徐 明 ，付會(huì)兵 ，劉 鵬 ，錢建陽 ，求趙明 ，王浩均 ，柳志強(qiáng) ，鄭裕國

（1.浙江來益生物技術(shù)有限公司，浙江 嵊州 312400；2.浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程研究所，浙江 杭州 310014）

脂肪酶（EC 3.1.1.3），又稱三?；视王；饷?，是一類能夠催化高級脂肪酸和丙三醇形成脂肪酸甘油酯鍵或者催化天然底物油脂 （三脂酰甘油酯）水解產(chǎn)生脂肪酸和甘油的酶[1]。目前，脂肪酶被廣泛應(yīng)用于食品、飼料、化工等工業(yè)領(lǐng)域[2-3]。脂肪酶是人們研究最早的酶之一，其廣泛存在于原核生物和真核生物中，由于哺乳動(dòng)物和植物脂肪酶的量較少而且分離純化難度也較大，而微生物脂肪酶在這方面表現(xiàn)出了很好的優(yōu)越性[4]，所以微生物脂肪酶自發(fā)現(xiàn)后就得到了較深入的研究。南極假絲酵母脂肪酶是近幾年通過極端環(huán)境取樣篩選到的一株酵母菌所產(chǎn)的酶，同時(shí)該酶又分為南極假絲酵母脂肪酶A和B兩類[5]，其中南極假絲酵母脂肪酶B因特殊的結(jié)構(gòu)不表現(xiàn)出界面活性而使其在有機(jī)相和水相中均表現(xiàn)出較強(qiáng)的生物活性[6]，得到了更廣泛的應(yīng)用。

近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基因工程、遺傳工程等方法越來越廣泛地應(yīng)用到育種上來，創(chuàng)造出更加高效的工業(yè)菌株。本研究所用菌株即是通過基因工程手段將南極假絲酵母脂肪酶B基因轉(zhuǎn)入到畢赤酵母[7]獲得的基因重組菌株，然后通過高密度發(fā)酵培養(yǎng)得到高產(chǎn)量的脂肪酶B。高密度培養(yǎng)是指在傳統(tǒng)發(fā)酵基礎(chǔ)上建立起來的通過提高菌體的發(fā)酵密度而最終提高產(chǎn)物比生產(chǎn)率的發(fā)酵技術(shù)，具有減少生產(chǎn)設(shè)備投資、強(qiáng)化下游分離提取、綜合提高比生產(chǎn)率等諸多優(yōu)點(diǎn)[8]。同時(shí)本研究利用畢赤酵母高密度培養(yǎng)來表達(dá)南極假絲酵母脂肪酶B，主要采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化產(chǎn)酶條件[9-13]，最終確定了一條可行性強(qiáng)的發(fā)酵產(chǎn)酶工藝路線。

1 材料與方法

1.1 菌種

Pichia pastoris X-33/pPICZα A-CALB。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基（YPD培養(yǎng)基+Zeocin）：酵母抽提物：1%，蛋白胨：2%，葡萄糖：2%，pH 自然，滅菌，冷卻，加入Zeocin至終濃度100 μg/mL。

種子培養(yǎng)基：酵母抽提物10 g，胰蛋白胨20 g，氮基酵母 3.4 g，硫酸銨 10 g，1 mol/L磷酸鉀緩沖液（pH 6.0）100 mL，甘油 10 g，定容至 1 L。 上述培養(yǎng)基配好后滅菌，冷卻至室溫，每升加2 mL 500×生物素，10.4 mL 96×組氨酸。

基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基：85%的 H3PO426.7 mL，CaSO4·2H2O 0.93 g，K2SO418.2 g，MgSO4·7H2O 14.9 g，KOH 4.31 g，甘油40.0 g。加水定容至1 L。

1.3 畢赤酵母高密度培養(yǎng)

種子斜面：從甘油管取樣劃YPD斜面，在30°C下培養(yǎng)24～48 h，待長出較大的單菌落。

搖瓶培養(yǎng)：取種子斜面上長勢較好的單菌落接種至種子培養(yǎng)基，于30°C培養(yǎng)24 h。

種子罐培養(yǎng)：待種子搖瓶菌種長好時(shí)按10%的接種量轉(zhuǎn)接至種子培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)24 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：按10%的接種量將種子液轉(zhuǎn)接至發(fā)酵罐，30°C開始發(fā)酵培養(yǎng)。

高密度培養(yǎng)發(fā)酵過程：

1）基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基階段：此階段，菌體的生長消耗培養(yǎng)基中的甘油。

2）甘油補(bǔ)加階段：此階段菌體生長消耗所補(bǔ)加的甘油，在這個(gè)階段菌體可以實(shí)現(xiàn)快速生長，達(dá)到很高的菌體量。

3）甲醇誘導(dǎo)階段：經(jīng)過第二階段的甘油流加，菌體量達(dá)到一個(gè)較高的值，待培養(yǎng)基中甘油完全消耗掉，間隔2～3 h后即可以開始甲醇誘導(dǎo)。

1.4 生物量的測定

1.4.1 菌體濕重的測定

發(fā)酵過程中，每隔12 h取樣一次。用2個(gè)10 mL離心管，離心前先稱量2個(gè)空離心管的質(zhì)量，每個(gè)離心管的裝量為8 mL，在電子天平上測量平衡后放于離心機(jī)中，8000 r/min，離心5 min，之后棄上清，稱重并由下列公式計(jì)算出發(fā)酵液的菌濃度（g/L）。

m1：2 個(gè)空離心管的質(zhì)量（g）；m2：離心后 2 個(gè)離心管的總質(zhì)量（g）

1.4.2 發(fā)酵液OD600的測定

取上述發(fā)酵液的樣品，將樣品稀釋到OD600的值處在0.6左右，測量此時(shí)的OD值。發(fā)酵液OD600的值由以下公式可以計(jì)算得出：

OD1、OD2：樣品測量兩次的吸光值；D：發(fā)酵液的稀釋倍數(shù)

1.5 脂肪酶酶活的測定（p-NPA法）

酶活定義為：在45°C和pH 8.0條件下，1 min內(nèi)催化對硝基苯乙酸酯生成1 μmol對硝基苯酚（p-NP）所需要的酶量為1個(gè)酶活單位（U）。

以對硝基苯乙酸酯（p-NPA）為底物，利用多功能酶標(biāo)儀在96孔板上測定脂肪酶的活性。具體操作如下：先加入50 μL酶液到900 μL 20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）中，45 °C 保溫，預(yù)熱1 min，加入 50 μL 20 mmol/L p-NPA 乙腈溶液反應(yīng)2 min后測定反應(yīng)液在405 nm的OD值。

1.6 單因素實(shí)驗(yàn)對酵母菌發(fā)酵條件的優(yōu)化

設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)，分別考察不同通氣量、攪拌轉(zhuǎn)速、pH、接種量、誘導(dǎo)劑量對酵母發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

表1 單因素試驗(yàn)的設(shè)計(jì)

說明：單因素實(shí)驗(yàn)在15 L發(fā)酵罐中進(jìn)行[14]，具體發(fā)酵條件如下：

1）研究通氣量的影響時(shí)，維持pH 5.5，接種量為10%，攪拌轉(zhuǎn)速為800 r/min，溶氧控制在20%～30%上，發(fā)酵時(shí)間為72 h。

2）研究攪拌轉(zhuǎn)速的影響時(shí)，維持pH 5.5，接種量為10%，通氣量為10 L/min，溶氧控制在20%～30%上，發(fā)酵時(shí)間為72 h。

3）研究pH的影響時(shí)，接種量為10%，攪拌速度為800 r/min，通氣量為 10 L/min，溶氧控制在20%～30%上，發(fā)酵時(shí)間為72 h。

4）研究接種量的影響時(shí)，維持pH 5.5，攪拌速度為800 r/min，通氣量為10 L/min，溶氧控制在20%～30%上，發(fā)酵時(shí)間為72 h。

5）研究誘導(dǎo)劑用量的影響時(shí)，維持pH 5.5，攪拌速度為800 r/min，通氣量為10 L/min，溶氧控制在20%～30%上，發(fā)酵過程中，記錄酶活及生物量隨誘導(dǎo)劑流加的變化情況。

1.7 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對酵母菌發(fā)酵條件的優(yōu)化

由單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出接種量、pH、誘導(dǎo)劑的量這三個(gè)因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有較大的影響，故對這三個(gè)因素進(jìn)行進(jìn)一步的研究。實(shí)驗(yàn)采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法對酵母菌發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)在700 L發(fā)酵罐中進(jìn)行。

表2 正交設(shè)計(jì)中的因素和水平

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同通氣量對畢赤酵母高密度發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

通氣量對發(fā)酵效果的影響如表3所示，隨著通氣量的增加發(fā)酵液的單位酶活會(huì)增加，繼續(xù)增加通氣量發(fā)酵液的單位酶活并沒有增加，所以選擇以10 L/min為最佳的發(fā)酵通氣量。

表3 通氣量對畢赤酵母發(fā)酵液體積酶活的影響

2.1.2 不同攪拌轉(zhuǎn)速對畢赤酵母高密度發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

攪拌轉(zhuǎn)速對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響如表4所示，當(dāng)轉(zhuǎn)速為800 r/min時(shí)發(fā)酵液的單位酶活最大，達(dá)到了4.6 U/mL。

表4 攪拌轉(zhuǎn)速對畢赤酵母發(fā)酵液體積酶活的影響

2.1.3 不同pH對畢赤酵母高密度發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

實(shí)驗(yàn)中，維持其他實(shí)驗(yàn)條件不變，主要考查發(fā)酵pH為5.0、5.5、6.5對畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示，結(jié)果表明，pH對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響較大，當(dāng)發(fā)酵pH為5.5時(shí)，發(fā)酵液的酶活最高，達(dá)到了5.3 U/mL。

表5 pH對畢赤酵母發(fā)酵液體積酶活的影響

2.1.4 不同接種量對畢赤酵母高密度發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

接種量對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響如表6所示，主要考查接種量為5%、10%、15%時(shí)對畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。結(jié)果表明，接種量對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響較小，當(dāng)接種量為10%，發(fā)酵液的酶活為5.4 U/mL，達(dá)到最高。

表6 接種量對畢赤酵母發(fā)酵液體積酶活的影響

2.1.5 不同的誘導(dǎo)劑量對畢赤酵母高密度發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

誘導(dǎo)劑的量對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響如表7所示，在單因素實(shí)驗(yàn)確定的最優(yōu)發(fā)酵條件（pH 5.5、接種量10%、攪拌轉(zhuǎn)速800 r/min、通氣量為10 L/min）的基礎(chǔ)上，考察誘導(dǎo)劑的添加量對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。主要考察誘導(dǎo)劑用量為2000 mL，3000 mL，4000 mL時(shí)畢赤酵母的產(chǎn)酶情況。結(jié)果表明：誘導(dǎo)劑的量為3000 mL時(shí)發(fā)酵液的單位酶活達(dá)到最高，繼續(xù)增加誘導(dǎo)劑的量并沒有增加發(fā)酵液的單位酶活。所以考慮經(jīng)濟(jì)節(jié)約，誘導(dǎo)劑的用量為3000～3500 mL 即可。

表7 誘導(dǎo)劑的用量對畢赤酵母發(fā)酵液體積酶活的影響

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

由單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得：發(fā)酵液pH、接種量、誘導(dǎo)劑的量，這三個(gè)因素對發(fā)酵產(chǎn)酶有著比較大的影響，因此，對這三個(gè)因素做進(jìn)一步優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)采用三因素三水平正交試驗(yàn)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表8所示。

由正交表可以看出，對發(fā)酵液菌體濃度及發(fā)酵液酶活大小影響的順序?yàn)锽＞A＞C，即pH＞接種量＞誘導(dǎo)劑的用量。其中pH影響最大，誘導(dǎo)劑用量的影響最小。我們還可以得出如下結(jié)論：

1）對于發(fā)酵菌體量（即生物量）的最優(yōu)條件組合為 A1B2C1。

2）對于發(fā)酵產(chǎn)酶（即酶活）的最優(yōu)組合為A1B1C1。

2.3 甘油的流加對畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

因畢赤酵母培養(yǎng)過程中，產(chǎn)酶的量和發(fā)酵液的生物量有一定的相關(guān)性，所以可以通過提高發(fā)酵液的生物量來提高產(chǎn)酶。由于在畢赤酵母高密度培養(yǎng)中通常是通過流加甘油來提高菌體濃度，所以實(shí)驗(yàn)中采取增加甘油的量來提高發(fā)酵液的菌體濃度。通過前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)選擇發(fā)酵甘油的流加量為原發(fā)酵流加量的1.5倍時(shí)效果最佳，因此在中試規(guī)模下亦選擇此流加量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。從圖中可以看出，發(fā)酵液的菌體量在甘油流加過程中快速增長，在培養(yǎng)50 h左右時(shí)即達(dá)到230 g/L左右，但是在后期培養(yǎng)過程中，菌體濃度并沒有增加很多。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，發(fā)酵液體積酶活達(dá)到了10 U/mL。所以可以得到，雖然通過流加過量的甘油可以使菌體濃度提前達(dá)到很高的值，但對最終的菌體量及產(chǎn)酶的提高卻影響不大，分析其原因可能是生長過快導(dǎo)致菌群提前進(jìn)入平衡期所致。

表8 正交試驗(yàn)的結(jié)果

圖1 增加甘油的流加量對發(fā)酵過程的影響

2.4 添加酵母膏和蛋白胨對畢赤酵母發(fā)酵培養(yǎng)的影響

畢赤酵母生長的特點(diǎn)是非常好氧，而且會(huì)分泌蛋白酶從而會(huì)引起自身分泌蛋白的降解，文獻(xiàn)有報(bào)道向發(fā)酵液中添加酵母膏和蛋白胨可以有效減少分泌蛋白的降解[15]。根據(jù)前期的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)確定了酵母膏的最佳添加量為0.5%（v/v），蛋白胨的最佳添加量為1%（v/v），因此本實(shí)驗(yàn)采用0.5%的酵母膏和1%的蛋白胨進(jìn)行組合添加，每隔48 h添加一次，整個(gè)發(fā)酵過程添加3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。從圖中可以看出，添加蛋白類物質(zhì)后的發(fā)酵液的菌體濃度達(dá)到了310 g/L左右，體積酶活達(dá)到了18 U/mL。由此可以得出，在畢赤酵母高密度培養(yǎng)過程中，在有過量蛋白類物質(zhì)存在的情況下，能減少脂肪酶的降解，從而提高發(fā)酵液的體積酶活。

圖2 添加酵母膏、蛋白胨對發(fā)酵過程的影響

3 結(jié) 論

本文通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)對畢赤酵母高密度發(fā)酵產(chǎn)酶的條件進(jìn)行研究，正交試驗(yàn)的結(jié)果與單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果不完全一致，可能是多個(gè)因素之間產(chǎn)生交互影響所致。通過三因素三水平正交試驗(yàn)，最終得出在公稱體積700 L，裝液量為400 L的發(fā)酵罐中，畢赤酵母最佳的發(fā)酵產(chǎn)酶條件為：pH 為 5.0，溫度為 30°C，轉(zhuǎn)速為 250 r/min，接種量為5%，溶氧為20%～30%，誘導(dǎo)劑甲醇的量為129 L，培養(yǎng)160～170 h時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)的酶活及生物量達(dá)到了最高。在開始誘導(dǎo)后，向發(fā)酵液添加0.5%的酵母膏和1%的蛋白胨（v/v），每隔48 h加入一次，分3次加入，可以有效地防止脂肪酶的降解，提高發(fā)酵液的體積酶活。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)是在中試規(guī)模下進(jìn)行，故實(shí)驗(yàn)結(jié)果對該產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要的指導(dǎo)意義。

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