翟艷玲，常立群，徐慶陽(yáng)

（1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457；2.寧夏伊品生物科技股份有限公司，寧夏 銀川 750100）

近年來(lái)，隨著L-賴氨酸生產(chǎn)企業(yè)產(chǎn)量擴(kuò)增，原輔料價(jià)格上升，產(chǎn)品利潤(rùn)空間逐漸縮小，因此選育高產(chǎn)菌株，提高賴氨酸發(fā)酵水平，降低生產(chǎn)成本，成了各企業(yè)搶占市場(chǎng)的關(guān)鍵手段。相對(duì)于通過(guò)誘變或者基因重組等方法定向改造生產(chǎn)菌株，選擇優(yōu)質(zhì)價(jià)廉的輔料，利用工農(nóng)業(yè)廢棄物和下腳料“變廢為寶”是企業(yè)快速、直接降低成本，提高發(fā)酵水平的普遍途徑之一。

棉籽蛋白質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定、游離棉酚含量低、蛋白質(zhì)含量高、利于微生物利用、價(jià)格低廉等[1]。棉籽蛋白水解液作為一種具有性價(jià)比優(yōu)勢(shì)的有機(jī)氮源，在歐美等國(guó)的發(fā)酵行業(yè)中得到廣泛應(yīng)用，可替代豆粕、酵母粉、魚(yú)粉和玉米漿等多種有機(jī)氮源，但它在我國(guó)發(fā)酵行業(yè)的應(yīng)用才剛剛起步[2-3]。本文研究了以棉籽蛋白水解液作為有機(jī)氮源，利用谷氨酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)賴氨酸，確定了其最佳培養(yǎng)基組成及發(fā)酵條件。

1 材料與方法

1.1 菌種和培養(yǎng)基

1.1.1 菌種

谷氨酸棒桿菌突變株LS260，為天津科技大學(xué)代謝工程研究室保藏菌種。

1.1.2 種子培養(yǎng)基

葡萄糖3%，豆餅水解液0.5%，硫酸銨0.4%，碳酸鈣0.5%，磷酸氫二鉀0.1%，硫酸鎂0.05%，pH 7.0，250 mL三角瓶中裝液量為 25 mL，0.12 MPa滅菌20 min，冷卻后備用。

1.1.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖5%，硫酸銨2.0%，碳酸鈣0.5%，磷酸氫二鉀0.1%，硫酸鎂0.05%，玉米漿0.6%，硫酸亞鐵20 mg，硫酸錳20 mg，棉籽蛋白水解液適量，pH 7.0，0.12 MPa 滅菌 20 min。

1.2 主要儀器及設(shè)備

紫外分光光度計(jì)（UV754N），上海菁華科技儀器有限公司；全自動(dòng)發(fā)酵罐（FUS10L），上海國(guó)強(qiáng)生化工程裝備有限公司。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 種子培養(yǎng)

在無(wú)菌條件下使用滅菌后的生理鹽水將培養(yǎng)好的試管斜面菌種洗下（每只斜面加入10 mL生理鹽水），按 10%的接種量接種，在30°C，轉(zhuǎn)速280 r/min條件下，培養(yǎng)12 h。

1.3.2 發(fā)酵罐發(fā)酵

4 L培養(yǎng)基置于10 L自動(dòng)發(fā)酵罐中，通入液氨和無(wú)菌空氣，在無(wú)菌條件下按10%的接種量接種，溫度為 30°C，轉(zhuǎn)速 280 r/min，殘?zhí)窃?2%左右時(shí)流加55%的葡萄糖，全過(guò)程流加25%氨水控制pH為7.0，當(dāng)產(chǎn)酸值不再變化并有pH上升時(shí)即為發(fā)酵終點(diǎn)，用酸性茚三酮顯色法測(cè)定產(chǎn)酸量。

1.4 分析測(cè)定方法

1.4.1 賴氨酸含量檢測(cè)

酸性茚三酮顯色法。

1.4.2 菌種生長(zhǎng)量檢測(cè)

0.2 mL發(fā)酵液加入5 mL蒸餾水，以蒸餾水做空白對(duì)照，在波長(zhǎng)562 nm下測(cè)定吸光度值。

1.4.3 殘?zhí)菣z測(cè)

費(fèi)林試劑滴定法。

1.4.4 氨基氮測(cè)定

微量凱氏定氮法。

1.4.5 pH檢測(cè)

酸度儀、精密pH試紙。

1.4.6 游離氨基酸檢測(cè)

日本日立L-8900氨基酸分析儀。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉籽蛋白水解液成分分析

棉籽中蛋白質(zhì)含量較高，可達(dá)38%～45%，富含高蛋白質(zhì)，但蛋白不利于菌體代謝，使用鹽酸溶液水解蛋白質(zhì)成游離氨基酸，使其利于代謝。棉籽蛋白與6 mol/L鹽酸質(zhì)量比為1∶2，加熱升溫至105°C，攪拌 20 min，靜置 8 h，取上清液得棉籽蛋白水解液。利用氨基酸分析儀檢測(cè)分析豆粕水解液、棉籽蛋白水解液中游離氨基酸含量。

表1 游離氨基酸成分分析

從表1中各氨基酸組成對(duì)比可見(jiàn)，棉籽蛋白水解液中氨基酸總量較豆粕水解液中高4.94%，尤其是谷氨酸、精氨酸和酪氨酸差異最為顯著，僅蛋氨酸含量稍低，為0.05%。

2.2 棉籽蛋白水解液對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

為考察棉籽蛋白水解液對(duì)賴氨酸種子培養(yǎng)的影響，改變種子培養(yǎng)基配方，由棉籽蛋白水解液代替豆粕水解液 （以原始配方豆粕水解液添加量0.5%作對(duì)照），測(cè)定種子發(fā)酵液菌體濃度，如圖1。

從圖1可以看出，0.1%的棉籽蛋白水解液不能滿足菌體生長(zhǎng)的需求，菌體延滯期加長(zhǎng)，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期OD增長(zhǎng)值遠(yuǎn)低于對(duì)照組。隨著棉籽蛋白水解液添加量的增加菌種濃度進(jìn)一步提高，添加量達(dá)到0.3%時(shí)與對(duì)照批次菌體生長(zhǎng)情況相當(dāng)，當(dāng)添加量為0.5%時(shí)，菌種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)提前。通過(guò)與菌體耗糖的對(duì)比，可以發(fā)現(xiàn)棉籽蛋白水解液促進(jìn)菌體生長(zhǎng)的作用明顯，菌體耗糖速度也隨著棉籽蛋白水解液使用濃度的增加而增加。

從圖2可以看出，由于棉籽蛋白水解液營(yíng)養(yǎng)豐富，微生物利用迅速，但若棉籽蛋白水解液添加量過(guò)多，菌體生長(zhǎng)速度加快，耗糖量增加，導(dǎo)致培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分快速耗盡，菌體穩(wěn)定期縮短。而種子生長(zhǎng)過(guò)快，并不利于后期發(fā)酵，容易導(dǎo)致發(fā)酵后期菌體衰老過(guò)快。綜合考慮經(jīng)濟(jì)成本及發(fā)酵控制等因素，確定種子培養(yǎng)基中的棉籽蛋白水解液的濃度維持在0.3%較為適宜。

圖1 不同添加量對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

圖2 不同添加量對(duì)菌體耗糖速度的影響

2.3 棉籽蛋白水解液對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響

為單一考察棉籽蛋白水解液對(duì)賴氨酸發(fā)酵過(guò)程的影響，種子培養(yǎng)基仍使用豆粕水解液的配方不變，調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基的配方，由棉籽蛋白水解液代替豆粕水解液，以原始配方豆粕水解液添加量1.0%作為對(duì)照，測(cè)定發(fā)酵液菌體濃度及賴氨酸含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 棉籽蛋白水解液不同添加量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸的影響

從表2可見(jiàn)，對(duì)比不同棉籽蛋白水解液添加量對(duì)賴氨酸發(fā)酵產(chǎn)酸的影響，初始棉籽蛋白水解液的添加量在0%～1.0%之間，賴氨酸產(chǎn)酸量逐步提高，添加量達(dá)到0.8%時(shí)，賴氨酸產(chǎn)量達(dá)到最大值257 g/L。

2.4 復(fù)合使用對(duì)發(fā)酵的影響

因棉籽蛋白水解液含有大量的有機(jī)氮源，對(duì)賴氨酸發(fā)酵非常有利，綜合2.2和2.3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在種子培養(yǎng)基中分別添加0.1%、0.3%的棉籽蛋白水解液，在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加0.8%、1.0%的棉籽蛋白水解液進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)，采用交叉試驗(yàn)，測(cè)定賴氨酸含量及糖酸轉(zhuǎn)化率，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 復(fù)合使用對(duì)發(fā)酵的影響

由表3可見(jiàn)，在種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同量的棉籽蛋白水解液，賴氨酸含量均有所變化。實(shí)驗(yàn)批次3賴氨酸含量最高，達(dá)到268 g/L，其中種子、發(fā)酵培養(yǎng)基中棉籽蛋白水解液分別添加了0.3%、0.8%，較對(duì)照批次賴氨酸含量增加了19 g/L，最高轉(zhuǎn)化率為69%，從而降低了生產(chǎn)成本，提高了賴氨酸生產(chǎn)的競(jìng)爭(zhēng)力。

3 討論

本文初步探索了賴氨酸發(fā)酵中使用棉籽蛋白水解液作為有機(jī)氮源的可行性，證明棉籽蛋白水解液的添加對(duì)賴氨酸產(chǎn)量有著顯著地影響。確定了在種子、發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加0.3%、0.8%的棉籽蛋白水解液，賴氨酸產(chǎn)酸達(dá)到268 g/L，比對(duì)照批次提高了9.05%，最高轉(zhuǎn)化率為69%。若在種子、發(fā)酵培養(yǎng)基中復(fù)合使用棉籽蛋白水解液，生產(chǎn)賴氨酸的成本可大大降低，為賴氨酸工業(yè)化生產(chǎn)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)效益，同時(shí)為棉籽蛋白水解液在發(fā)酵行業(yè)中的廣泛應(yīng)用提供了實(shí)踐依據(jù)。

[1]趙貴興．棉籽蛋白的營(yíng)養(yǎng)特性和生產(chǎn)應(yīng)用研究[J]．黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002，25(4)：41-43.

[2]高振，周華，萬(wàn)紅貴，等．棉籽蛋白在天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶發(fā)酵制備中的應(yīng)用[J]．食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31(2)：6-9．

[3]張延坤．棉籽蛋白的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]．食品工業(yè)，1995，17(1)：51-55．