李蕾蕾，孫豐坤，李曉一，詹亞光,b，曾凡鎖,b

(東北林業(yè)大學 a.生命科學學院；b.林木遺傳育種與生物技術國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040)

白樺BpGT14基因表達載體及RNA干擾載體的構建

李蕾蕾a，孫豐坤a，李曉一a，詹亞光a,b，曾凡鎖a,b

(東北林業(yè)大學 a.生命科學學院；b.林木遺傳育種與生物技術國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040)

糖基轉移酶基因是生物分子糖基化中的關鍵基因，已有研究表明少數(shù)糖基轉移酶14(Glycosyltransferase 14，GT14)家族基因在植物細胞壁合成及對逆境的響應中發(fā)揮重要的生物學功能，然而GT14基因對逆境的響應機制目前仍不清楚。為了研究糖基轉移酶基因的生物學功能，本實驗室在克隆了白樺BpGT14基因(JQ409354)編碼區(qū)序列全長的基礎上，利用BamHⅠ單酶切的方法構建了白樺BpGT14基因的pBI121植物表達載體，并利用一步PCR之后在同一體系中同時酶切-連接的方法，構建了BpGT14基因RNA干擾載體，相比于傳統(tǒng)的RNA干擾載體構建方法更為高效快捷。測序結果表明，植物表達載體及RNA干擾載體均構建成功。本研究的完成，為BpGT14基因進一步的遺傳轉化及轉基因植株的獲得奠定了基礎，同時為今后植物表達載體的構建提供了高效便捷的參考方法。

白樺；糖基轉移酶；BpGT14基因；細胞壁；載體構建

近年來，有關植物細胞壁各組分的生物合成、細胞壁的構建模式、細胞壁與植物的生長發(fā)育等問題，特別是植物細胞壁的形成及其調控機理的研究成為人們關注的焦點[1]。糖基轉移酶基因GT14是多糖合成中的關鍵基因，擬南芥和水稻突變體的相關研究已經(jīng)表明少數(shù)糖基轉移酶家族基因在植物細胞壁合成和對逆境的響應中發(fā)揮重要的生物學功能[2-5]。然而，由于表型明顯的相關突變體有限，因此大部分糖基轉移酶在細胞壁的生物合成和組裝中的功能仍不清楚。

在雙鏈RNA被發(fā)現(xiàn)之后[6]，RNAi成為了一種十分有效的研究基因功能的方法[7-9]。通過RNA干擾機制，我們可以利用發(fā)卡RNA來誘導特定基因的降解，從而使基因沉默[10]。而在植物中，研究者們發(fā)現(xiàn)在發(fā)卡RNA中插入一段序列作為目的片段的內含子表現(xiàn)出了更高的基因沉默效率[11]。目前，RNA干擾技術被越來越廣泛的應用于各種生物中。

酶切-連接方法是構建植物轉基因載體的最普遍方法，被廣泛應用于各種轉基因植物表達載體的構建[12-15]。本研究利用pRNAi-GG(JQ085427)載體構建了RNA干擾載體[16](圖1)。這種干擾載體構建方法只需一步酶切-連接反應，快捷簡便，且成功率較高。pRNAi-GG載體在CaMV 35S啟動子和Nos終止子之間，具有兩個ccdB 致死基因和Pdk內含子(含氯霉素抗性基因)的盒式結構，因此具有雙重選擇的優(yōu)點。為了構建RNAi載體，目的基因在擴增時需要加入BsaⅠ酶切位點及接頭。在ccdB基因的兩側，均含有BsaⅠ酶切位點，在酶切-連接反應后，兩個ccdB基因均會被目的基因所取代。只有內含子兩端均連接目的片段的重組體才會在含有氯霉素抗性的培養(yǎng)基上生長。本實驗采用的方法只需要一步PCR，而后將酶切-連接反應在同一體系內同時進行，便可完成RNAi載體的構建。

本研究成功構建了BpGT14基因上游322bp片段的RNAi載體，同時利用傳統(tǒng)的單酶切、去磷酸化、連接的方法構建了BpGT14基因的植物表達載體。本研究載體的成功構建為進一步的遺傳轉化及BpGT14基因在細胞壁發(fā)育及逆境中功能的研究奠定了基礎。

圖1 pRNAi-GG干擾載體構建原理[16]Fig.1 Schematic diagram of interference vector construction with pRNAi-GG

1 材料與方法

1.1 研究材料

本研究采用的是野生型白樺(Betula platyphylla Suk)無菌培養(yǎng)植株。植物表達載體pBI121及干擾載體pRNAi-GG均由東北林業(yè)大學森林生物工程實驗室保存。限制性內切酶、DNA聚合酶及T4DNA連接酶均購自TaKaRa公司。反轉錄酶試劑盒購自Thermo公司。DNA瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒及質粒提取試劑盒均購自北京全式金生物技術公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 白樺總RNA的提取與cDNA的合成

取實驗室無菌培養(yǎng)的野生型白樺植株，利用改良的CTAB法提取總RNA。按照Thermo公司反轉錄酶合成cDNA第一鏈。

1.2.2 白樺BpGT14基因pMD18-T載體的構建

利用本實驗室已經(jīng)克隆的白樺BpGT14基因的序列(JQ409354)，通過Primer Premier 5軟件設計特異性引物BpGT14-F及BpGT14-R(表1)，PCR擴增白樺BpGT14基因，PCR程序設定為，94℃預變性3min；94℃變性45s，58℃退火45s，72℃延伸2min，共進行30個循環(huán)；最后72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測，并進行回收，與pMD18-T載體進行連接，連接產(chǎn)物轉化DH5α感受態(tài)細胞，進行藍白斑篩選。挑取白色菌落，進行PCR鑒定，選擇陽性克隆進行測序工作。將重組質粒載體命名為pMD18-GT。

表1 對應引物序列Table 1 The corresponding primer sequences

1.2.3 白樺BpGT14基因植物表達載體的構建

利用Primer Premier 5進行引物設計工作，同時將BamHⅠ酶切位點引入目的片段中，在引物兩端加上酶切位點及保護堿基，命名為P171F及P171R(表1)。利用提取的pMD18-GT質粒為模版，擴增目的基因，PCR程序同上，并利用DNA純化回收試劑盒進行純化回收。利用限制性內切酶BamHⅠ將純化后的目的片段與pBI121載體同時進行單酶切(pBI121載體在單酶切后進行去磷酸化反應，以防止載體自連)，純化回收后利用T4連接酶16℃過夜連接，產(chǎn)物轉化至DH5α感受態(tài)細胞，在含有卡那抗生素的LB培養(yǎng)基上生長過夜。挑取白色菌斑進行PCR驗證，驗證成功的菌液送往北京華大基因進行測序工作，將測序結果與BpGT14基因序列及pBI121載體序列進行比對，選取正向插入片段載體作為陽性克隆。

1.2.4 白樺BpGT14基因干擾載體的構建

選取目的基因BpGT14上游一段長度為322 bp的片段構建干擾載體，根據(jù)選取的目的基因設計引物，加入保護堿基、接頭以及酶切位點，引物命名為RNAi-F及RNAi-R(表1)。PCR擴增產(chǎn)物純化后與載體進行酶切-連接反應，反應體系為，pRNAi-GG質粒5μL，目的片段3μL，T4連接酶緩沖液 1μL，T4DNA 連接酶 0.5μL，Bsa Ⅰ(NEB，10 U/μL)0.5μL，無菌去離子水補齊至10μL。反應條件為溫育37℃，2h；之后失活反應80℃，5min。將連接產(chǎn)物轉化至DH5α感受態(tài)細胞中，培養(yǎng)于含有卡那霉素和氯霉素的培養(yǎng)基上過夜。挑取陽性克隆，菌液PCR驗證。驗證時分別以P22、P23(表1)和RNAi-R兩對引物同時進行PCR驗證，其中，P22是以啟動子一端序列設計的引物，P23是以終止子一端序列設計的引物(圖2)。選取陽性克隆送往華大基因進行測序。

圖2 干擾載體驗證引物位置[16]Fig.2 The position of the primers on pRNAi-GG used for identi fi cation

2 結果與分析

2.1 白樺BpGT14基因pMD18-T載體的構建

利用瓊脂糖凝膠電泳檢測野生型白樺無菌培養(yǎng)植株總RNA，28S和18S條帶清晰可見(圖3)。以反轉錄獲得的cDNA為模版，PCR擴增目的基因BpGT14，產(chǎn)物條帶經(jīng)電泳檢測處于2 000 bp與1 000 bp之間(圖4)，與預期效果一致，初步認定擴增產(chǎn)物即為BpGT14目的基因。將菌液PCR驗證的陽性克隆進行正反向測序，測序結果表明載體構建成功，插入片段編碼區(qū)長度為1 302 bp。

圖3 白樺總RNA提取檢測Fig.3 The detection of RNA extraction

圖4 PCR擴增結果Fig.4 Result of PCR ampli fi cation

2.2 白樺BpGT14基因植物表達載體的構建

利用BamHⅠ對pBI121植物表達載體進行單酶切，反應體系經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖5)，結果表明載體已酶切完全。挑取過夜培養(yǎng)的白色單菌落，在含有抗生素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，進行菌液PCR驗證，結果表明存在陽性克隆(圖6)，但目的片段插入方向不確定。將待檢測的陽性克隆進行正反向測序驗證，將測序結果分別與BpGT14基因編碼區(qū)序列及載體兩端序列進行比對，發(fā)現(xiàn)存在陽性克隆為正向插入片段。由于植物表達載體的構建需要編碼區(qū)序列定向插入表達載體中，因此我們明確正向插入片段為陽性克隆，結果表明BpGT14基因植物表達載體構建成功。

圖5 BamHⅠ 酶切pBI121質粒電泳圖像Fig.5 Identi fi cation result of BamHⅠsingle enzyme digestion of pBI121 vector

圖6 BpGT14基因表達載體PCR鑒定結果Fig.6 PCR identi fi cation result of BpGT14 gene expression vector

2.3 白樺BpGT14基因干擾載體的構建

選取BpGT14基因上游一段長度為322 bp的片段進行PCR擴增及回收純化，電泳條帶約為300 bp(圖7)。利用P22、P23及反向引物驗證RNAi載體構建結果，理論條帶差異約為200 bp，電泳結果與設計引物時預期結果一致(圖8)，初步認定RNAi載體構建成功。將樣品利用P22及P23進行正反向測序驗證，測序結果與載體上啟動子、內含子和終止子序列進行分段比對，一致性較高，且插入片段為322 bp，無突變。綜上所述，干擾載體構建成功。

圖7 目的基因BpGT14上游片段PCR產(chǎn)物純化回收檢測Fig.7 Detection of DNA puri fi cation of BpGT14 gene upstream fragment

圖8 PCR 鑒定結果Fig.8 PCR identi fi cation result

3 結論與討論

目前，載體構建的策略逐步完善，力求以簡單高效的方法完成目的基因與載體的重組。盡管傳統(tǒng)載體構建中利用的酶切、連接方法步驟冗長，效率偏低[17]，但因為其操作簡便，成本低廉的特點依然被廣泛使用[18-19]。本研究成功構建了白樺BpGT14基因的植物表達載體及干擾載體，基本策略均是利用酶切連接的方法。

植物表達載體的構建因需要編碼區(qū)序列定向插入載體中，因此多采用雙酶切的方法實現(xiàn)。但由于雙酶切實驗中，判斷是否酶切完全需要至少設立兩組對照，且對于兩種酶的酶切溫度及緩沖液均有要求，因此降低了實驗的效率，且步驟較為繁瑣。本研究采用了單酶切的方法，可有效避免雙酶切反應中存在的問題。為了解決單酶切中載體自連的問題，在pBI121表達載體質粒酶切反應后，添加了一步去磷酸化反應，可以有效的解決載體自連的問題。對于陽性克隆的篩選，筆者采用了初步篩選后測序復選的策略，以篩選正向插入的目的片段。部分研究者利用單酶切的方法進行陽性克隆的篩選[20]，選取插入片段及載體上均含有的酶切位點，利用單酶切的方法，獲得兩段長度不同的片段，同樣可以達到篩選特定方向插入片段載體的目的。

通過RNA干擾技術研究基因功能的手段因為其高效、簡便和特異性強的特點已被廣泛使用。傳統(tǒng)的“酶切-連接”方法仍然是構建RNA干擾載體最常見的方法，被廣泛應用與各種生物之中，這種方法是通過PCR擴增含有酶切位點的目的片段，形成順反結構，之后在順反結構之間插入一段內含子以增強沉默效率[21-22]。原始的酶切連接方法無一例外的需要多輪酶切連接反應，所以實驗周期較長，步驟冗雜，耗費時間，因此降低了實驗的成功率。目前使用較多的是基于GATEWAY克隆體系的RNAi載體構建方法。GATEWAY技術是Invitrogen公司開發(fā)的一項基因克隆新技術，只需要BP和LR兩個反應就可以完成RNA干擾表達載體的構建，并且不需要使用限制性內切酶和連接酶[23]。這種方法與傳統(tǒng)的酶切-連接方法相比，具有簡便、快捷、成功率高、對原始載體和目的片段的限制少等優(yōu)勢[24]，克隆效率可達到95％[11]。但相比于眾多RNAi載體構建的方法，Gateway技術的價格相對而言比較昂貴，并且同樣需要BP和LR兩步反應。本研究采用的RNAi載體構建方法耗時短，操作簡便，只需一步PCR反應及一步酶切連接反應便可實現(xiàn)目的基因與質粒的重組，同時，ccdB致死基因和氯霉素抗性基因的雙重篩選，可以大大降低假陽性的概率，提高成功率。本研究成功構建了白樺BpGT14基因植物表達載體及RNA干擾載體，經(jīng)過測序分析證明載體構建成功，目前，正在進行遺傳轉化的研究，已獲得轉基因愈傷組織。本研究的載體構建策略，可廣泛應用于植物表達載體及干擾載體的構建當中，對于植物表達載體及干擾載體的構建具有較高的參考價值，且通用性強。目前，該類方法以其步驟簡便，效率可觀等特點可被廣泛運用于轉基因植株的研究當中。本研究載體構建的成功，為白樺BpGT14轉基因的功能研究奠定了基礎。

[1] Doblin M S,Pettolino F,Bacic A.Evans Review：Plant cell walls：the skeleton of the plant world[J].Functional Plant Biology,2010,37(5)：357-381.

[2] Lee C,Teng Q,Huang W,et al.The Arabidopsis family GT43 glycosyltransferases form two functionally nonredundant groups essential for the elongation of glucuronoxylan backbone[J].Plant physiology,2010,153(2)：526-541.

[3] Zhong R,Pe?a M J,Zhou G K,et al.Arabidopsis fragile fi ber8,which encodes a putative glucuronyltransferase,is essential for normal secondary wall synthesis[J].The Plant Cell Online,2005,17(12)：3390-3408.

[4] Vanzin G F,Madson M,Carpita N C,et al.The mur2 mutant of Arabidopsis thaliana lacks fucosylated xyloglucan because of a lesion in fucosyltransferase AtFUT1[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2002,99(5)：3340-3345.

[5] Zhou Y,Li S,Qian Q,et al.BC10,a DUF266-containing and Golgi-located type II membrane protein,is required for cellwall biosynthesis in rice(Oryza sativaL.)[J].The Plant Journal,2009,57(3)：446-462.

[6] Fire A,Xu S Q,Montgomery M K,et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans[J].nature,1998,391(6669)：806-811.

[7] Gunsalus K C,Piano F.RNAi as a tool to study cell biology：building the genome-phenome bridge[J].Current opinion in cell biology,2005,17(1)：3-8.

[8] Kusaba M.RNA interference in crop plants[J].Current Opinion in Biotechnology,2004,15(2)：139-143.

[9] Perrimon N,Ni J Q,PerkinsL.In vivo RNAi：today and tomorrow[J].Cold Spring Harbor perspectives in biology,2010,2(8)：36-40.

[10] Waterhouse P M,Helliwell C A.Exploring plant genomes by RNA-induced gene silencing[J].Nature Reviews Genetics,2003,4(1)：29-38.

[11] Wesley S V,Helliwell C A,Smith N A,et al.Construct design for efficient,effective and high-throughput gene silencing in plants[J].The Plant Journal,2001,27(6)：581-590.

[12] 柴曉杰,王丕武,關淑艷,等.玉米淀粉分支酶基因反義表達載體的構建和功能分析[J].作物學報,2006,31(12)：1654-1656.

[13] 邢珍娟,王振營,何康來,等.轉 Bt 基因玉米幼苗殘體中Cry1Ab 殺蟲蛋白田間降解動態(tài)[J].中國農業(yè)科學,2008,41(2)：412-416.

[14] 王 鐳,才 華,柏 錫,等 .轉 OsCDPK7 基因水稻的培育與耐鹽性分析 [J].遺傳,2008,30(8)：1051-1055.

[15] 呂 品,柴曉杰,王丕武,等.大豆胰蛋白酶抑制劑 KSTI3 基因的克隆及其植物表達載體的構建[J].吉林農業(yè)大學學報,2007,29(3)：275-278.

[16] Yan P,Shen W,Gao X Z,et al.High-throughput construction of intron-containing hairpin RNA vectors for RNAi in plants[J].PloS one,2012,7(5)：e38186.

[17] 馬 建,魏益凡,厲 志,等.植物 RNA 干擾表達載體構建方法的研究[J].安徽農業(yè)科學,2009,(18)：8364-8366.

[18] 張 莉,蘇曼琳.植物抗旱基因 HDCS1 的克隆和表達載體的構建[J].中南林業(yè)科技大學學報,2012,32(6)：115-117.

[19] 黃 婷,徐剛標.毛果楊WND1B 基因啟動子的克隆與缺失初步分析[J].中南林業(yè)科技大學學報,2012,32(4)：164-169.

[20] 馬 騰,劉學政,劉麗波,等.人血管生成素 1 的克隆,序列分析和單酶切法構建畢氏酵母表達載體[J].中國組織工程研究與臨床康復,2007,11(6)：1041-1044.

[21] Kong Z,Li M,Yang W,et al.A novel nuclear-localized CCCH-type zinc finger protein,OsDOS,is involved in delaying leaf senescence in rice[J].Plant physiology,2006,141(4)：1376-1388.

[22] Miki D,Itoh R,Shimamoto K.RNA silencing of single and multiple members in a gene family of rice[J].Plant Physiology,2005,138(4)：1903-1913.

[23] 粟 挺,劉愛玲,陳信波.RNA 干擾載體構建方法的研究進展 [J].湖南農業(yè)科學,2011,(10)：1-4.

[24] 馬 建,魏益凡,厲 志,等 .植物 RNA 干擾表達載體構建方法的研究[J].安徽農業(yè)科學,2009,(18)：8364-8366.

Construction of BpGT14 gene expression vector and RNA interference vector in Betula platyphylla

LI Lei-leia,SUN Feng-kuna,LI Xiao-yia,ZHAN Ya-guanga,b,ZENG Fan-suoa,b
(a.College of Life Sciences; b.Key Laboratory of Forest Tree Genetic Improvement and Biotechnology of Nation,Northeast Forestry University,Harbin 150040,Heilongjiang,China)

Glycosyltransferase gene is the key gene in the biomolecules glycosylation.Some studies have shown that a minority glycosyltransferase 14(GT14)gene family play an important biological function in the synthesis of plant cell wall and response to adversity，but the stress response mechanism of GT14 gene remains unclear.In order to study the biological function of glycosyltransferase gene,based on full-length of cloned BpGT14 gene(JQ409354)by our laboratory,we have constructed the plant expression vector pBI121 through single digestion and connection and RNA interference vector through a newly one-step PCR method instead of the original one.Sequencing results showed the success of plant expression vector and RNAi vector.The success of this experiment laid a foundation further for the step of genetic transformation and transgenosis and provides an ef fi cient and convenient method of the plant expression vectors constructed for future reference.

Betula platypylla,Glycosyltransferase,BpGT14 gene,cell wall,expression vector construction

S792.153

A

1673-923X(2015)07-0017-05

10.14067/j.cnki.1673-923x.2015.07.004

2014-10-10

國家自然科學基金項目(J1210053；31200463)；黑龍江省博士后啟動基金項目(LBH-Q12166)

李蕾蕾，碩士研究生

曾凡鎖，副教授，博士；E-mail：zengfansuo@126.com

李蕾蕾,孫豐坤,李曉一,等.白樺BpGT14基因表達載體及RNA干擾載體的構建[J].中南林業(yè)科技大學學報，2015,35(7)：17-21.

[本文編校：吳 毅]