張小波

芙蓉散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立

張小波

目的：建立院內(nèi)制劑芙蓉散的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用薄層色譜法對(duì)芙蓉散中黃芩、大黃、小檗堿和冰片進(jìn)行定性鑒別；采用高效液相色譜法（HPLC）方法，色譜柱：Kromasil C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)，流動(dòng)相：甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2）；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫：35℃；測(cè)定芙蓉散中黃芩苷的含量。結(jié)果：黃芩、大黃、小檗堿和冰片薄層色譜法（TLC）鑒別具有較好的專屬性，陰性對(duì)照無(wú)干擾。以黃芩苷進(jìn)樣濃度(X)對(duì)峰面積(Y)進(jìn)行線性擬合，得黃芩苷回歸方程為：Y=5.494 06e-007X-0.003 888 11，r=0.9997；線性范圍為1.242～0.0828 μg呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。測(cè)得黃芩苷平均回收率為98.3%，RSD為1.94%。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、專屬性及重現(xiàn)性好，可作為芙蓉散的質(zhì)量控制方法。

芙蓉散；黃芩苷；含量測(cè)定；高效液相色譜法；薄層色譜法

芙蓉散是我院多年來(lái)生產(chǎn)的制劑，臨床主要具有清熱、解毒、涼血的功能，用于瘡癰初起，尚未潰膿。芙蓉散的主要成分為黃芩、大黃、澤蘭、芙蓉葉、黃柏。其中黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效[1-2]，黃芩中主要成分為黃芩苷，在許多中藥制劑中作為質(zhì)控指標(biāo)之一。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道采用高效液相色譜法（high-performance liquid chromatography,HPLC）方法測(cè)定黃芩苷含量[3-5]，但芙蓉散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[6]中尚無(wú)含量測(cè)定方法，因此我們采用薄層色譜法（thin layer chromatography,TLC）方法對(duì)芙蓉散中的主要藥材進(jìn)行定性鑒別，并采用HPLC法測(cè)定黃芩苷含量，建立了芙蓉散的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、專屬性及重現(xiàn)性好，可作為芙蓉散的質(zhì)量控制方法。

1　材料與方法

1.1儀器高效液相系統(tǒng)包括：SSIPC2000色譜泵（美國(guó)），SPD210Avp紫外檢測(cè)器(日本島津公司)和7725型進(jìn)樣器(美國(guó)Rheodyne公司)；ANASTAR色譜工作站(天津奧泰科技有限公司)。

1.2材料黃芩藥材（天津市南開(kāi)醫(yī)院采購(gòu)）；芙蓉散（本院制劑）；鹽酸小檗酸（110713-200208），大黃對(duì)照藥材（120902-200609），黃芩苷（110715-201318），黃柏對(duì)照藥材（121510-200702），冰片對(duì)照品（743-8902）以上對(duì)照品和對(duì)照藥材均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所；國(guó)產(chǎn)硅膠G預(yù)制板（青島海洋化工廠）；色譜純甲醇(美國(guó)Fisher公司)，雙蒸去離子水(實(shí)驗(yàn)室自制)，其余試劑為化學(xué)純。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1TLC鑒別黃芩鑒別：取本品5 g，加甲醇25 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液蒸干,殘?jiān)铀?0 mL使溶解，加鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2～3，用乙酸乙酯提取2次，每次25 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取黃芩苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄VI B）試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各4～6μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（5∶3∶1∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以3%三氯化鐵乙醇溶液。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

大黃鑒別：取本品10 g，加甲醇30 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，加鹽酸1 mL，加熱回流30 min，立即冷卻，用乙醚提取2次，每次20 mL，合并乙醚液，揮干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取大黃對(duì)照藥材0.1 g，加甲醇10 mL，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄VI B)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各4～6μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（30～60℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）的上層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置氨蒸氣中熏至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

黃柏鑒別：取本品5 g，加甲醇20 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取鹽酸小檗堿對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄VIB）試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各4～6μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-異丙醇-濃氨試液（12∶6∶3∶3∶0.6）為展開(kāi)劑，置氨蒸氣預(yù)飽和的展開(kāi)缸內(nèi)，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

冰片的鑒別：取本品10 g，加乙醚30 mL，超聲處理10 min，濾過(guò)，濾液揮干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，加水40 mL，混勻，用石油醚（30～60℃）提取2次，每次25 mL，合并石油醚液，揮干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液。另取冰片對(duì)照品，加乙醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄VIB）試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各2～4μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯（17∶5）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

1.3.2黃芩苷含量測(cè)定色譜條件色譜柱：Kromasil C18(150 mm×4.6 mm，5μm)，流動(dòng)相：甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2）；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量20μL。

溶液配制：（1）對(duì)照品溶液，稱取黃芩苷對(duì)照品一定量，用甲醇溶解并稀釋成每1 mL含黃芩苷82.8μg的溶液，即得。（2）樣品溶液，稱取芙蓉散粉末0.25 g，精密稱定，置于25 mL容量瓶中，加入70%乙醇20 mL，超聲處理30 min，取出放置室溫，加70%乙醇至刻度，搖勻，慮過(guò)，精密吸取續(xù)濾液1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻，過(guò)0.45μm慮膜，即可。（3）陰性對(duì)照溶液，缺項(xiàng)黃芩芙蓉散同上法制備。

2　結(jié)果

2.1TLC鑒別

2.1.1黃芩鑒別在薄層色譜中，在與黃芩苷對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的斑點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

2.1.2大黃鑒別在薄層色譜中，在與大黃對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的斑點(diǎn)。見(jiàn)圖2。

圖1　黃芩TLC圖　

圖2　大黃TLC圖

2.1.3黃柏鑒別在薄層色譜中，在與鹽酸小檗堿對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的熒光斑點(diǎn)。見(jiàn)圖3。

2.1.4冰片鑒別在薄層色譜中，在與冰片對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的斑點(diǎn)。見(jiàn)圖4。

2.2黃芩苷含量測(cè)定

2.2.1系統(tǒng)適用性按照1.3.2項(xiàng)下色譜條件分析黃芩苷對(duì)照品溶液及芙蓉散、陰性對(duì)照溶液，色譜圖如圖5所示。理論塔板數(shù)以黃芩苷計(jì)大于3000；拖尾因子在0.95～1.05范圍內(nèi)；分離度均大于1.5，樣品中其它組分未干擾黃芩苷的測(cè)定。

圖3　黃柏TLC圖　

圖4　冰片TLC圖

圖5　黃芩苷對(duì)照品溶液

2.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線取黃芩苷對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣15.0μl、10.0μl、6.0μl、4.0μl、2.0μl、1.0μl，在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定。以黃芩苷進(jìn)樣濃度(X)對(duì)峰面積(Y)進(jìn)行線性擬合，得黃芩苷回歸方程為：Y= 5.494 06e-007X-0.003 888 11，r=0.9997；線性范圍為1.242～0.0828μg呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。

2.2.3精密度試驗(yàn)取黃芩苷對(duì)照品溶液，在上述色譜條件下分別重復(fù)進(jìn)樣6次，每次10μL，進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算結(jié)果黃芩苷在兩種溶液中峰面積的RSD分別為1.86%，表明該方法精密度較高。

2.2.4重復(fù)性試驗(yàn)取同一芙蓉散，按樣品制備方法平行制備6份樣品，按前述色譜條件進(jìn)樣分析，求得黃芩苷峰面積的RSD為1.84%。

2.2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)取黃芩苷對(duì)照品溶液，分別在0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h進(jìn)樣，按前述色譜條件進(jìn)樣分析，求得黃芩苷峰面積的RSD為1.79%。

2.2.6回收率試驗(yàn)準(zhǔn)確稱取已知含量的芙蓉散粉末6份，各0.125 g，分別加入對(duì)照品溶液適量，按上述方法處理，測(cè)得黃芩苷平均回收率為98.3%，RSD為1.94%，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.7樣品含量測(cè)定取3批芙蓉散供試品，按照2.2項(xiàng)下的方法進(jìn)行樣品處理，前述色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　不同批次樣品含量測(cè)定

3　討論

提取時(shí)間的考察，本實(shí)驗(yàn)比較了樣品超聲提取時(shí)間30 min和60 min，結(jié)果幾乎無(wú)差別，故提取時(shí)間定為30 min。

經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)，采用薄層色譜法對(duì)芙蓉散中黃芩、大黃、小檗堿和冰片進(jìn)行定性鑒別；建立了芙蓉散中黃芩苷的含量測(cè)定方法，為芙蓉散的的質(zhì)量監(jiān)控提供了可靠依據(jù)。

有文獻(xiàn)[7]研究表明，芙蓉散對(duì)角叉菜膠引起的大鼠足跖腫脹和醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高具有顯著抑制作用，能夠抑制和滅活常見(jiàn)淺表感染致病菌。芙蓉散處方中的黃柏中主要成分生物堿類，具有顯著的抗菌、抗炎、抗病毒作用[8]；抗?jié)兒涂垢窝鬃饔肹9]。文獻(xiàn)研究表明，黃柏提取物小檗堿具有降壓作用，小量的小檗堿可興奮心肌，增強(qiáng)其收縮力具有正性肌力作用，且發(fā)生作用較快；故小劑量小檗堿靜脈滴注用于心衰病人[10]。除上述主要藥理作用外，另有研究發(fā)現(xiàn)黃柏有抗氧化、抗痛風(fēng)、抗癌、利尿、健胃、外用促進(jìn)皮下溢血吸收等作用[11]。黃芩中有效成分為黃酮類化合物，具有明顯的抗菌、抗炎、抗過(guò)敏、抗氧化、抗致癌和抗病毒等作用[12]；藥學(xué)研究者Sang-Won Parkl等人還發(fā)現(xiàn)黃芩苷能夠有效防止由于四氯化碳導(dǎo)致的肝受損現(xiàn)象的產(chǎn)生，對(duì)肝細(xì)胞起到較好的保護(hù)作用；，其還具有降低血壓、防治糖尿病、冠心病、艾滋病等藥理作用[13]。大黃主要化學(xué)成分為蒽醌衍生物，其中游離型蒽醌衍生物主要有大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素甲醚和大黃酚，是大黃中主要的抗菌成分[14]。有研究報(bào)道以芙蓉葉為君藥、落得打、赤小豆等組成制成的復(fù)方芙蓉葉巴布膏在緩解急性踝關(guān)節(jié)損傷的腫脹方面，療效較顯著[15]。

我院為中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院在吳咸中院士的帶領(lǐng)下，逐漸摸索總結(jié)出一套中西醫(yī)結(jié)合治療闌尾膿腫的方法。中西醫(yī)結(jié)合治療闌尾膿腫，是在西醫(yī)抗炎補(bǔ)液的基礎(chǔ)上，通過(guò)口服中藥闌尾清解湯和外敷中藥（芙蓉散-以黃酒為引，調(diào)成糊狀，敷于患處）聯(lián)合使用起到清熱解毒、活血化瘀、排膿散結(jié)、通里攻下等功效，使膿腫加速吸收、消退，來(lái)達(dá)到治療效果[16]。外敷中藥是中西醫(yī)結(jié)合治療不可缺少的一環(huán)，本組患者經(jīng)中西結(jié)合治療在住院天數(shù)上明顯少于西醫(yī)治療組，住院費(fèi)用也相應(yīng)減少，炎癥消退快，治療效果卻明顯優(yōu)于西醫(yī)治療組[17]。本研究采用薄層色譜法對(duì)芙蓉散中黃芩、大黃、小檗堿和冰片進(jìn)行定性鑒別，對(duì)芙蓉散中黃芩苷的含量進(jìn)行測(cè)定，能夠有效控制芙蓉散的質(zhì)量，從而保證臨床療效。

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（收稿：2015-05-06修回：2015-08-26）

（責(zé)任編輯劉洪斌）

Establishment of Quality Standards for Lotus Powder

ZHANG Xiao-boDepartment of Pharmacy,Tian?jin Nankai Hospital,Tianjin(300100),China

ObjectiveTo establish the quality evaluation standard of hospital preparation of lotus powder. MethodsFor the identification of Radix Scutellariae,rhubarb,lotus powder berberine and borneol TLC and HPLC methods were used,the conditition of column chromatography was Kromasil C18(150 mm×4.6 mm,5 μm), the mobile phase of methanol-water-phosphate(47∶53∶0.2);the velocity:1 mL/min,and the detection wave length:280 nm;the column temperature:35℃;and determination of the content of Baicalin in lotus powder was done.ResultsBaicalin,rhubarb,berberine and borneol TLC identification showed good specificity,negative control without interference,the baicalin in sample concentration(x)of the linear fit to the peak area(y),baicalin regression equation showed Y=5.49406e-007X-0.00388811,r=0.9997;linear range for 1.242μg～0.0828μg showed good linear relationship.The average recovery of baicalin was found 98.3%,and RSD1.94%. ConclusionThis method is simple,accurate,specific and reproducible,so can be used for quality control of lotus powder.

Lotus powder;baicalin;content determination;high-performance liquid chromatography;thin lay?er chromatography

R285.6

A

1007-6948(2015)05-0485-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2015.05.013

天津市南開(kāi)醫(yī)院藥劑科（天津 300100）

張小波，E-mail：zhang xiao bo 6380@163.com