王 燕 張 慶河南安陽市第六人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 安陽 455000 2）寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 銀川 750004 3）寧夏顱腦疾病重點實驗室銀川750004

MRP1基因表達(dá)與耐藥性癲癇的相關(guān)性研究

王 燕1）張 慶2，3）△
1）河南安陽市第六人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 安陽 455000 2）寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 銀川 750004 3）寧夏顱腦疾病重點實驗室銀川750004

目的 研究MRP1基因表達(dá)與耐藥性癲癇的相關(guān)性。方法 選取90例符合診斷標(biāo)準(zhǔn)的癲癇患者，其中藥物敏感患者50例，癲癇耐藥患者40例。采用實時熒光定量PCR方法檢測癲癇患者外周血中MRP1基因mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果 耐藥性癲癇組MRP1基因mRNA表達(dá)量（9.52±1.38）高于藥物敏感組（1），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 癲癇患者外周血中MRP1的表達(dá)水平，可作為診斷耐藥性癲癇的參考指標(biāo)。

癲癇；耐藥性；MRP1基因；實時熒光定量PCR

癲癇是由多種病因引起的慢性腦功能障礙綜合征，以腦部神經(jīng)元反復(fù)超同步放電所致的突然、反復(fù)和短暫的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征。經(jīng)正規(guī)的抗癲癇藥物（antiepileptic drugs，AEDs）治療后，大部分患者癲癇發(fā)作可以控制或緩解，但仍有約30％的患者對各種AEDs不敏感，成為耐藥性癲癇［1-2］。關(guān)于癲癇的耐藥機制一直是研究熱點，但迄今為止仍未闡明。研究表明，多藥耐藥相關(guān)蛋白基因1（multidrug resistance-associated protein，MRP1）的高表達(dá)可能與癲癇耐藥存在一定的相關(guān)性。MRP1基因位于染色體16p13.1，轉(zhuǎn)錄一段7.8～8.2kb mRNA，編碼一種相對分子量為190的蛋白，命名為多藥耐藥相關(guān)蛋白1［3］。本研究中，我們對癲癇患者外周血中MRP1基因的mRNA表達(dá)水平進行檢測，進一步探討MRP1基因表達(dá)與癲癇耐藥的關(guān)聯(lián)。

1 資料與方法

1.1 研究對象及分組 本研究病例來源于2012-05—12在寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科癲癇門診就診的癲癇患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)臨床發(fā)作和（或）腦電圖發(fā)現(xiàn)癇樣放電確診的癲癇患者，且經(jīng)顱腦MRI或CT檢查未見進行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病或占位病變；（2）入選本研究前，患者應(yīng)用AEDs正規(guī)治療，且藥物血藥濃度在有效范圍內(nèi)或己達(dá)臨床常用最大劑量。耐藥組［4-5］癲癇患者入選標(biāo)準(zhǔn)：入組前1a至入組時癲癇發(fā)作較前減少＜50％者；且影響日常生活；藥物敏感組［4-5］癲癇患者入選標(biāo)準(zhǔn)：入組前1a至入組時癲癇發(fā)作較前減少≥50％者；（3）患者本人或其監(jiān)護人簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）服用MRP的底物類藥物（AEDs除外）和（或）抑制劑類藥物；（2）有嚴(yán)重器質(zhì)性疾病、先天性代謝異常疾病或腦炎、腦腫瘤、腦血管病等患者；（3）妊娠或哺乳期婦女。

1.2 試驗儀器及試劑 熒光定量PCR儀（美國伯樂公司，iQ5），臺式離心機（德國HERMLE公司），DYY-6D電泳儀（北京市六一儀器廠），凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD意大利米蘭）；紫外線分光儀（BIO-RAD美國）；HP1100高效液相色譜儀（安捷倫美國）。血液總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒均購自Promega北京生物技術(shù)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 總RNA提取：采集癲癇患者外周靜脈血約2mL，2h內(nèi)用RNA提取試劑盒從血液中提取總RNA。所提取的總RNA經(jīng)凝膠電泳檢測其完整性并使用紫外分光光度儀檢測其純度和濃度，要求A260／A280在1.8～2.0。

1.3.2 cDNA合成：反應(yīng)體系：MgCl24μL，反轉(zhuǎn)錄10×緩沖液2μL，dNTP混合物2μL，重組的RNasin核糖核酸酶抑制劑0.5μL，AMV反轉(zhuǎn)錄酶15U，Oligo（dT）引物0.5μg，總RNA 1μg，加無核酸酶的水至終體積為20μL。反應(yīng)條件：42℃溫育15min，95℃加熱5min，然后置于冰上5min，將cDNA放入-80℃冰箱保存，備用。

1.3.3 實時熒光定量PCR反應(yīng)：根據(jù)Genebank人類MRP1基因的cDNA序列，應(yīng)用引物設(shè)計軟件Primer 5.0設(shè)計引物，引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，擴增產(chǎn)物為124bp：Premier F：5＇-GTCATCCTTGCTCTCTACCTCCT-3＇；Premier R：5＇-CCTGATACGTCTTGGTCTTCATC-3＇；以β-actin作為內(nèi)參照，引物設(shè)計方法同上，擴增產(chǎn)物為205 bp：Premier F：5＇-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3＇，Premier R：5＇-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3＇。反應(yīng)體系：cDNA模板4μL，上、下游引物各1μL，Green qPCR SuperMix 12.5μL，加無酶水至25μL。反應(yīng)條件：94℃變性5min；94℃30s，62℃30s，72℃30s，重復(fù)40個循環(huán)；72℃7min，4℃保存。每例樣品設(shè)2個平行復(fù)孔，取平均值。反應(yīng)結(jié)束后，由軟件自動得出熒光反應(yīng)曲線以及每個標(biāo)本反應(yīng)體系的擴增效率（efficiency）及Ct值。

1.3.4 結(jié)果計算：本研究采用公式法（N＝2△△Ct）進行相對定量，比較不同基因的差異表達(dá)［6］。實驗結(jié)果計算如下：△Ct＝Ct目的基因-Ct內(nèi)參，△△Ct＝△Ct樣品-△Ct基準(zhǔn)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)檢驗后，2組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 耐藥組與敏感組癲癇患者一般資料比較 耐藥組與敏感組癲癇患者在性別、年齡、發(fā)病年齡、病程以及發(fā)作類型等方面比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。見表1。

表1 耐藥組與敏感組癲癇患者一般資料比較

2.2 2組MRP1和β-actin基因相對表達(dá)量比較 以藥物敏感組△Ct平均值作為校正數(shù)，結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），耐藥性癲癇組MRP1基因mRNA表達(dá)水平高于藥物敏感性癲癇組。結(jié)果見表2，擴增曲線見圖1。

表2 2組癲癇患者MRP1基因相對表達(dá)量比較

圖1 qPCR擴增曲線：A為MRP1基因擴增曲線，B為β-actin基因擴增曲線

3 討論

耐藥性癲癇的具體機制目前尚不清楚，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的文獻證實，MRP1基因在耐藥性癲癇患者腦組織中過度表達(dá)，在癲癇耐藥中起重要作用［7］。其參與的耐藥機制可能為：MRP1在血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）的血管內(nèi)皮細(xì)胞過度表達(dá)，通過主動轉(zhuǎn)運的方式將作為其底物的AEDs從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運至細(xì)胞外，使中樞致癇灶內(nèi)的AEDs難以達(dá)到有效的抗癲濃度，從而導(dǎo)致癲癇耐藥［8］。

近年來通過抑制轉(zhuǎn)運體機制的動物實驗及在體微透析技術(shù)，證明多種AEDs為MRP1蛋白的底物。Van Vliet EA等［9］在誘導(dǎo)癲癇持續(xù)狀態(tài)的大鼠模型中，檢測到MRP1基因的高表達(dá)后，給大鼠模型肌注苯妥英鈉，與野生型大鼠比較，大鼠腦中與血中苯妥英鈉濃度比明顯低于野生型。Hoffmann等［10］將大鼠模型的MRP1基因敲除后，檢測大鼠腦細(xì)胞間液苯妥英鈉濃度較未敲除MRP1基因的大鼠明顯增高。Potschka等［11］給予小鼠微透析模型局部灌注MRP1抑制劑-丙磺舒后發(fā)現(xiàn)，丙戊酸鈉、苯妥英、卡馬西平等抗癲癇藥物的腦細(xì)胞外液濃度明顯提高。馬愛梅等［12］通過建立癲癇大鼠模型，同樣給予丙磺舒干預(yù)后，向大鼠腹腔內(nèi)注射拉莫三嗪，發(fā)現(xiàn)丙磺舒干預(yù)組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞外液拉莫三嗪血藥濃度明顯高于未干預(yù)組。以上研究表明卡馬西平、苯妥英鈉、丙戊酸鈉、拉莫三嗪可能是MRP1的底物。為進一步探討MRP1基因與癲癇耐藥的關(guān)聯(lián)，我們從癲癇患者外周血中檢測MRP1基因的表達(dá)水平，并在癲癇耐藥組和藥物敏感組之間進行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)耐藥組癲癇患者外周血中MRP1基因mRNA表達(dá)水平高于癲癇藥物敏感組（P＜0.05）?；仡櫦韧鶉鴥?nèi)外對MRP1基因與癲癇耐藥的相關(guān)研究，結(jié)論與本研究一致。根據(jù)本研究結(jié)果我們推論：在耐藥性癲癇患者腦組織和外周血細(xì)胞中MRP1基因的表達(dá)水平可能是同步的，都呈過表達(dá)，且同樣參與了癲癇耐藥。今后我們可通過更進一步的研究探討兩者表達(dá)水平的確切關(guān)系及參與癲癇耐藥的具體機制。既往相關(guān)研究是從腦組織中取材檢測MRP1基因的表達(dá)水平，操作復(fù)雜，且不可能針對每一個癲癇病人，本研究則克服了上述缺點，取材簡單易行，快速檢測。關(guān)于MRP1基因高表達(dá)的具體機制，可能與基因多態(tài)性、癲癇發(fā)作頻率或長期應(yīng)用AEDs有關(guān)，也可能是多種因素和機制共同作用的結(jié)果。

雖然引起耐藥性癲癇患者MRP1基因過表達(dá)的具體機制不是十分清楚，但其仍有顯著的臨床應(yīng)用價值。通過檢測外周血中MRP1基因的表達(dá)水平，可作為一個診斷耐藥性癲癇的參考指標(biāo)，預(yù)測評估癲癇耐藥，這就為我們臨床診斷耐藥性癲癇提供了客觀依據(jù)。在臨床工作中，可適時檢測外周血中MRP1基因的表達(dá)水平，充分發(fā)揮其臨床應(yīng)用價值，如用藥前即檢測到MRP1基因呈高表達(dá)，則表示可能存在內(nèi)源性多藥耐藥；如治療中檢測發(fā)現(xiàn)MRP1基因的表達(dá)逐漸升高，則提示有可能發(fā)生癲癇耐藥，可有針對性地選擇藥物，制定合理的方案，盡可能減少耐藥性癲癇的發(fā)生。早期識別耐藥性癲癇，有利于早期選擇合適的治療，改善患者的預(yù)后。對MRP1底物的研究，是為在癲癇治療上開辟新的途徑。如檢測到癲癇患者MRP1呈高表達(dá)，我們可避免應(yīng)用作為其底物的AEDs，或在其基礎(chǔ)上添加MRP1抑制劑。目前研究發(fā)現(xiàn)，丙磺舒、磺吡酮、苯溴馬隆等可作為MRP1的抑制劑［13］，通過抑制腦組織中MRP1對藥物的外排作用及抑制耐藥性癲癇患者腦及其他臟器MRP1的高表達(dá)，從而加強抗癲癇作用。但鑒于MRP1抑制劑對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的不良反應(yīng)，目前應(yīng)用受限。故對MRP1底物及其抑制劑的進一步研究，是目前癲癇研究領(lǐng)域的新目標(biāo)。

［1］Soranzo N，Cavalleri GL，Weale ME，et al.Identifying candidate causal variants responsible for altered activity of the ABCB1multidrug resistance gene［J］.Genome Research，2004，1 314（7）：1 333-1 344.

［2］Hung CC，Tai JJ，Lin CJ，et al.Complex haplotypic effects of the ABCB1gene on epilepsy treatment response［J］.Pharmacogenomics，2005，6（4）：411-417.

［3］Cole SP，Bhardwaj G，Gerlach JH，et al.Overexpression of a transporter gene in a multidrug-resistant human lung cancer cell line［J］.Science，1992，258：1 650-1 654.

［4］Steffen B，Maren F，Carlos LT，et al.Valproic Acid Is Not a Substrate for P-glycoprotein or Multidrug Resistance Proteins 1 and 2in a Number of in Vitro and in Vivo Transport Assays ［J］.Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，2007，320：331-343.

［5］Van Vliet EA，Redeker S，Amnica E.Expression of multidrug transporter MRP1，MRP2and BCRP shortly after status epileptieus，during the latent period，and in chronic epileptic rats ［J］.epilepsia，2005，46（10）：1 569-1 580.

［6］紀(jì)冬，辛紹杰.實時熒光定量PCR的發(fā)展和數(shù)據(jù)分析［J］.生物技術(shù)通訊，2009，4（20）：598-600.

［7］趙廣健.多藥耐藥相關(guān)蛋白與難治性癲癇［J］.國際神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)雜志，2011，38（4）：338-341.

［8］Remy S，Beck H.Molecular and cellular mechanisms of pharmaco resistance in epilepsy［J］.Brain，2006，129：18-35.

［9］van Vliet EA，Redeker S，Aroniea E，et al.Expression of multidrug transporters MRP1，MRP2，and BCRP shortly after status epflepfieus，during the latent period，and in chronic epileptic rats［J］.Epilepsia，2005，46（10）：1 569-1 580.

［10］Hoffmann K，lawher W.Upregulation of brain expression of P-glycoprotein in MRP2-deficient TR-Rats resembles seizureinduced up-regulation of this drug efflux transporter in nomud rats［J］.Epilepsia，2007，48（4）：631-645.

［11］Potschka H，F(xiàn)edmwitz M，Loscher W.P-glycoprotein and multidmg resistance-associated protein are involved in the regulation of extracellular levels of the major antiepileptic drug carbamazepine in the brain［J］.Neuroreport，200l，12 （16）：3 557-3 660.

［12］馬愛梅，張守文，劉玉璽，等．多藥轉(zhuǎn)運蛋白對匹羅卡品癲癇大鼠模型腦內(nèi)拉莫三嗪濃度的影響［J］.中華神經(jīng)科雜志，2009，42（8）：551-554.

［13］Keppler D.Multidrug resistance proteins（MRPs，ABCCs）：importance for pathophysiology and drug therapy［J］.Handb Exp Pharmacol，2011，201：299-323.

（收稿2014-03-20）

Study on the correlation of between MRP1 gene expression and drug-resistance epilepsy

Wang Yan*，Zhang Qing
＊Department of Neurotogy，the sixth People＇s Hospital of Anyang，Anyang455001，China

Objective To investigate the correlation of between MRP1gene expression and drug-resistance epilepsy.Methods 90with epilepsy were divided into 50cases of AEDs sensitive patients and 40cases of AEDs resistance patients.The mRNA expression of MRP1gene was detected by Real-time fluorescent quantitation PCR.Results The mRNA expression quantity of MRP1gene in AEDs resistance patients was higher than that in AEDs sensitive patients（9.52±1.38vs 1），which had significant difference（P＜0.05）.Conclusion The expression level of MRP1gene in peripheral blood can be used an index to evaluate the drug-resistance epilepsy in epilepsy patients.

Epilepsy；Drug-resistance；MRP1gene；Real-time fluorescent quantitation PCR

R742.1

A

1673-5110（2015）02-0008-03

2011年度寧夏自治區(qū)科技攻關(guān)項目；2012年度寧夏醫(yī)科大學(xué)校級項目

△通訊作者：張慶，E-mail：nxzhangqing＠aliyun.com