chemical Engineering，2014（33）：1 723～1 728.

19 王睿，劉桂超.論我國酶制劑工業(yè)的發(fā)展［J］.畜牧與飼料科學(xué)，2011，32（1）：68～69.

20 李洪淼，王紅寧，許欽坤.畢赤酵母高密度發(fā)酵研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)通訊，2005，16（2）：212～212.

21 劉朋，黃曉晶.過程質(zhì)譜在生物發(fā)酵在線監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用［C］//閆成德.第四屆中國在線分析儀器應(yīng)用及發(fā)展國際論壇論文集.北京：［出版者不詳］，2011：429～432.

22 郭美錦，吳康華，莊英萍，等.重組巴氏畢赤酵母恒化培養(yǎng)動(dòng)力學(xué)及代謝遷移特性研究［J］.微生物學(xué)報(bào)，2001，41（5）：617～624.

23 張潔，吳克，劉斌，等.木聚糖酶固態(tài)罐發(fā)酵及尾氣在線測(cè)定［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2004，30（4）：22～26.

24 王然明，王澤鍵，田錫煒，等.生物過程尾氣質(zhì)譜儀在乳酸發(fā)酵工藝控制中的應(yīng)用［J］.華東理工大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2013，39（3）：289～295.

25 Anastassiadis S，Rehm H J.Continuous gluconic acid production by the yeast-likeAureobasidiumpullulansin a cascading operation of two bioreactors［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2006，73（3）：541～548.

26 王萍，王澤建，張嗣良.生理代謝參數(shù)RQ在指導(dǎo)發(fā)酵過程優(yōu)化中的應(yīng)用［J］.中國生物工程雜志，2013，33（2）：88～95.

27 Virpi Tarkiainen，Tapio Kotiaho，Ismo Mattila，et al.On-line monitoring of continuous beer fermentation process using automatic membrane inlet mass spectrometric system［J］.Talanta，2005，65（5）：1 254～1 263.