龍洪旭，譚曉風(fēng)，張 琳，曾艷玲，李 澤，王 哲

(中南林業(yè)科技大學(xué) 經(jīng)濟(jì)林育種與栽培國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004)

油桐delta 8脫飽和酶基因的全長(zhǎng)cDNA克隆及序列分析

龍洪旭，譚曉風(fēng)，張 琳，曾艷玲，李 澤，王 哲

(中南林業(yè)科技大學(xué) 經(jīng)濟(jì)林育種與栽培國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004)

桐油是制備生物柴油的優(yōu)勢(shì)原料。delta 8脫飽和酶基因與植物膜脂、鞘磷脂的生物合成及細(xì)胞信號(hào)傳遞途徑有關(guān)。通過簡(jiǎn)并PCR擴(kuò)增、3’ RACE、5’ RACE及編碼區(qū)擴(kuò)增獲得了油桐delta 8脫飽和酶的全長(zhǎng)cDNA序列。該基因全長(zhǎng)1 787 bp，ORF的長(zhǎng)度為1 344 bp，編碼447個(gè)氨基酸。經(jīng)過網(wǎng)上比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)油桐delta 8脫飽和酶與其它植物的此基因具有較高同源性，其中與蓖麻脂肪酸去飽和酶相似度達(dá)83％。研究結(jié)果為揭示油桐油脂合成途徑及分子定向育種奠定基礎(chǔ)。

油桐；delta 8去飽和酶；簡(jiǎn)并PCR；RACE；基因克隆

油桐Vernicia fordii原產(chǎn)我國(guó)，是重要的工業(yè)油料樹種[1]，桐油的脂肪酸組成主要有6種：軟脂酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、桐酸。軟脂酸與硬脂酸是飽和脂肪酸，僅占約5％，主要成分是以桐酸為主的不飽和脂肪酸，因其帶有共軛雙鍵，化學(xué)性質(zhì)極為活潑，易氧化干燥，聚合成薄膜，具有不透水、不透氣、不傳電、抗酸堿、防腐蝕、耐冷熱等特性，在化工、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、印刷、電信、航運(yùn)、航天、國(guó)防及精密機(jī)械工業(yè)上有廣泛用途，是重要的工業(yè)油料[2-3]，還可做燃料，是制備生物柴油的優(yōu)勢(shì)原料[4]。植物的delta 8脫飽和酶又稱植物鞘磷脂脫飽和酶[5]，植物鞘磷脂是細(xì)胞膜的組成成分之一，最近研究顯示植物鞘磷脂具有重要的信號(hào)傳遞作用[6]。該酶與高度不飽和脂肪酸(highly unsaturated fatty acids，HUFAs)的合成有關(guān)，能夠使不飽和脂肪酸酯化成磷脂，維持細(xì)胞膜的流動(dòng)性，它與植物膜脂、鞘磷脂的生物合成相關(guān)[7-10]。HUFA與植物的抗凍性有關(guān)，四川大學(xué)陳放、卿人韋等[5]克隆到一個(gè)麻瘋樹delta 8脫飽和酶基因，瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果顯示，此基因在胚乳發(fā)育早期有較高表達(dá)，在細(xì)嫩葉片和細(xì)嫩果實(shí)的青果皮中表達(dá)量較低，在其它時(shí)期的組織器官中不表達(dá)。可能是一個(gè)結(jié)合在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的delta 8脫飽和酶基因，與細(xì)胞的信號(hào)傳遞途徑有關(guān)，具有潛在研究?jī)r(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材 料

2009年8月底，以湖南省長(zhǎng)沙市天際嶺林場(chǎng)對(duì)年桐果實(shí)為材料，-80℃超低溫冰箱保存。大腸桿菌DH5α，質(zhì)粒載體pMD18-T、rTaq DNA聚合 酶、10×PCR Buffer(with Mg2+)、Pyrobest DNA Polymerase購自Takara，3’ RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends，5’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends，PureLinkTMMicro-to-Midi Total RNA Purification System 購自Invitrogen，F(xiàn)irst Strand cDNA Synthesis kit購自 Fermentas，pEASY-Blunt Simple Cloning Kit購自全式金公司，其它常規(guī)試劑均使用國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方 法

1.2.1 油桐種子總RNA提取

以Invitrogen Total RNA Puri fi cation Kit為基礎(chǔ)，采用cTAB裂解進(jìn)行改進(jìn)，先取配制好的1.2mL CTAB裂 解 液(3％ CTAB，1.5 M NaCl，10 mM EDTA，30 mM Tris，pH 7.0,2％ pvp-40)加入到1.5mL無RNase的離心管中，加20 μL β-巰基乙醇。65℃預(yù)熱10min。在液氮中將油桐種子研磨充分，裝入預(yù)冷的1.5mL的離心管中(每管不多于250mg)。向離心管迅速加入600 μL預(yù)熱好的CTAB裂解液，渦旋混勻，65℃加熱10min，每3min渦旋1次。加入600 μL的氯仿，渦旋振蕩4min，使其充分裂解。后續(xù)步驟參照Invitrogen RNA試劑盒說明書。

1.2.2 單鏈cDNA的合成

油桐種子單鏈cDNA合成參照Fermentas試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.3 簡(jiǎn)并片段的擴(kuò)增

根據(jù)GeneBank中登錄的delta 8脫飽和酶基因氨基酸序列(Jatropha curcas ABP01349.1、Ricinus communis XP_002511936.1、Brassica napus CAA11857.1、Helianthus annuus CAA60621.1、Arabidopsis thaliana NP_191717.1)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增JBD8F(GATTGGRYNAAAGANCATCC)，JBD8R(TTATGVKTCCATTTCCACCA)，擴(kuò) 增delta 8基因的保守區(qū)片段。50 μL PCR反應(yīng)體系包含 5μL的10×PCR Buffer(with Mg2+)，4μL的 dNTP Mix(各 2.5 mM)，各 1μL 的 JBD8F、JBD8R 引物(20 μM)，0.25μL rTaq(5 U/μL)，2μL單鏈cDNA模板，36.75μL超純水。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸7min；16℃終止反應(yīng)。

1.2.4 3′RACE擴(kuò)增

根據(jù)已擴(kuò)增的delta 8保守序列，設(shè)計(jì)了 3′ RACE引物3R-P1(TGAATCTGGCTGG CCAAGATGTAAC)，3R-P2(CAAAGTCTCAG ATGTGTCCAGGGA)，3R-P3(TCATTGGCATC TGTTGTGTTCTTGT)；根據(jù)Invitrogen的3′RACE System for Rapid Ampli fi cation of cDNA Ends手冊(cè)合成 3′RACE Ready cDNA 并進(jìn)行 3′RACE 巢式擴(kuò)增。

1.2.5 5′RACE擴(kuò)增

將根據(jù)已擴(kuò)增的delta 8保守序列及3′RACE片段的測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)5′ RACE引物5R-P1(CATTCCCATTTGGAGGTC)，5R-P2(AG CAGCAAAGGAAGTAAGCACG)，5R-P3(ATGGTTCCATTTCCACCAAG)，5R-P4(TCCCTGGACACATCTGAGACTT)，根據(jù)Invitrogen的5′RACE手冊(cè)進(jìn)行5′RACE ready cDNA的合成及巢式擴(kuò)增。

1.2.6 完整cDNA的克隆測(cè)序

將delta8的保守區(qū)片段及3′RACE和5′RACE片段進(jìn)行人工拼接，得到delta 8基因的理論全長(zhǎng)cDNA序列，以此設(shè)計(jì)完整ORF擴(kuò)增引 物 QC-F(ATGGAGGGAGAAAGGAAGT)，QC-R(GGCTTCAAAGGCAACATAGA)。以 反轉(zhuǎn)錄的cDNA第一鏈為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，50 μL PCR 反應(yīng)體系包含 5μL 10×Pyrobest Buffer II(with Mg2+)，4μL dNTP Mix(各 2.5 mM)，各1μL的 QC-F、QC-R(20 μM)引物，0.25μL Pyrobest DNA Polymerase(5U/ul)，2μL 單 鏈 cDNA 模板，36.75μL無菌水。PCR程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；95℃變性 40s，58℃退火 40s，72℃延伸3min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；4℃終止反應(yīng)。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收、連接、轉(zhuǎn)化，并進(jìn)行雙向測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 delta 8基因保守區(qū)序列擴(kuò)增

使用cTAB裂解法配合Invitrogen植物RNA提取試劑盒，提取的油桐總RNA，如圖1所示，28S與18S條帶明亮，效果理想，滿足實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 油桐種子總RNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Electrophoresis of Venicia fordii seed total RNA

以此單鏈cDNA為模板，用簡(jiǎn)并引物JBD8F、JBD8R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。取3 μL PCR產(chǎn)物，于1.5％的瓊脂糖凝膠上電泳，得到與預(yù)期大小相符的清晰條帶(圖2)。經(jīng)過測(cè)序確認(rèn)，此片段長(zhǎng)490 bp。可根據(jù)此部分保守序列設(shè)計(jì)RACE擴(kuò)增所需引物。

圖2 delta 8簡(jiǎn)并PCR電泳Fig.2 Electrophoresis of delta 8 degenerate PCR product ampli fi cation

2.2 3′RACE擴(kuò)增和5′RACE擴(kuò)增

以引物3R-P1、3R-P2、3R-P3與 Invitrogen 3′RACE 試劑盒進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，1.5％瓊脂糖凝膠電泳，最后由3R-P3擴(kuò)增得到3′RACE清晰特異條帶，經(jīng)回收測(cè)序，確定序列長(zhǎng)度1200bp(圖3)，與預(yù)期相符。用引物5R-P2、5R-P3、5R-P4與Invitrogen 5′RACE試劑盒進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，將產(chǎn)物進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠電泳，如圖4所示，由5R-P4得到特異的550bp左右的條帶，經(jīng)回收測(cè)序確定為預(yù)期片段。

2.3 CDS擴(kuò)增電泳檢測(cè)

以提取油桐種子總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用編碼區(qū)引物QC-F、QC-R進(jìn)行Delta 8基因的完整ORF PCR擴(kuò)增，1.2％的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖5所示，獲得一條特異的條帶，經(jīng)測(cè)序確認(rèn)，此條帶大小為1 400 bp，與預(yù)期結(jié)果吻合。根據(jù)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行后續(xù)分析。

圖3 3′RACE產(chǎn)物的電泳檢測(cè)Fig.3 Electrophoresis of 3′ RACE products ampli fi cation

圖4 5′RACE產(chǎn)物電泳檢測(cè)Fig.4 Electrophoresis of 5′ RACE products ampli fi cation

圖5 delta-8的RT-PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)Fig.5 Electrophoresis of RT-PCR products ampli fi cation of delta-8 gene

2.4 Delta 8基因的序列分析

對(duì)delta 8基因全長(zhǎng)cDNA測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接后分析，如圖6所示，delta 8基因全長(zhǎng)1 787 bp，ORF的長(zhǎng)度為1 344 bp，編碼447個(gè)氨基酸，5′非編碼區(qū)長(zhǎng)243 bp，3′非編碼區(qū)的長(zhǎng)度為200 bp，3′末端有14個(gè)多聚A的poly A尾。

圖6 油桐delta-8 全長(zhǎng)cDNA序列及推導(dǎo)氨基酸序列Fig.6 Nucleotide sequences and deduced amino acid sequences of Delta-8 cDNA from V.fordii

表1 delta-8 全長(zhǎng)cDNA序列的Blastn結(jié)果Table 1 Blastn results of full-length cDNA of delta-8

油桐delta 8基因全長(zhǎng)cDNA序列在NCBI的Blastn結(jié)果如表1所示，從表中的數(shù)據(jù)可得知油桐與蓖麻的fatty acid desaturase(putative)相似性最高，達(dá)到了83％，與毛果楊fatty acid desaturase/cytochrome b5 fusion protein、毛白楊delta8-sphingolipid desaturase(D8A、D8B)的相似性均達(dá)82％。

將推導(dǎo)的氨基酸序列提交到網(wǎng)上進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能預(yù)測(cè)，整個(gè)蛋白質(zhì)是表現(xiàn)出疏水性的，有七個(gè)可能性較大的跨膜區(qū)域，可能不存在信號(hào)肽的切割位點(diǎn)，是一個(gè)非分泌性蛋白；二級(jí)結(jié)構(gòu)以α螺旋結(jié)構(gòu)和無規(guī)則卷曲為主，通過在線分析delta 8蛋白結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)在7～80 aa位置存在一個(gè)Cyt-b5(細(xì)胞色素b5)結(jié)構(gòu)域，在第136～408 aa位置存在一個(gè)FA_desaturase結(jié)構(gòu)域。

將推導(dǎo)出的油桐delta 8去飽和酶氨基酸序列與其它植物相關(guān)的氨基酸序列用MEGA4.1軟件進(jìn)行UPGMA進(jìn)化樹分析，如圖7所示，油桐delta 8去飽和酶與蓖麻脂肪酸去飽和酶同源基因(Rc FAD-like)親緣關(guān)系最近，并與毛白楊D8去飽和酶(Pt D8SD)、大豆D8去飽和酶同源基因(Gm D8SD-like)、可可delta 8去飽和酶同源基因(Tc D8-like)聚為一類，與其它相關(guān)酶如黃瓜D8去飽和酶1(Cs D8SD1)、香瓜D8去飽和酶(Cm D8SD)、鷹嘴豆D8去飽和酶同源基因(Ca D8-like)、苜蓿D8去飽和酶(Mt D8SD)、葡萄FAD3去飽和酶(Vv FAD3)等都具有一定的親緣關(guān)系；而同為大戟科的麻瘋樹D8去飽和酶(Jc D8SD)卻與油茶D6去飽和酶(Co D6)聚為一類，它們與油桐delta 8去飽和酶親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。

圖7 油桐delta 8與其它植物相關(guān)酶基因的的進(jìn)化樹Fig.7 UPGMA evolution tree based on delta 8 of V.fordii and related desaturase genes from other plants

4 討 論

油桐delta 8脫飽和酶的序列分析顯示，在氨基酸序列的N端存在一個(gè)細(xì)胞色素B5結(jié)構(gòu)域，在靠近C端存在一個(gè)FA_desaturase結(jié)構(gòu)域，進(jìn)化分析表明，delta 8脫飽和酶與某些其它脂肪酸去飽和酶如FAD3、delta 6脂肪酸去飽和酶有一定的親緣關(guān)系，這可能與脂肪酸去飽和酶共同的FA_desaturase結(jié)構(gòu)域有關(guān)。Federico等[11]在研究煙草中delta6去飽和酶活性時(shí)，克隆到了一個(gè)delta 8去飽和酶，進(jìn)化分析表明煙草delta 8去飽和酶與玻璃苣、青檀delta 6去飽和酶聚為一類。它在煙草的花、葉、果實(shí)及發(fā)育中的種子中大量表達(dá)，且表達(dá)量與發(fā)育階段緊密相關(guān)，在生長(zhǎng)旺盛的組織中表達(dá)量最高，這種表達(dá)模式與已鑒定的紫草科植物delta 6?；ワ柡兔割愃啤６诮湍钢斜磉_(dá)煙草delta 8去飽和酶基因的結(jié)果顯示，此酶無delta 6去飽和酶活性，卻能在鞘脂delta 8位置引入雙鍵，使之脫飽和。delta 8鞘脂去飽和酶在植物中分布更廣泛，而delta 6酰基去飽和酶的分布更受限制[12]，有可能delta 8去飽和酶比delta 6去飽和酶在進(jìn)化上更加原始，而且不同delta 8去飽和酶可能具有不同的鞘脂底物偏好性[13-17]。

本實(shí)驗(yàn)通過設(shè)計(jì)油桐delta 8基因簡(jiǎn)并引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到delta 8基因中間部分cDNA序列，然后在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)5′ RACE和3′RACE引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增分別得到5′端和3′端部分cDNA，將簡(jiǎn)并片段、5′ RACE和3′RACE部分cDNA序列進(jìn)行拼接后，得到理論全長(zhǎng)cDNA序列，通過設(shè)計(jì)完整編碼區(qū)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到完整編碼區(qū)序列，為油桐delta 8基因的結(jié)構(gòu)和功能研究，及轉(zhuǎn)基因應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，delta 8脫飽和酶已從麻瘋樹、煙草等多種植物中克隆出來，但油桐中delta 8基因的研究為首次報(bào)道。今后可在此研究基礎(chǔ)上，構(gòu)建原核及真核表達(dá)載體，進(jìn)行目的蛋白的檢測(cè)，并鑒定酶活性，以及轉(zhuǎn)基因研究等。

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Molecular cloning of full-length cDNA of delta 8 fatty acid desaturase gene from Vernicia fordii

LONG Hong-xu,TAN Xiao-feng,ZHANG Lin,ZENG Yan-ling,LI Ze,WAN Zhe
(Key Lab.of Non-wood Forest Products of State Forestry Administration,Central South University of Forestry and Technology,Changsha 410004,Hunan,China)

Tung oil of Vernicia fordii is the high-quality raw material for bio-diesel.Delta 8 fatty acid desaturase gene is related with the biosynthesis of plant membrane lipids,sphingomyelin biosynthesis and the cell signaling pathway.Full-length cDNA sequence of delta 8 desaturase gene was obtained for the fi rst time by using methods of degenerate PCR,3’ RACE and 5’ RACE from maturing seed of V.fordii.Gene’s full-length is 1 787 bp and contained a 1 344 bp ORF(open reading frame),encoding a peptide of 447amino acids.The results of comparative analysis show that delta 8 fatty acid desaturase gene from V.fordii had a high similarity to those of other plants,of them,the similarity of V.fordii to Ricinus communis delta 8 gene reached 83％.The fi ndings laya foundation for revealing the lipid synthesis pathway and molecular directed breeding.

Vernicia fordii; delta 8 desaturase; degenerate PCR; RACE; gene cloning

S794.3

A

1673-923X(2015)07-0012-05

10.14067/j.cnki.1673-923x.2015.07.003

2014-10-10

國(guó)家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)重大項(xiàng)目(201204403)；湖南省研究生科研創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目(CX2014B327)

龍洪旭，博士研究生

譚曉風(fēng)，教授，博士，博士研究生導(dǎo)師；E-mail：tanxiaofengcn@126.com.cn

龍洪旭，譚曉風(fēng)，張 琳，等.油桐delta 8脫飽和酶基因的全長(zhǎng)cDNA克隆及序列分析[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2015,35(7)：12-16,26.

[本文編校：吳 毅]