章 園，宋江峰，何美娟，李大婧,3，劉春泉,3,*，陳潔瓊

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；3.國家蔬菜加工技術(shù)研發(fā)分中心，江蘇 南京 210014）

黃玉米籽粒發(fā)育過程中類胡蘿卜素與色澤的變化

章 園1,2，宋江峰2，何美娟1,2，李大婧2,3，劉春泉1,2,3,*，陳潔瓊1,2

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；3.國家蔬菜加工技術(shù)研發(fā)分中心，江蘇 南京 210014）

利用C30柱及高效液相色譜-二極管陣列檢測-大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜（high performance liquid chromatography atmospheric-diode array detection-atmospheric pressure chemical ionization-mass spectrometry，HPLC-DAD-APCI-MS）法，對黃玉米在籽粒形成期、乳熟期和蠟熟期主要類胡蘿卜素進(jìn)行定性、定量檢測，研究籽粒中類胡蘿卜素的積累規(guī)律，分析類胡蘿卜素各組分與色澤之間的關(guān)系。結(jié)果表明：整個發(fā)育過程中，黃玉米籽粒總類胡蘿卜素含量與色澤的變化趨勢基本一致，隨著成熟度的增加，總類胡蘿卜素含量不斷增加，籽粒逐漸變黃，其中乳熟期是類胡蘿卜素積累的關(guān)鍵時期。各類胡蘿卜素組分含量變化較大，花藥黃質(zhì)、玉米黃質(zhì)、葉黃素、α-隱黃質(zhì)和β-隱黃質(zhì)含量總體呈上升趨勢，而新黃質(zhì)含量一直下降，α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素含量變化不顯著。通過對類胡蘿卜素含量與色澤的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，玉米黃質(zhì)、花藥黃質(zhì)、α-隱黃質(zhì)及β-隱黃質(zhì)含量均與L*、a*、b*和C值成極顯著或顯著正相關(guān)，與H值成負(fù)相關(guān)。

黃玉米；類胡蘿卜素；發(fā)育；色澤

黃玉米（Zea mays L. ssp. mays）是國內(nèi)外普遍種植的玉米，除了含有豐富的淀粉和脂肪外，還含有多種氨基酸、微量元素和類胡蘿卜素，對人體具有重要的醫(yī)療保健功效[1]。其中，類胡蘿卜素具有良好的VA源活性、抗氧化、防癌、預(yù)防夜盲癥等活性功能。自然界中，僅植物和微生物可自行合成類胡蘿卜素，人類只能通過攝食獲取，水果和蔬菜是主要來源[2]。黃玉米中富含類胡蘿卜素，其含量大致在0.1～90 mg/kg，主要包括葉黃素（lutein）和玉米黃質(zhì)（zeaxanthin）等。類胡蘿卜素不僅是決定黃玉米外觀品質(zhì)的重要因子，也是衡量黃玉米籽粒內(nèi)在品質(zhì)的重要指標(biāo)[3]。發(fā)育過程中果蔬類胡蘿卜素組分與含量受內(nèi)源酶作用的影響存在差異，王偉杰等[4]認(rèn)為宮內(nèi)伊予柑在成熟過程中果皮α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素和葉黃質(zhì)等含量下降，β-隱黃質(zhì)及玉米黃質(zhì)含量上升，果實(shí)顏色由綠轉(zhuǎn)黃。熊作明等[5]發(fā)現(xiàn)枇杷果實(shí)著色期間葉黃素含量下降，α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、β-隱黃質(zhì)和玉米黃素成分均呈上升趨勢。李赫等[6]對不同成熟期枸杞中類胡蘿卜素變化規(guī)律的研究結(jié)果表明，隨著枸杞成熟度的增加，玉米黃素雙棕櫚酸酯含量逐漸增加，玉米黃素雙棕櫚酸酯是枸杞中類胡蘿卜素積累的主要形式。崔麗娜等[7]以黃、紅、黑、紫4 種不同顏色的玉米籽粒為研究對象，發(fā)現(xiàn)不同顏色的玉米色素組成、存在部位均有所不同，其中黃色玉米的色素主要是類胡蘿卜素。但目前對黃玉米籽粒在不同發(fā)育時期類胡蘿卜素各組分動態(tài)積累方面的研究很少。因此，本實(shí)驗(yàn)擬以‘蘇玉29’黃玉米為研究對象，對發(fā)育期間類胡蘿卜素含量、籽粒色澤的動態(tài)變化進(jìn)行監(jiān)測，以期明確黃玉米籽粒各類胡蘿卜素組分的變化特點(diǎn)，為探索類胡蘿卜素的積累和轉(zhuǎn)化規(guī)律提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試品種‘蘇玉29’于2013年5月種植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合動物科學(xué)基地實(shí)驗(yàn)田。從黃玉米開花抽絲期結(jié)束、籽粒形成第1天開始，每隔2～3 d采樣一次，每次選取授粉時間相同、大小均一的玉米10 穗，直至第35天蠟熟期結(jié)束，共取樣12 次。采摘后立即運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)液氮研磨成粉后迅速置于－80 ℃超低溫冰箱，以備類胡蘿卜素萃取使用。

標(biāo)準(zhǔn)品葉黃素、玉米黃質(zhì)、β-胡蘿卜素、β-隱黃質(zhì)美國Sigma公司；甲基叔丁基醚（methyl tert-butyl ether，MTBE）、甲醇（均為色譜純） 美國天地公司；正己烷、丙酮、甲苯、無水乙醇、無水硫酸鈉、氫氧化鉀等為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀、6530 Q-TOF精確質(zhì)量級四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀（大氣壓化學(xué)電離源（atmospheric pressure chemical ionization，APCI）） 美國Agilent公司；WSC-S型色差儀 上海精密科學(xué)儀器有限公司；冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、B-220恒溫水浴鍋 上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵 上海東璽制冷儀器設(shè)備有限公司；D10氮?dú)獯祾邇x 杭州奧盛儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 類胡蘿卜素提取及含量測定

1.3.1.1 類胡蘿卜素提取

準(zhǔn)確稱取3.0 g凍干玉米粉置于磨口錐形瓶中，加入30 mL正己烷-乙醇-丙酮-甲苯（10∶6∶7∶7，V/V）混合萃取液，靜置3～4 h，加入2 mL 40% KOH-甲醇溶液，搖勻后置于暗處25 ℃皂化16 h，將皂化液轉(zhuǎn)入分液漏斗，加30 mL正己烷，振蕩搖勻，再加入38 mL 10%硫酸鈉溶液，棄去下層液，收集上層溶液。重復(fù)處理2 次，混合上層溶液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，氮?dú)獯蹈桑? mL甲醇溶解，待高效液相色譜-二極管陣列檢測-質(zhì)譜（high performance liquid chromatography atmospheric-diode array detectionmasss pectrometry，HPLC-DAD-MS）分析。

1.3.1.2 HPLC-DAD-MS分析條件

HPLC條件：色譜柱為YMC-C30色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm），柱溫：25 ℃；流動相：A液為水-MTBE-甲醇（5∶25∶70，V/V），B液為水-MTBE-甲醇（5∶85∶10，V/V）；流速：0.6 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；檢測器：DAD，檢測波長450 nm，梯度洗脫條件見表1。

表1 HPLC梯度洗脫條件Table 1 HPLC gradient elution conditions

MS條件：色譜柱流出組分進(jìn)入質(zhì)譜儀的流速為10 μL/min；離子源：APCI+；m/z掃描范圍：80～1 000；毛細(xì)管電壓：2 500 V；干燥氣體體積：5 L；霧化氣壓：20 psi；汽化溫度：350 ℃；蒸汽溫度：400 ℃；電暈電流：4 μA。

1.3.1.3 類胡蘿卜素組分定性定量分析方法

對于有標(biāo)樣的組分，對照標(biāo)樣，利用保留時間的一致性進(jìn)行鑒定，基于外標(biāo)法構(gòu)建的回歸方程對樣品類胡蘿卜素各組分含量進(jìn)行量化分析。對于沒有標(biāo)樣的組分，利用DAD在波長200～600 nm范圍和質(zhì)譜的掃描結(jié)果對照相關(guān)文獻(xiàn)資料進(jìn)行鑒定。

根據(jù)文獻(xiàn)[8]報道的替換計算方法，對無標(biāo)品組分進(jìn)行定量時，葉黃素洗脫前出現(xiàn)的類胡蘿卜素組分和葉黃素異構(gòu)體采用葉黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，α-隱黃質(zhì)及其順式異構(gòu)體采用β-隱黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，α-胡蘿卜素及其順式異構(gòu)體采用β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。

總類胡蘿卜素含量為鑒定的主要類胡蘿卜素含量的總和。

1.3.2 黃玉米籽粒色澤測定

采用色差儀CIE Lab表色系統(tǒng)測定黃玉米籽粒粉的L*、a*、b*值，每個樣品重復(fù)3 次。根據(jù)a*、b*值計算H、C值。其中L*為亮度變量，測定值越大則表示樣品表面亮度越高。a*為紅色或綠色值，正值表示紅色，負(fù)值表示偏綠色，絕對值越大則說明紅色或綠色越深。b*為黃色或藍(lán)色值，正值表示為黃色，負(fù)值則表示偏藍(lán)色，絕對值越大說明黃色或藍(lán)色越深。C為色飽和度，C值越大表明顏色越純，C=[（a*）2+（b*）2]1/2。H為色調(diào)角，當(dāng)a*＞0、b*＞0時，H=tan-1（b*/a*）；當(dāng)a*＜0、b*＜0時，H=180+tan-1（b*/a*）。H值從0 °到180 °分別代表顏色為紫紅（0 °）、紅、橙紅、橙、黃（90 °）、黃綠、綠和藍(lán)綠色（180 °）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SAS軟件進(jìn)行單因素方差分析及組間差異的Duncan’s多重比較，相關(guān)性分析采用SPSS分析變量間的Pearson相關(guān)系數(shù)判定。

2 結(jié)果與分析

2.1 類胡蘿卜素鑒定結(jié)果

根據(jù)de Rosso[8]、陳鵬飛[9]和Aman[10]等對果蔬中類胡蘿卜素鑒定過程的報道，本研究通過HPLC圖譜中色譜峰的吸收波長、紫外-可見光譜特性、保留時間和質(zhì)譜離子碎片特性（質(zhì)荷比m/z）等指認(rèn)不同發(fā)育階段黃玉米籽粒中類胡蘿卜素組成，如圖1所示，共鑒定出8 種主要的類胡蘿卜素，包括新黃質(zhì)、花藥黃質(zhì)、葉黃素、玉米黃質(zhì)、α-隱黃質(zhì)、β-隱黃質(zhì)、α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素，不同發(fā)育階段各組分含量不同。

圖1 不同發(fā)育時期黃玉米籽粒中類胡蘿卜素的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of carotenoids in yellow corn grain at different developmental stages

2.2 不同發(fā)育時期類胡蘿卜素組成及含量變化

圖2 黃玉米發(fā)育過程中總類胡蘿卜素含量變化Fig.2 Changes in total carotenoid content of yellow corn grain during development

如圖2所示，黃玉米籽粒發(fā)育過程中第1～14天為籽粒形成期，14～29 d為乳熟期，29～35 d為蠟熟期。籽粒形成初期，總類胡蘿卜素含量顯著下降（P＜0.05），后期下降緩慢，第10天總類胡蘿卜素含量僅為13.99 μg/g（以干質(zhì)量計，下同），比第1天降低了近60%；但進(jìn)入乳熟期后，總類胡蘿卜素含量開始迅速上升，第29天時總類胡蘿卜素含量達(dá)到最大值90.01 μg/g，至蠟熟期總類胡蘿卜素含量有所下降，并維持穩(wěn)定在75 μg/g左右。由此可知，黃玉米籽粒中類胡蘿卜素積累主要在籽粒發(fā)育乳熟期至蠟熟期期間，這與番茄[11]、桃[12]等果實(shí)發(fā)育階段總類胡蘿卜素含量的變化趨勢一致。其原因可能是經(jīng)過灌漿期，黃玉米籽粒中水分含量高達(dá)90%，籽?；拘纬桑?dāng)進(jìn)入乳熟期，籽粒處于脫水狀態(tài)，胚乳呈清漿狀，水分含量開始下降，類胡蘿卜素生物合成反應(yīng)被激活，其含量快速增加[13-14]。

圖3 黃玉米籽粒發(fā)育過程中主要類胡蘿卜素含量變化Fig.3 Changes in the contents of individual carotenoids in yellow corn grain during development

由圖3可知，黃玉米籽粒中8 種主要類胡蘿卜素在不同發(fā)育時期的含量變化存在一定差異。在黃玉米籽粒形成初期，新黃質(zhì)和葉黃素含量最高，均達(dá)10 μg/g以上，但隨著籽粒的成熟，新黃質(zhì)含量不斷下降，至蠟熟期幾乎檢測不出，這可能因?yàn)樾曼S質(zhì)是類胡蘿卜素合成β鏈的最終產(chǎn)物，隨著籽粒發(fā)育，使得上游產(chǎn)物花藥黃質(zhì)傾向于合成植物脫落酸（abscisic acid，ABA）[15]，合成底物的不足及自身的轉(zhuǎn)化導(dǎo)致含量不斷降低；而葉黃素含量僅在籽粒形成期內(nèi)有所下降，進(jìn)入乳熟期，其含量迅速上升，最高可達(dá)41.61 μg/g，占籽粒中總類胡蘿卜素含量的50%左右，蠟熟期基本保持穩(wěn)定，這與寬皮柑桔果實(shí)發(fā)育過程中葉黃素含量的變化一致[16]。造成葉黃素在乳熟期大量積累的原因可能與轉(zhuǎn)錄水平上的基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)。Kang Baoshan等[17]認(rèn)為轉(zhuǎn)錄調(diào)控對于有色西瓜中類胡蘿卜素的積累起到重要作用。在黃色西瓜成熟的過程中，LCYB酶基因高水平轉(zhuǎn)錄，從而使得葉黃素大量積累，而番茄紅素則被大量分解。

玉米黃質(zhì)與葉黃素有相似的變化趨勢，在蠟熟期其含量升至39.59 μg/g，值得注意的是，蠟熟期玉米黃質(zhì)含量是籽粒形成期的近30 倍，是玉米籽粒發(fā)育過程中含量變化最大的類胡蘿卜素，其在乳熟期含量急劇增加可能是由玉米黃質(zhì)所在類胡蘿卜素合成β鏈的合成酶基因大量表達(dá)所致。Kato等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在柑橘果實(shí)成熟的過程中，LYCB酶基因表達(dá)增強(qiáng)，LYCE酶基因表達(dá)消失，導(dǎo)致玉米黃質(zhì)大量積累。因此，本研究推測玉米黃質(zhì)對黃玉米籽粒在生長發(fā)育過程中類胡蘿卜素的積累起關(guān)鍵作用。

花藥黃質(zhì)是玉米黃質(zhì)的下游產(chǎn)物，與玉米黃質(zhì)有相似的變化趨勢，在乳熟期其含量達(dá)到最大值2.96 μg/g；α-隱黃質(zhì)和β-隱黃質(zhì)蠟熟期含量均在2.00 μg/g左右；α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素在黃玉米籽粒發(fā)育過程中最大含量均僅在1.00 μg/g左右，這與李小麗[19]、Ruiz[20]等發(fā)現(xiàn)β-胡蘿卜素是影響類胡蘿卜素積累總量和果實(shí)色澤主要因素的結(jié)果不同，這可能與不同植物體內(nèi)細(xì)胞β-胡蘿卜素的合成部位以及酶基因表達(dá)有關(guān)[21]，也可能由于籽粒生長發(fā)育過程中新陳代謝旺盛，含氧活性基團(tuán)較多，更易生成含氧類胡蘿卜素[22]。相比而言，花藥黃質(zhì)、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、α-隱黃質(zhì)和β-隱黃質(zhì)對黃玉米籽粒發(fā)育過程中類胡蘿卜素積累的影響較小。

2.3 黃玉米籽粒色澤的變化

表2 黃玉米籽粒發(fā)育過程中色澤指標(biāo)變化Table 2 Changes in color parameters of yellow corn grain during developpmmeenntt

由表2可知，L*、a*、b*和C值均有相似的變化趨勢，在籽粒形成期內(nèi)基本保持穩(wěn)定，進(jìn)入乳熟期急劇上升，直至蠟熟后期又保持穩(wěn)定，說明隨著黃玉米成熟度的增加，籽粒的色澤逐漸變黃，與黃玉米發(fā)育中總類胡蘿卜素含量的變化規(guī)律基本一致，這與高飛飛[23]、戴雄澤[24]等對荔枝、辣椒的研究結(jié)果類似。H值總體上呈降低趨勢，說明隨著黃玉米成熟度的增加，籽粒色澤從黃色逐漸向橙紅色轉(zhuǎn)變。

表3 類胡蘿卜素各組分含量與籽粒發(fā)育過程中色澤的相關(guān)性Table 3 Correlation analysis between color parameters and individual carotenoid contents during grain development

各類胡蘿卜素組分含量與色澤的相關(guān)性分析見表3，玉米黃質(zhì)、花藥黃質(zhì)、α-隱黃質(zhì)及β-隱黃質(zhì)含量均與L*、a*、b*和C值成極顯著或顯著正相關(guān)，與H值成負(fù)相關(guān)或顯著負(fù)相關(guān)；葉黃素含量與b*、C值成極顯著正相關(guān)，與L*值成顯著正相關(guān)；α-胡蘿卜素含量與b*、C值成顯著正相關(guān)；β-胡蘿卜素及新黃質(zhì)含量與色澤參數(shù)間無顯著相關(guān)性。在黃玉米籽粒后期發(fā)育過程中，玉米黃質(zhì)和葉黃素含量急劇升高，顯著高于其他類胡蘿卜素（P＜0.01），可能是影響黃玉米籽粒色澤形成的主要因素，這與顏少賓[12]對桃顏色差異的研究結(jié)果一致，新黃質(zhì)和β-胡蘿卜素含量對色澤的影響較小，而在菠蘿[25]、枸杞[6]和枇杷[5]等果實(shí)中β-胡蘿卜素是影響其果皮色澤的主要因素，原因可能與黃玉米籽粒發(fā)育過程中β-胡蘿卜素的含量較低有關(guān)。

3 結(jié) 論

整個發(fā)育過程中，黃玉米籽?？傤惡}卜素含量與籽粒色澤的變化趨勢基本一致，乳熟期不僅是類胡蘿卜素積累的關(guān)鍵時期，也是籽粒顏色變黃的主要時期。各類胡蘿卜素組分在籽粒發(fā)育過程中的變化差異較大，在籽粒形成期，新黃質(zhì)含量最高，隨著黃玉米籽粒成熟度的增加，新黃質(zhì)含量不斷下降，而其他鑒定的7 種類胡蘿卜素含量均呈上升趨勢，至乳熟期，玉米黃質(zhì)和葉黃素含量占籽粒中總類胡蘿卜素含量近80%。通過類胡蘿卜素含量與籽粒色澤的相關(guān)性分析表明，玉米黃質(zhì)含量與L*、a*、b*值均成極顯著正相關(guān)，花藥黃質(zhì)、α-隱黃質(zhì)和β-隱黃質(zhì)含量均與L*、a*值成極顯著正相關(guān)，對黃玉米籽粒色澤影響最大。

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Changes in Carotenoid Content and Color of Yellow Corn Grain during Development

ZHANG Yuan1,2, SONG Jiangfeng2, HE Meijuan1,2, LI Dajing2,3, LIU Chunquan1,2,3,*, CHEN Jieqiong1,2
(1. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2. Institute of Farm Product Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China; 3. National Research and Development Center for Vegetable Processing, Nanjing 210014, China)

Changes in color and carotenoid content of yellow corn grain during grain fi lling, milky and dough stages were investigated by high performance liquid chromatography atmospheric-diode array detection-atmospheric pressure chemical ionization-mass spectrometry HPLC-DAD-APCI-MS with a C30column. The accumulation pattern of caroteniods and the relationship between carotenoid content and color were also discussed. The results showed that consistent trends of total carotenoid content and color were observed for yellow corn grain during the whole developmental process. As the maturation proceeded, the total carotenoid content constantly increased, and corn grain gradually turned yellow; the milky stage was the critical period of carotenoid accum ulation. The changes in individual carotenoid content were different during the whole developmental process. The contents of antheraxanthin, zeaxanthin, lutein, α-cryptoxanthin and β-cryptoxanthin had an upward trend, while the content of neoxanthin tended to decline as the developmental stage progressed although α-carotene and β-caotene had no significant change. Correlation analysis between carotenoid content and color indicated highly signifi cantly or signifi cantly positive relationships between the contents of antheraxanthin, zeaxanthin, lutein, α-cryptoxanthin and β-cryptoxanthin and L*, a*, b* and C color values, whereas these carotenoids were negatively related to H value.

yellow corn; carotenoids; development; color

TS255.2

A

1002-6630（2015）19-0077-06

10.7506/spkx1002-6630-201519014

2014-12-28

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目（CX（14）2055）

章園（1991-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。E-mail：2013108087@njau.edu.cn

*通信作者：劉春泉（1959-），男，研究員，碩士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品精深加工及產(chǎn)業(yè)化開發(fā)。E-mail：liuchunquan2009@163.com