王 玲，梁 琪，宋雪梅，張 炎

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅省功能乳品工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070）

酪蛋白降解對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪苦味的影響

王 玲，梁 琪*，宋雪梅，張 炎

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅省功能乳品工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070）

針對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪的苦味缺陷，分別以小牛皺胃酶、微生物凝乳酶和木瓜蛋白酶制作的牦牛乳硬質(zhì)干酪為研究對(duì)象，利用尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳，研究牦牛乳硬質(zhì)干酪pH 4.6水不溶性酪蛋白的降解程度，且對(duì)成熟過(guò)程中的牦牛乳硬質(zhì)干酪苦味進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，探究牦牛乳硬質(zhì)干酪pH 4.6水不溶性酪蛋白降解對(duì)其苦味的影響。結(jié)果表明：牦牛乳硬質(zhì)干酪在成熟期間酪蛋白發(fā)生了明顯的降解，且αs-酪蛋白均比β-酪蛋白降解速率快。經(jīng)尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶制作的牦牛乳硬質(zhì)干酪pH 4.6水不溶性酪蛋白在Pre-αs-酪蛋白區(qū)域有較強(qiáng)的蛋白帶。木瓜蛋白酶制作的牦牛乳硬質(zhì)干酪pH 4.6水不溶性酪蛋白中αs-酪蛋白和β-酪蛋白降解程度均顯著或極顯著高于微生物凝乳酶和小牛皺胃酶制作的牦牛乳硬質(zhì)干酪（P＜0.05或P＜0.01），木瓜蛋白酶制作的牦牛乳硬質(zhì)干酪的苦味值極顯著高于微生物凝乳酶和小牛皺胃酶制作的牦牛乳硬質(zhì)干酪的苦味值（P＜0.01），通過(guò)主成分分析得出3 種凝乳酶制作牦牛乳硬質(zhì)干酪的苦味值和未降解β-酪蛋白和αs-酪蛋白含量成極顯著負(fù)相關(guān)。這為控制牦牛乳硬質(zhì)干酪品質(zhì)提供了理論參考。

牦牛乳硬質(zhì)干酪；酪蛋白降解；尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳；苦味；主成分分析

牦牛乳是中國(guó)青藏高原地區(qū)的特色資源，蛋白質(zhì)含量為5.6%，比荷斯坦牛乳高100.7%，而乳蛋白的組成以酪蛋白（casein，CN）為主，含量為84%[1]，且主要是αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白。酪蛋白的降解不僅影響干酪的產(chǎn)量和質(zhì)地，一定程度上對(duì)干酪的風(fēng)味也有較大的影響。大多數(shù)干酪成熟過(guò)程中，殘留的凝乳酶促使酪蛋白降解，凝乳酶過(guò)度水解酪蛋白會(huì)產(chǎn)生苦味[2-4]，苦味是蛋白質(zhì)水解不平衡產(chǎn)生苦味肽的積累結(jié)果。已有大量從凝乳酶降解酪蛋白的產(chǎn)物αs1-酪蛋白和β-酪蛋白中分離出苦味肽的報(bào)道[5]。Lowrie等[6]研究發(fā)現(xiàn)切達(dá)干酪中的苦味是由酪蛋白降解產(chǎn)生的部分寡肽引起的，因?yàn)樗鼈兒写罅康氖杷詺埢?。酪蛋白降解產(chǎn)物αs-酪蛋白和β-酪蛋白這兩種酪蛋白含有較高的疏水性氨基酸，因此，這兩種酪蛋白是苦味肽可能的來(lái)源。不同凝乳酶對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪酪蛋白降解程度不同。與動(dòng)物凝乳酶相比，植物和微生物凝乳酶對(duì)β-酪蛋白降解影響更大[7-11]。許多研究發(fā)現(xiàn)同種凝乳酶水解αs-酪蛋白比β-酪蛋白降解程度更大。國(guó)外就動(dòng)物凝乳酶制作干酪的酪蛋白降解研究報(bào)道較多，但對(duì)動(dòng)物凝乳酶、微生物凝乳酶和植物凝乳酶分別制作干酪的酪蛋白降解研究甚少。

近些年研究發(fā)現(xiàn)尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳（urea polyacrylamide gel electrophoresis，urea-PAGE）能夠分析干酪酪蛋白降解程度，且能定量測(cè)定干酪成熟過(guò)程中酪蛋白的降解程度[12]。與傳統(tǒng)的分析手段（高效液相色譜和聚丙烯酰胺凝膠電泳）相比，尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳能在較低的凝膠濃度下達(dá)到很好的分離效果，能夠很好地分析干酪成熟過(guò)程中酪蛋白降解的小分子多肽物質(zhì)。我國(guó)正處于干酪發(fā)展的起步階段，利用尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)不同凝乳酶制作干酪中酪蛋白降解產(chǎn)生苦味的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，尤其是針對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪酪蛋白降解的相關(guān)研究還處于空白階段。因此，本實(shí)驗(yàn)利用尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳研究不同凝乳酶（動(dòng)物、微生物和植物凝乳酶）分別制作牦牛乳硬質(zhì)干酪酪蛋白降解程度對(duì)干酪苦味的影響，旨在對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪酪蛋白的降解規(guī)律有較為明確的認(rèn)識(shí)，以期為今后指導(dǎo)牦牛乳干酪生產(chǎn)和控制干酪質(zhì)量提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小牛皺胃酶（酶活力10 000 U/g） 蘭州百靈生物技術(shù)有限公司；微生物凝乳酶（酶活力20 000 U/g） 甘肅華羚生物技術(shù)研究中心；木瓜蛋白酶（酶活力80 000 U/g）上海源葉生物科技有限公司；嗜熱發(fā)酵劑：保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌 丹麥丹尼斯克公司；αs-酪蛋白、β-酪蛋白 美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

三羥基氨基甲烷、丙烯酰胺、N,N’-甲叉雙丙烯酰胺、過(guò)硫酸銨、四甲基乙二胺、考馬斯亮藍(lán)G-250、溴酚藍(lán)、鹽酸、甲醇、冰乙酸等其他常用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

125L干酪壓榨槽 上海翰強(qiáng)儀器設(shè)備廠；E-201-9 pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器公司；TGL-20臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 中國(guó)長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；HWS26型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司；真空冷凍干燥機(jī) 上海姚氏儀器設(shè)備廠；電泳儀和電泳槽 美國(guó)Bio-Rad公司；Tanon Gis2010凝膠圖像分析系統(tǒng) 上海天能科技有限公司。

1.3 方法

分別制作3 種酶活力相當(dāng)?shù)哪槊福ㄐ∨０櫸该?、微生物凝乳酶、木瓜蛋白酶）牦牛乳硬質(zhì)干酪，用尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳分別測(cè)定貯藏在10 ℃條件下的6 個(gè)成熟階段（30、60、90、120、150、180 d）中3 種凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪的pH 4.6水不溶性酪蛋白的降解程度，并對(duì)成熟過(guò)程中的干酪苦味進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

1.3.1 牦牛乳硬質(zhì)干酪制作工藝

原料乳→過(guò)濾→檢驗(yàn)→巴氏殺菌（63 ℃，30 min）→冷卻（35 ℃）→添加發(fā)酵劑（0.062 5 g/100 mL）→添加CaCl2（0.03 g/100 mL）→添加凝乳酶→凝乳→切割→二次加熱→排乳清→攪拌、加鹽（凝塊的2%）→堆釀（30 min）→壓榨成型（4～5 h）→真空包裝→成熟

1.3.2 干酪pH 4.6水不溶性酪蛋白的制備

分別稱(chēng)取5 g干酪，加入15 mL去離子水均質(zhì)。混合物于40 ℃條件下放置1 h，室溫條件下放置15 min。在磁力攪拌的作用下，用1 mol/L鹽酸調(diào)混合物至pH 4.6?；旌衔镌? ℃、4 000×g條件下離心20 min。沉淀用1 mmol/L醋酸銨（pH 4.6）沖洗一次，在4 ℃、3 000×g條件下離心10 min，收集沉淀進(jìn)行真空冷凍干燥，干燥的粉末稱(chēng)質(zhì)量，樣品冷凍保存?zhèn)溆肹13]。

1.3.3 尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳[14-15]

分離膠：T 12.5%，C 4%；分離膠緩沖溶液：4.6 g三羥基氨基甲烷和26 g尿素，加入0.4 mL的濃鹽酸，調(diào)節(jié)pH值至8.9，定容至100 mL。12 g丙烯酰胺、0.5 g N,N’-甲叉雙丙烯酰胺、50 μL四甲基乙二胺和40 mg過(guò)硫酸銨溶于100 mL pH 8.9的分離膠緩沖溶液。

濃縮膠：T 4.2%，C 5%；濃縮膠緩沖溶液：0.75 g三羥基氨基甲烷和26 g尿素，加入0.4 mL的濃鹽酸，調(diào)節(jié)pH值至7.6，定容至100 mL。2 g丙烯酰胺、0.1 g N,N’-甲叉雙丙烯酰胺、25 μL四甲基乙二胺和20 mg過(guò)硫酸銨溶于100 mL pH 8.9的濃縮膠緩沖溶液。

電泳緩沖液：15 g三羥基氨基甲烷和73 g甘氨酸溶解在5 L的水中，預(yù)電泳電壓為80 V，樣品進(jìn)入分離膠后調(diào)到120 V。

樣品溶解液：0.75 g三羥基氨基甲烷和28 g尿素，加入0.4 mL的濃鹽酸定容至100 mL。樣品處理：分別取5 mg凍干樣品溶解到3 mL的樣品溶解液中，滴入2 滴溴酚藍(lán)溶液，充分混勻，樣品在沸水中煮沸5 min，待冷卻后上樣。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)染色，甲醇冰醋酸溶液脫色。用天能圖像分析系統(tǒng)對(duì)電泳圖片進(jìn)行掃描分析，得譜帶的積分光密度值和樣品中各蛋白的百分含量。

1.3.4 牦牛乳硬質(zhì)干酪苦味值的測(cè)定

感官評(píng)定小組由經(jīng)過(guò)篩選的9 人組成（男女比例為4∶5，均為不吸煙者），品嘗時(shí)，評(píng)價(jià)員用蒸餾水漱口，取1.5 cm×1.5 cm×1.5 cm大小的干酪置于口中，5～10 s后吐出。根據(jù)品嘗的情況，然后按照表1的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)每種干酪打分，評(píng)分值就是苦味值，得出的平均值表示干酪的苦味[16]。

表1 苦味值的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Evaluation standards of bitterness

感官評(píng)價(jià)之前，分別取干酪樣品在4 ℃過(guò)夜解凍，然后21 ℃放置1 h。以不同質(zhì)量濃度的硫酸奎寧溶液為參比（0.002 3、0.004 6、0.009 4、0.018 8 g/L），對(duì)干酪的苦味進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理，分別對(duì)凝乳酶種類(lèi)和成熟時(shí)間進(jìn)行單因素方差分析，LSD法進(jìn)行差異顯著性分析。對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪酪蛋白降解指標(biāo)和干酪苦味值做了相關(guān)性分析，且對(duì)凝乳酶種類(lèi)和成熟時(shí)間進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果

圖1 3 種凝乳酶牦牛乳干酪成熟過(guò)程中pH 4.6水不溶性酪蛋白變化的尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳圖Fig.1 Urea-PAGE of pH 4.6-insoluble casein from yak milk hard cheeses prepared w ith calf rennet, microbial rennet and papain throughout ripening

由圖1可知，干酪pH 4.6水不溶性酪蛋白分子質(zhì)量由大到小劃分為4 個(gè)條帶：γ-CN、β-CN、αs-CN、Pre-αs-CN。3 種凝乳酶制作的牦牛乳硬質(zhì)干酪pH 4.6水不溶性酪蛋白降解的電泳條帶不一致，原因是3 種凝乳酶對(duì)酪蛋白特定的酶切位點(diǎn)不同引起的[17]。木瓜蛋白酶牦牛乳硬質(zhì)干酪的αs-CN和β-CN降解高于微生物和小牛皺胃酶，這與Sanjuán等[18]的研究結(jié)果一致。3 種凝乳酶制作的牦牛乳硬質(zhì)干酪pH 4.6水不溶性酪蛋白中αs-CN均比β-CN降解強(qiáng)烈，這主要是因?yàn)棣羢-CN的降解是由凝乳酶的作用引起的，β-CN的降解是由血纖維素蛋白溶酶引起的，也受到凝乳酶小幅度的降解，而排乳清時(shí)把纖維素蛋白溶酶的激活劑和抑制劑排除了，使得β-CN的降解程度較弱[18]。木瓜蛋白酶制作的牦牛乳硬質(zhì)干酪pH 4.6水不溶性酪蛋白在Pre-αs-CN區(qū)域有較強(qiáng)的蛋白帶，這說(shuō)明木瓜蛋白酶制作的牦牛乳硬質(zhì)干酪中Pre-αs-CN區(qū)域的電泳遷移率最高，其次是微生物凝乳酶，小牛皺胃酶牦牛乳硬質(zhì)干酪較弱。這是由于木瓜蛋白酶對(duì)αs-CN的降解比小牛皺胃酶和微生物凝乳酶更強(qiáng)烈。另外，木瓜蛋白酶和微生物凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪中，Pre-αs-CN和γ-CN區(qū)域條帶的顏色隨著干酪的成熟逐漸加深。

2.2 牦牛乳硬質(zhì)干酪未降解β-酪蛋白水平的變化

圖2 3 種凝乳酶干酪成熟過(guò)程中未水解β-酪蛋白水平的變化Fig.2 Changes in residual β-CN of hard yak milk cheeses prepared with calf rennet, microbial rennet and papain during ri pening

由圖2可知，牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟過(guò)程中，隨成熟的進(jìn)行，3 種凝乳酶對(duì)β-CN的降解速率趨于平緩。成熟終點(diǎn)時(shí)，小牛皺胃酶、微生物凝乳酶和木瓜蛋白酶制作的牦牛乳硬質(zhì)干酪未水解β-CN含量分別是31.14%、25.74% 和19.78%。由方差分析可知，同一成熟時(shí)間，3 種凝乳酶對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪未水解β-CN含量影響極顯著（P＜0.01）；同一凝乳酶，不同成熟時(shí)間對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪未水解β-CN的含量影響極顯著（P＜0.01）。牦牛乳硬質(zhì)干酪整個(gè)成熟過(guò)程中，木瓜蛋白酶對(duì)β-CN降解極顯著高于微生物凝乳酶和小牛皺胃酶（P＜0.01），這與Galán等[19]研究荊棘薊制作的羊乳干酪β-CN降解極顯著高于小牛皺胃酶制作干酪的結(jié)果一致，這可能與引起木瓜蛋白酶牦牛乳硬質(zhì)干酪的苦味較強(qiáng)的有關(guān)。微生物凝乳酶使β-CN的降解顯著高于小牛皺胃酶（P＜0.01），這和Lawrence等[17]研究米黑毛霉切達(dá)干酪β-CN的降解比小牛皺胃酶制作干酪強(qiáng)烈的結(jié)果吻合。牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟過(guò)程中，β-CN主要由受血纖溶蛋白酶影響，血纖溶蛋白酶首先使β-CN降解，然后被微生物蛋白酶緩慢水解為γ1[β-CN（f29～209）]、γ2[β-CN（f106～209）]、γ3[β-CN（f108～209）]。隨成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，β-CN逐漸降解，γ-CN含量增加，干酪中殘留的凝乳酶也會(huì)導(dǎo)致β-CN的微小降解。

2.3 牦牛乳硬質(zhì)干酪未降解αs-酪蛋白水平的變化

圖3 3 種凝乳酶干酪成熟過(guò)程中未水解αs-酪蛋白的變化Fig.3 Changes in residual αs-CN of hard yak milk cheeses prepared with calf rennet, microbial rennet and papain during ripening

由圖3可知，3 種凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟過(guò)程中，凝乳酶種類(lèi)對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪的αs-CN降解有顯著影響（P＜0.05），成熟時(shí)間對(duì)其也有極顯著影響（P＜0.01 ）。成熟30 d之后，木瓜蛋白酶牦牛乳硬質(zhì)干酪αs-CN含量顯著低于其他兩種凝乳酶干酪（P＜0.05）。血纖維素蛋白酶、植物凝乳酶和動(dòng)物凝乳酶依次使αs-CN降解，這就使得木瓜蛋白酶牦牛乳硬質(zhì)干酪的αs-CN降解程度顯著高于小牛皺胃酶干酪[19]。αs-CN在Phe23-Phe24處斷裂，形成αs1-CN（f1～23）和αs2-CN（f24～199）[20-25]小片段。在成熟180 d時(shí)，小牛皺胃酶、微生物凝乳酶和木瓜蛋白酶制作的牦牛乳硬質(zhì)干酪未被水解的αs-CN含量分別為19.34%、14.43%和10.89%。3 種凝乳酶制作的牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟過(guò)程中，αs-CN和β-CN的降解程度并不相同，αs-CN的總體降解程度要大于β-CN。Visser[25]研究表明，在干酪Urea-PAGE電泳中，酪蛋白的降解速率主要是凝乳酶和乳中纖溶酶作用的結(jié)果。一般認(rèn)為，酪蛋白的初級(jí)降解主要是凝乳酶的作用。

2.4 牦牛乳硬質(zhì)干酪未降解αs-CN/β-CN值的變化

圖4 3 種凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟過(guò)程中未水解αs--CCNN//β-CCNN值變化Fig.4 Changes in residual αs-C N/β-CN of yak milk hard cheeses prepared with calf rennet, microbial rennet and papain during ripening

由圖4可知，成熟至180 d時(shí)，小牛皺胃酶、微生物凝乳酶和木瓜蛋白酶牦牛乳硬質(zhì)干酪αs-CN/β-CN值分別從0.87、0.79和0.81降低到0.62、0.56和0.55。木瓜蛋白酶牦牛乳硬質(zhì)干酪αs-CN/β-CN值最低，這與Fernández-Salguero等[26]研究動(dòng)物凝乳酶和植物凝乳酶羊乳干酪報(bào)道的αs-CN/β-CN值從0.9%降低到0.5%一致。由方差分析可知，同一成熟時(shí)間，3 種凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪未水解αs-CN/β-CN值差異顯著（P＜0.05）。成熟90 d之前，小牛皺胃酶牦牛乳硬質(zhì)干酪未水解αs-CN/β-CN值差異顯著（P＜0.05），之后不顯著（P＞0.05）。成熟前90 d，微生物凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪未水解αs-CN/β-CN值差異不顯著（P＞0.05），后期差異顯著（P＜0.05）。由此可以看出成熟時(shí)間和凝乳酶種類(lèi)對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪未水解αs-CN/β-CN值有顯著的影響。

2.5 牦牛乳硬質(zhì)干酪苦味感官評(píng)價(jià)

圖5 3 種凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪苦味感官評(píng)價(jià)Fig.5 Sensory evaluation of the bitterness of hard yak milk cheeses prepared with calf rennet, microbial rennet and papain

由圖5可知，隨成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，3 種凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪的苦味均呈緩慢加重趨勢(shì)。成熟前90 d，同一種凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪的苦味值差異不顯著（P＞0.05），成熟90 d之后，差異顯著（P＜0.05）。整個(gè)成熟過(guò)程中，凝乳酶種類(lèi)對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪苦味值影響差異極顯著（P＜0.01）。牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟180 d時(shí)，小牛皺胃酶、微生物凝乳酶和木瓜蛋白酶牦牛乳硬質(zhì)干酪苦味值分別從1.5、2和3升高到3、4和5。

2.6 牦牛乳硬質(zhì)干酪酪蛋白降解片段與苦味值的相關(guān)性分析

表2 牦牛乳硬質(zhì)干酪酪蛋白降解指標(biāo)與苦味值的相關(guān)性Table 2 Correlation between bitterness and casein degradation indices of hard yak milk cheese

由表2可知，牦牛乳硬質(zhì)干酪未降解的αs-CN含量和β-CN含量成極顯著正相關(guān)（r=0.791）、苦味值成極顯著負(fù)相關(guān)（r=－0.853），且與αs-CN/β-CN值成顯著正相關(guān)（r=0.584）。牦牛乳硬質(zhì)干酪未降解的β-CN含量與苦味值成極顯著負(fù)相關(guān)（r=－0.910）。未降解的β-CN含量對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪的苦味值的影響最大，其次是αs-CN含量，未降解酪蛋白αs-CN/β-CN值和牦牛乳硬質(zhì)干酪的苦味值無(wú)相關(guān)性。

2.7 牦牛乳硬質(zhì)干酪酪蛋白片段的主成分分析

圖6 3 種凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟過(guò)程中酪蛋白片段的主成分得分圖Fig.6 Score plots obtained from principal component analysis for casein fractions from hard yak milk cheeses prepared with calf rennet, microbial rennet and papain

由圖6可知，第一主成分占累計(jì)貢獻(xiàn)率的65.79%，反映了凝乳酶種類(lèi)對(duì)未降解αs-CN含量差異的顯著性有極大的貢獻(xiàn)，但凝乳酶種類(lèi)對(duì)未降解β-CN含量差異的顯著性也有貢獻(xiàn)。第二主成分占累計(jì)貢獻(xiàn)率的33.95%，反映了成熟時(shí)間對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪β-CN含量的影響。在牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟180 d時(shí)，小牛皺胃酶牦牛乳硬質(zhì)干酪中未降解β-CN的含量最高。同理，成熟時(shí)間對(duì)未降解αs-CN含量和αs-CN/β-CN值的差異顯著性有極大的貢獻(xiàn)。小牛皺胃酶牦牛乳硬質(zhì)干酪pH 4.6水不溶性酪蛋白部分主要分布在PC 1的評(píng)分正值附近、PC 2的評(píng)分負(fù)值附近，而微生物凝乳酶和木瓜蛋白酶制作的牦牛乳硬質(zhì)干酪pH 4.6水不溶性酪蛋白部分主要分布在PC 1的評(píng)分正值附近、PC 2的評(píng)分正值附近。說(shuō)明木瓜蛋白酶和微生物凝乳酶對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪αs-CN和β-CN降解速率更大。

3 結(jié) 論

苦味缺陷是牦牛乳硬質(zhì)干酪優(yōu)質(zhì)資源開(kāi)發(fā)的制約因素。干酪成熟過(guò)程中，殘留凝乳酶影響干酪酪蛋白的降解，其降解程度直接關(guān)系著干酪的苦味。通過(guò)研究不同凝乳酶制作的牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟期間酪蛋白的降解規(guī)律，發(fā)現(xiàn)不同凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪酪蛋白中未降解的αs-CN、β-CN含量以及干酪苦味值差異均極顯著（P＜0.01），且牦牛乳硬質(zhì)干酪酪蛋白中αs-CN均比β-CN降解強(qiáng)烈。木瓜凝乳酶制作的牦牛乳硬質(zhì)干酪酪蛋白中的αs-CN和β-CN降解程度顯著或極顯著高于微生物凝乳酶和小牛皺胃酶牦牛乳硬質(zhì)干酪（P＜0.05或P＜0.01），且β-CN的降解對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪的苦味值的影響最大，其次是αs-CN，αs-CN/β-CN值與干酪的苦味無(wú)關(guān)，表明干酪中殘留的凝乳酶降解酪蛋白中的β-CN產(chǎn)生苦味肽，使干酪產(chǎn)生苦味。本實(shí)驗(yàn)為調(diào)控牦牛乳硬質(zhì)干酪風(fēng)味缺陷提供了一定的理論依據(jù)，在干酪生產(chǎn)中應(yīng)選擇蛋白酶活力較小而凝乳能力較強(qiáng)的凝乳酶和能夠降解苦味肽的外肽酶。由于引起干酪苦味肽形成的原因極其復(fù)雜，導(dǎo)致引起干酪苦味的物質(zhì)仍然不是非常清楚，因此，干酪中苦味的產(chǎn)生機(jī)理及苦味成分的組成還有待進(jìn)一步研究。

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Effect of Casein Degradation on Bitterness of Hard Yak Milk Cheese

WANG Ling, LIANG Qi*, SONG Xuemei, ZHANG Yan (Functional Dairy Product Engineering Laboratory of Gansu, College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

In view of the bitter taste defect in hard yak milk cheese, calf rennet, microbial rennet and papain were used to prepare yak milk hard cheese in the present study to explore the degradation degree of pH 4.6 water-insoluble casein of hard yak milk cheese, as evaluated by urea-polyacrylamide gel electrophoresis (urea-PAGE) and sensory evaluation of bitterness during the ripening period, as well as explore the effect of degradation degree of pH 4.6 water-insoluble casein on bitterness of hard yak milk cheese. The results indicated that hard yak milk cheese casein revealed signifi cant degradation during the ripening period; moreover, αs-casein underwent much more extensive and faster degradation than β-casein. The pH 4.6 water-insoluble casein of hard yak milk cheese made with papain showed higher i ntensity ban ds in the Pre-αs-casein region as shown by urea-PAGE, while the degradation degree of αs-casein and β-casein was signifi cantly higher than that of pH 4.6 water-insoluble casein from hard yak milk cheeses pre pared with microbial rennet and calf rennet (P ＜ 0.05). The bitterness of hard yak milk cheese prepared with papain was signifi cantly higher than that obtained from microbial rennet and calf rennet (P ＜ 0.01). These results suggested that the contents of residual αs-casein and β-casein showed a highly signifi cant negative correlation with bitterness for three yak milk hard cheeses by principal component analysis. This investigation can provided a theor etical basis for the quality control of hard yak milk cheese.

hard yak milk cheese; casein degradation; urea-polyacrylamide gel electrophoresis (urea-PAGE); bitterness; principal component analysis

TS252.53

A

1002-6630（2015）19-0001-06

10.7506/spkx1002-6630-201519001

2014-12-19

國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（31260383）

王玲（1988-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槿橹破芳庸?。E-mail：1041842191@qq.com

*通信作者：梁琪（1969-），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称菲焚|(zhì)、乳品科學(xué)。E-mail：liangqi@gsau.edu.cn