林麗云，王義強,b,c，馬國輝，吳騰飛

（中南林業(yè)科技大學(xué) a. 生物技術(shù)實驗室；b. 經(jīng)濟林培育與保護教育部重點實驗室；c. 國家林業(yè)局生物乙醇研究中心，湖南 長沙 410004)

楊木同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的條件優(yōu)化

林麗云a，王義強a,b,c，馬國輝a，吳騰飛a

（中南林業(yè)科技大學(xué) a. 生物技術(shù)實驗室；b. 經(jīng)濟林培育與保護教育部重點實驗室；c. 國家林業(yè)局生物乙醇研究中心，湖南 長沙 410004)

以經(jīng)過蒸汽爆破預(yù)處理后的楊木為原料，利用戊糖乳桿菌突變株進行同步糖化發(fā)酵。用高效液相色譜法測定發(fā)酵液中的乳酸含量，對酶解溫度、酶解pH、纖維素酶添加量進行單因素試驗分析，對發(fā)酵溫度、發(fā)酵pH、接種量進行單因素試驗分析，再通過正交試驗對發(fā)酵條件進行優(yōu)化。研究發(fā)現(xiàn)，最佳發(fā)酵條件：發(fā)酵溫度為40℃，發(fā)酵pH為5.7，接種量為6%，纖維素酶添加量為15 FPU/g，乳酸產(chǎn)量為9.42 g/L，產(chǎn)酸量提高了83.62%。利用價格低廉且來源廣泛的楊木發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，具有廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景。

楊木；同步糖化發(fā)酵；乳酸；優(yōu)化

乳酸(lactic acid)是世界上公認的三大有機酸之一，目前已廣泛應(yīng)用于環(huán)保、食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域，尤其是聚合材料-聚乳酸，被認為是最有潛力的可生物降解高分子材料[1-2]，有望代替聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯等不可降解的塑料，消除“白色污染”，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。

傳統(tǒng)的乳酸發(fā)酵是以糖料、淀粉質(zhì)等糧食作物為原料，不僅成本居高不下，而且消耗了大量糧食資源，從而限制了乳酸的應(yīng)用。我國作為一個農(nóng)業(yè)大國，木質(zhì)纖維資源在國際上居于前列，科學(xué)地開發(fā)利用纖維資源是解決能源與糧食問題的主要途徑之一[3-5]，如果能夠利用木質(zhì)纖維原料來生產(chǎn)利用價值較高的乳酸，可以緩解許多發(fā)酵部門的高成本原料問題，對生態(tài)環(huán)境的保護和可持續(xù)發(fā)展也具有積極的意義。

近年來國內(nèi)外學(xué)者越來越熱衷于利用纖維原料生產(chǎn)乳酸的研究。如徐忠等[6]篩選出1株性能優(yōu)良的干酪乳稈菌，在發(fā)酵溫度30℃，接種量10%，pH值5.5的條件下，同步糖化發(fā)酵大豆秸稈酶解物42 h，乳酸的產(chǎn)率達到80%。Thomas[7]以制漿造紙廢料中的纖維素為原料，德氏乳桿菌NRRL B445發(fā)酵產(chǎn)乳酸，對糖轉(zhuǎn)化率93%，副產(chǎn)物乙酸。喬長晟等[8]利用米根霉同步糖化發(fā)酵玉米芯，在溫度34℃下發(fā)酵72 h后，還原糖殘留量為4.55 g/L，纖維素的轉(zhuǎn)化率為58.70%。

本文以經(jīng)過蒸汽爆破預(yù)處理后的楊木為原料，利用戊糖乳桿菌突變株進行同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乳酸[9]?？疾彀l(fā)酵溫度、發(fā)酵pH、接種量對結(jié)果的影響，并用正交試驗對發(fā)酵條件進行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 菌種

戊糖乳桿菌Lactobacillus pentosusC02，由中南林業(yè)科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)實驗室誘變篩選并保存。

1.2 試驗主要儀器設(shè)備

101-1AB型電鼓風(fēng)干燥箱、HVE-50型高壓滅菌鍋、W-CJ-ID型超凈工作臺、722型分光光度計、安捷倫1100型液相色譜儀、KITMAN-T24型離心機、三角瓶（500 mL，250 mL）、培養(yǎng)皿（9 cm）。

1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：眎蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、牛肉膏10 g/L、葡萄糖20 g/L、山梨醇酐單油酸1 g/L、檸檬酸銨2 g/L、MnSO4·H2O 0.05 g/L、3水合乙酸鈉7.727 g/L、12水合磷酸氫二鈉5.042 g/L、固體培養(yǎng)基添加瓊脂20 g/L，調(diào)pH6.5。

產(chǎn)酸基礎(chǔ)培養(yǎng)基：楊木爆破渣50 g/L，酵母浸粉 5 g/L，眎蛋白胨 10 g/L，Na2HPO4·12H2O.5 g/L，MgSO40.2 g/L，MnSO4·H2O 0.05 g/L，CaCO330 g/L。

1.4 還原糖標準曲線的測定

還原糖的測定采用DNS法[10]。

準確稱取于103±2℃下烘干至恒重的無水葡萄糖1 g，精確至0.1 mg，用水溶解并定容至100 mL，分別吸取 0.00、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.5 mL于10 mL容量瓶中，用超純水定容到10 mL，再分別吸取0.50ml葡萄糖標準液，加入3.0 mL DNS試劑和1.5ml緩沖液，用超純水定容到25 mL，搖勻。每組三個平行，沸水浴10 min。于540 nm處測吸光度A，根據(jù)結(jié)果繪制標準曲線。

其回歸方程為：

C=0.4641A－ 0.0243，R2=0.999 1。

1.5 酶解后還原糖含量的測定

準確稱取楊木酶解液0.50 mL，按照1.4的方法測其吸光度，根據(jù)標準曲線計算還原糖含量。取3次平均值作為測量結(jié)果。

1.6 乳酸標準曲線的測定

精密稱取準確稱取乳酸1 g標準品放入10 mL容量瓶中，用超純水溶解并定容至10 mL，配成乳酸標準液，然后進行稀釋，分別配成0.5 g/L，1 g/L，2 g/L，4 g/L，5 g/L的標準溶液。用0.45μm孔徑的合成纖維素酯膜過濾。再分別經(jīng)液相色譜檢測，以濃度C為橫坐標，峰高值A(chǔ)為縱坐標，繪制標準曲線。

其回歸方程為：

A=145.69X＋8.715，R2=0.999 9。

1.7 發(fā)酵后乳酸含量的測定

將發(fā)酵后的發(fā)酵液先經(jīng)兩層紗布過濾，除去固形物，取5 mL濾液，（5 000 r/min，10 min）除去碳酸鈣，加5 mL 0.01 mol/L的硫酸溶液進行酸解10 min，離心除去硫酸鈣，經(jīng)0.45 μm的濾膜過濾，取1 mL濾液適量稀釋，高效液相色譜法測其峰高，根據(jù)標準曲線計算乳酸含量。取3次平均值作為測量結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對纖維素酶水解楊木效果的影響

溫度過低，酶的活性不高，溫度過高，容易引起酶的變性失活。以還原產(chǎn)量為考察指標，由圖1可知，當溫度較低時，酶活性很低，隨著溫度的升高，還原糖的產(chǎn)量也增大，在50℃時達到最高，50℃之后，隨著溫度的升高還原糖產(chǎn)量降低。因此選擇的酶解溫度為50℃。

圖1 溫度對還原糖產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of different temperature on production of reducing sugar

2.2 初始pH對酶解效果的影響

pH能改變蛋白質(zhì)分子的電荷，從而影響酶的活性。以還原糖產(chǎn)量為考察指標，從圖2可知，pH較低時嚴重抑制酶的活性，導(dǎo)致還原糖產(chǎn)量過低，當初始pH為5.5時，還原糖產(chǎn)量達到最大，初始pH超過5.5，還原糖產(chǎn)量降低。因此選擇的酶解初始pH為5.5。

圖2 初始pH對還原糖產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of initial pH on production of reducing sugar

2.3 纖維素酶添加量對酶解效果的影響

纖維素酶的投入量直接關(guān)系著還原糖產(chǎn)量，從圖3可知，當酶添加量小于15 FPU/g時，隨著酶添加量的增加，還原糖產(chǎn)量迅速增加，當纖維素酶添加量多于15 FPU/g時，還原糖產(chǎn)量增長不明顯，綜合價格因素，纖維素酶最佳添加量為15 FPU/g。

圖3 纖維素酶添加量對酶解效果的影響Fig.3 Effect of the amount of cellulase on production of reducing sugar

2.4 溫度對同步糖化發(fā)酵效果的影響

從圖4可知，適當提高溫度能夠增加纖維素酶的酶解效率，為菌體生長代謝提供充足的還原糖，但是過高的溫度導(dǎo)致菌體內(nèi)一些酶發(fā)生變性失活，甚至能使菌體死亡。因此選擇的較佳溫度為40℃。

圖4 溫度對同步糖化發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of temperature on SSF

2.5 初始pH對同步糖化發(fā)酵效果的影響

從圖5可知，當初始pH為5.7時，乳酸產(chǎn)量達到最大，高于或低于這個值，乳酸產(chǎn)量都呈下降的趨勢。pH較低有利于酶解的進行，但不利于發(fā)酵，pH較高時利于發(fā)酵但不利于酶解，因此選擇的初始pH為5.7。

圖5 初始pH對同步糖化發(fā)酵的影響Fig.5 Effect of initial pH on SSF

2.6 接種量對同步糖化發(fā)酵效果的影響

由于同步糖化發(fā)酵中，發(fā)酵的初始階段發(fā)酵液還原糖含量少，接種量過大或過小都會影響發(fā)酵。從圖6可知，接種量在6%之前，隨著接種量的增加，乳酸產(chǎn)量也增加，在6%時達到最大，接種量超過6%，隨著接種量的增加，乳酸產(chǎn)量反而降低。接種量較低時，菌體需要消耗更多的營養(yǎng)進行生長繁殖來增加菌體數(shù)目，從而導(dǎo)致代謝產(chǎn)物較少；當接種量過大時，菌體對發(fā)酵液的營養(yǎng)迅速吸收，造成酶解的還原糖供不應(yīng)求，不利于代謝產(chǎn)物的累積，從而導(dǎo)致乳酸產(chǎn)量降低。因此選擇的接種量為6%。

圖6 接種量對同步糖化發(fā)酵的影響Fig.6 Effect of inoculums volume on SSF

2.7 同步糖化發(fā)酵條件的正交實驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取發(fā)酵溫度、發(fā)酵pH、接種量和相應(yīng)的水平值，采用L9(34)正交表設(shè)計實驗，通過極差分析得出較優(yōu)組合，再通過方差分析篩選出關(guān)鍵因素，從而確定同步糖化的最佳發(fā)酵條件，因素水平表見表1。正交試驗方案及結(jié)果分析見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and its levels of orthogonal experiment

表2 正交實驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

表3 正交實驗方差分析和顯著性檢驗Table 3 Variance analysis and significant of orthogonal experiment

從表2可知發(fā)酵的最佳條件為A2B2C2，與正交試驗結(jié)果直觀分析得到的最優(yōu)發(fā)酵條件一致，從表3可以看出F比：A＞B＞ C；即A、B和C三因素對乳酸產(chǎn)量的影響主次順序為：溫度＞初始pH＞接種量。由上述正交實驗得出最佳的發(fā)酵條件組合為：溫度45℃、初始pH 5.7、接種量為6%，優(yōu)化后乳酸產(chǎn)量為9.42 g/L，相對優(yōu)化前提高了83.62%。

3 結(jié) 論

利用戊糖乳桿菌突變株對楊木蒸汽爆破渣進行了同步糖化發(fā)酵，由正交試驗確定的最佳發(fā)酵條件為溫度45℃、初始pH 5.7、接種量為6%；優(yōu)化后乳酸產(chǎn)量為9.42 g/L，相對優(yōu)化前提高了83.62%。其中發(fā)酵溫度對乳酸產(chǎn)量的影響最大，其次為初始pH。

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The optimization of SSF conditions for poplar woods to lactic acid

LIN Li-yuna, WANG Yi-qianga,b,c, MA Guo-huia, WU Teng-feia
(a. Biotechnology Laboratory; b. Key Lab of Non-wood Forest Nurturing and Protection of National Ministry of Education; c. Bio-ethanol Research Center of State Forestry Administration, Central South University of Forestry &Technology, Changsha 410004, Hunan, China)

In this paper, poplar woods,which was pretreated by steam explosion,was used for SSF with mutant lactobacillus pentosus.The content of lactic acid was measured by HPLC，analysis on the enzymatic temperature,the enzymatic pH, the amount of cellulase separately,after analysis on the fermentation temperature,the fermentation PH,the inoculation amount，the fermentation conditions was optimized by orthogonal experiments. The results showed that the optimum fermentation conditions was as follows：the fermentation temperature was 40 ℃, the fermentation pH was 5.7, the inoculation amount was 6%, the amount of cellulase was 15 FPU/g and the yield of lactic acid was 9.42 g/L which raised 83.62% compared with the original conditions. Taking advantage of the cheap and extensive poplar woods for the production of lactic acid will have a broad prospect for industrial application.

poplar woods; SSF; lactic acid; optimization

S792.11

A

1673-923X(2015)10-0138-04

10.14067/j.cnki.1673-923x.2015.10.024

2014-02-10

國家林業(yè)局“948”項目“木質(zhì)纖維生物煉制丁醇汽油及聚乳酸生物塑料技術(shù)引進”（2011-4-13）

林麗云, 碩士研究生

王義強，教授，博導(dǎo)；E-mail：wangyiqiang12@163.com

林麗云，王義強，馬國輝，等. 楊木同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的條件優(yōu)化[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報，2015,35(10)：138-141.

[本文編校：吳 彬]