唐 甜 葛 偉

（武漢大學人民醫(yī)院腫瘤Ⅱ科，武漢 430060）

RTN4和 TG2在增生期血管瘤組織中高表達及其臨床意義

唐 甜 葛 偉

（武漢大學人民醫(yī)院腫瘤Ⅱ科，武漢 430060）

目的 探討 RTN4和 TG2在人皮膚血管瘤組織中的表達及其臨床意義。方法 收集武漢大學人民醫(yī)院病理科2008年 －2011年皮膚毛細血管瘤存檔蠟塊40例，其中男性15例，女性25例。采用免疫組織化學S-P法檢測40例皮膚血管瘤增生期、退化期及正常皮膚組織RTN4和 TG2表達水平，采用圖像分析系統(tǒng)對 RTN4和 TG2的表達進行定量分析，并用 SPSS13.0軟件對各組免疫組織化學反應(yīng)陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率做單因素方差分析和 SNK（q）檢驗。結(jié)果 增生期組 RTN4的表達明顯高于退化期組和正常皮膚組，而后兩組比較差異無統(tǒng)計學意義；增生期組 TG2的表達明顯高于退化期組和正常皮膚組，而后兩組比較差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)論 RTN4和 TG2在增生期血管瘤組織中的表達明顯高于正常皮膚組及退化組，提示RTN4和TG2在增生期血管瘤組織中表達上調(diào)，可能與瘤細胞的過度增殖，抗凋亡增強等有關(guān)。

血管瘤；RTN4；TG2；免疫組織化學

皮膚血管瘤是嬰幼兒最常見的良性血管腫瘤，是由血管形成異常而引起的疾病，血管瘤的自然病程經(jīng)歷增生期、退化期和退化完成期三個階段。血管瘤是通過未成熟的內(nèi)皮細胞彌散增殖而快速生長，之后自發(fā)消退。一般認為毛細血管內(nèi)皮細胞的增生與消退是血管瘤生長和消退的關(guān)鍵原因［l-2］。血管瘤雖然是一個良性腫瘤，本身對人體危害不大，一般不會發(fā)生生命危險，但是血管瘤生長的部位不同對人體的造成的危害的影響也不一樣，如：面部血管瘤會影響容貌、頭部血管瘤會影響頭發(fā)生長、生殖部位血管瘤會影響生育、肝血管瘤會影響肝功能等。往往給患者及其家人帶來極大痛苦，但關(guān)于血管瘤的發(fā)病機制，目前還未明了，因此對于皮膚血管瘤的臨床治療也是目前急待解決的關(guān)鍵問題。

RTN4又名 Nogo（Neurite Outgrowth Inhibitor ASY／RTN-X），RTN4是網(wǎng)狀蛋白家族的成員之一，包含三個剪切變體：RTN4A，RTN4B，RTN4C，每個剪切變體在不同的細胞中發(fā)揮不同的生物學功能，廣泛地參與了細胞分化成熟，增殖，凋亡，遷移，粘附，侵襲等各項功能的調(diào)控［3-4］。組織型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2（tissue transglutaminase 2，TG2）蛋白在人體分布較為廣泛（如血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞以及成纖維細胞等），在不同的細胞環(huán)境中發(fā)揮截然不同的生理功能，與組織纖維化、神經(jīng)退行性疾病、動脈粥樣硬化和癌癥等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近年來，大量研究表明 TG2在多數(shù)腫瘤細胞中上調(diào)表達，包括乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、結(jié)腸癌等［5-7］。但RTN4和 TG2在皮膚血管瘤組織中的表達尚未見報道。

本文應(yīng)用免疫組織化學方法和圖像分析技術(shù)檢測了血管瘤增生期、退化期以及正常皮膚組織中RTN4和TG2的表達水平，探討RTN4和TG2在血管瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機制，為臨床上治療血管瘤提供實驗依據(jù)。

材料和方法

1.材料

1.1 材料來源

收集武漢大學人民醫(yī)院病理科2008年－2011年皮膚毛細血管瘤存檔蠟塊 40例，其中男性 15例，女性25例。這些血管瘤所在的部位有頭皮、前額、眼瞼、耳背、頸部、背部、上臂、大腿、手和足的皮膚等?；颊咝g(shù)前均未做任何輔助性治療。

1.2 材料分組

將所有標本進行免疫組織化學 S-P法檢測增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA），按 Mulliken分類標準并結(jié)合 PCNA的表達進行分組：石蠟標本中增生期血管瘤 22例，退化期血管瘤18例。另取距癌組織 5cm外的周圍正常皮膚組織5例作對照。

1.3 主要試劑

即用型鼠抗人 PCNA單克隆抗體、兔抗人RTN4多克隆抗體、兔抗人 TG2單克隆抗體（購于北京中杉生物技術(shù)有限公司）；超敏即用型SP通用型免疫組織化學試劑盒（購于福州邁新公司）；DAB顯色試劑盒及多聚賴氨酸（購于北京中杉生物技術(shù)有限公司）。

2.方法

2.1 免疫組織化學 SP法染色

組織切片常規(guī)脫蠟入水；抗原修復（檸檬酸緩沖液微波抗原修復法）；滴加 3%過氧化氫，37℃濕盒孵育10min以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性；正常羊血清37℃濕盒孵育 10min以減少非特異性背景；分別滴加一抗；滴加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物復合物37℃濕盒孵育；滴加新鮮配置的 DAB顯色液顯色；蘇木素復染；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片并鏡檢；用 PBS代替一抗作為陰性對照組，購買的陽性片作為RTN4及TG2的陽性對照組，人正常皮膚表皮作為 PCNA的陽性對照組。

2.2 免疫組織化學結(jié)果判斷

RTN4及TG2都是以胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)，PCNA以細胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)。陰性對照組除細胞核染成藍色外，應(yīng)無棕黃色反應(yīng)物。

2.3 統(tǒng)計學處理

采用 HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報告管理系統(tǒng)（同濟千屏影像公司）對RTN4及TG2的表達進行定量分析，每張切片隨機選取 5個完整而不重疊的高倍鏡視野（400×），測定每個視野下陽性反應(yīng)的平均光密度、陽性反應(yīng)面積和所有細胞總面積，計算陽性面積率。以每例 5個視野的平均光密度、陽性面積率的平均值作為該例的測量值。（陽性面積率 ＝單位面積中陽性反應(yīng)的總面積／單位面積中細胞的總面積 ×100%）

數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標準差表示，用 SPSS11.5軟件對各組免疫組織化學反應(yīng)陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率做單因素方差分析和 SNK（q）檢驗，檢驗水準α為0.05。

結(jié) 果

1.增生期血管瘤內(nèi)皮細胞 PCNA的表達強

增生期血管瘤內(nèi)皮細胞核肥大，核內(nèi)彌漫分布棕黃色顆粒，PCNA表達強（圖1）；退化期血管瘤內(nèi)皮細胞核扁平，胞核內(nèi)有少量棕黃色顆粒，PCNA表達弱（圖2）。

圖 1 增生期血管瘤PCNA的表達。增生的內(nèi)皮細胞核內(nèi)彌漫分布棕黃色顆粒（→），PCNA表達強，S-P 400×Fig.1 PCNA expression in proliferating hemangioma.There were plenty of brown particles in the nucleus of proliferating endothelial cells，which showed PCNA expressed strongly（→）.S-P 400×

2.增生期血管瘤內(nèi)皮細胞 RTN4的表達強

增生期血管瘤內(nèi)皮細胞胞漿內(nèi)有較多棕黃色顆粒，RTN4表達強（圖3）；退化期血管瘤內(nèi)皮細胞胞漿內(nèi)有較少的棕黃色顆粒，RTN4表達弱（圖4）；正常皮膚組織內(nèi)皮細胞胞漿內(nèi)有少量的棕黃色顆粒，RTN4表達弱（圖5）。圖像分析結(jié)果見表1。增生期血管瘤內(nèi)皮細胞 RTN4的表達顯著高于退化期血管瘤內(nèi)皮細胞和正常組織（P＜0.05），而后兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表1）。

圖3 增生期血管瘤RTN4的表達。內(nèi)皮細胞胞漿內(nèi)有較多棕黃色顆粒，RTN4表達強，S-P 400×Fig.3 RTN4 expression in proliferating hemangioma.There were plenty brown particles in cytoplasm the of proliferating endothelial cells，RTN4 expressed strongly（→）.S-P 400×

圖 4 退化期血管瘤RTN4的表達。內(nèi)皮細胞胞漿內(nèi)有少量棕黃色顆粒（→），RTN4表達弱（→）S-P 400×Fig.4 RTN4 expression in involuting hemangioma.There were few of brown particles in cytoplasm the of involuting endothelial cell，RTN4 expressed weakly（→）.S-P 400×

圖5 正常對照組 RTN4的表達。內(nèi)皮細胞胞漿內(nèi)有少量的棕黃色顆粒（→），RTN4表達弱，S-P 400×Fig.5 RTN4 expression in normal skin Group.There were few of brown particles in cytoplasm the of in normal skin endothelial cells，RTN4 expressed weakly（→）.S-P 400×

表1 血管瘤不同時期 RTN4表達的平均光密度和陽性面積率（（±s））Table 1 the average optical density and the rate of RTN4 positive area of in differ period of human dermal hemangiomas（（±s））

表1 血管瘤不同時期 RTN4表達的平均光密度和陽性面積率（（±s））Table 1 the average optical density and the rate of RTN4 positive area of in differ period of human dermal hemangiomas（（±s））

與退化期組比較*P＜0.05；與正常皮膚組比較△P ＞0.05；與增生期組比較▲P＜0.05*P＜0.05，comparison between proliferating hemangiomas and involuting hemangiomas；△P＞0.05，comparison between involuting hemangiomas and normal skin tissue；，▲P＜0.05，comparison between proliferating hemangiomas and normal skin tissue

數(shù) 平均光密度 陽性面積率Group N Average Optical Density Rate of Positive Area增生期組 22 0.3302±0.0130* 0.3027±0.0127組別 例* Proliferating Group退化期組 18 0.0847±0.0075△ 0.0902±0.0089△Involuting Group正常皮膚組 5 0.0824±0.0071▲ 0.0882±0.0086▲Normal Skin Group

3.增生期血管瘤內(nèi)皮細胞 TG2的表達強

增生期血管瘤內(nèi)皮細胞胞漿內(nèi)有較多棕黃色顆粒，TG2表達強（圖6）；退化期血管瘤內(nèi)皮細胞胞漿內(nèi)有較少的棕黃色顆粒，TG2表達弱（圖7）；正常皮膚組織內(nèi)皮細胞胞漿內(nèi)有少量的棕黃色顆粒，TG2表達弱（圖8）。圖像分析結(jié)果見表2。增生期血管瘤內(nèi)皮細胞 TG2的表達顯著高于退化期血管瘤內(nèi)皮細胞和正常組織 （P＜0.05），而后兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表2）。

圖6 增生期血管瘤 TG2的表達。血管瘤內(nèi)皮細胞胞漿內(nèi)有較多棕黃色顆粒（→），TG2表達強，S-P 400×Fig.6 TG2 expression in proliferating hemangioma.There were plenty of brown particles in cytoplasm the of proliferating endothelial cells，TG2 expressed strongly（→）.S-P 400×

圖7 退化期血管瘤 TG2的表達。血管瘤內(nèi)皮細胞胞核或胞質(zhì)內(nèi)有較少棕黃色顆粒，TG2表達弱或無表達（→），S-P 400×Fig.7 TG2 expression in involuting hemangioma.There were few brown particles in cytoplasm the of involuting endothelial cells，TG2 expressed weakly（→）.S-P 400×

圖8 正常組TG2的表達。血管內(nèi)皮細胞胞核或胞質(zhì)內(nèi)有較少棕黃色顆粒，TG2表達弱或無表達（→），S-P 400×Fig.8 TG2 expression in normal skin Group.There were few brown particles in cytoplasm the of in normal skin endothelial cells，TG2 expressed weakly（→）.S-P 400×

表2 血管瘤不同時期 TG2表達的平均光密度和陽性面積率（（±s））Table 2 The average optical density and the rate of TG2 positive area of in differ period of human dermal hemangiomas（（±s））

表2 血管瘤不同時期 TG2表達的平均光密度和陽性面積率（（±s））Table 2 The average optical density and the rate of TG2 positive area of in differ period of human dermal hemangiomas（（±s））

*P＜0.05，與退化期組比較；△P ＞0.05，與正常皮膚組比較；▲P＜0.05，與增生期組比較*P＜0.05，comparison between proliferating hemangiomas and involuting hemangiomas；△P＞0.05，comparison between involuting hemangiomas and normal skin tissue；▲P＜0.05，comparison between proliferating hemangiomas and normal skin tissue

數(shù) 平均光密度 陽性面積率Group N Average Optical Density Rate of Positive Area組別 例增生期組 22 0.3103±0.0124* 0.3264±0.0125*Proliferating Group退化期組 18 0.0920±0.0089△ 0.0941±0.0098△Involuting Group正常皮膚組 5 0.0915±0.0085▲ 0.930±0.0087▲Normal Skin Group

討 論

皮膚血管瘤是一種常見的良性腫瘤，在嬰幼兒中發(fā)病率較高，新生兒的患病率為1.1%－3.8%，至1歲時可高達10%。皮膚血管瘤的自然病程經(jīng)歷增生期、退化期和退化完成期三個階段。該良性腫瘤通過未成熟的內(nèi)皮細胞彌散增殖而快速生長，之后自發(fā)消退。一般認為毛細血管內(nèi)皮細胞的增生與消退是血管瘤生長和消退的關(guān)鍵原因。腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制亦涉及到血管內(nèi)皮細胞的變化［8-9］。目前關(guān)于治療血管瘤方法的成效并不十分顯著，一些治療模式的副作用也限制了其應(yīng)用。因此探討皮膚血管瘤的發(fā)病機制對臨床上治療血管瘤有著重要的意義。

RTN4屬于髓鞘相關(guān)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白成員，廣泛存在于高等真核生物中，有三個主要的異構(gòu)體，即RTN4-A、B、C。它們具有不同的N-末端序列和一個共同的C-末端，其中 C-末端約 190個氨基酸殘基組成，包括兩個跨膜區(qū)、Nogo-66親水環(huán)，以及一段親水尾，統(tǒng)稱為RHD區(qū)。根據(jù)RHD跨膜區(qū)節(jié)段數(shù)的不同又提出了兩種特殊的拓撲結(jié)構(gòu)，即馬蹄狀和 ω-形，也因此賦予了 RTN4蛋白不同的生物學功能［10］。因為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的定位膜蛋白，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能又與蛋白質(zhì)的分泌密切相關(guān)，所以推測 RTN4的功能涉及蛋白的分泌加工過程，最早被作為神經(jīng)內(nèi)分泌特異性蛋白的標記［11］。近年來，關(guān)于 RTN4與瘤細胞凋亡之間的關(guān)系存在很大爭議。Tagami等［12］報道，RTN4B在腫瘤細胞中具有一定的促凋亡傾向，他們發(fā)現(xiàn)過量表達的 RTN4B能夠干擾凋亡抑制因子Bcl-2、Bcl-xL的活性，誘導腫瘤細胞的凋亡。最近，又有研究認為 RTN4通過介導 Drs基因誘導凋亡，但研究僅證實了 RTN4可與 Drs蛋白產(chǎn)生交聯(lián)反應(yīng)，并沒有進一步證實 RTN4是 Drs凋亡中必不可少的凋亡分子［13-14］。

TG2為一類結(jié)構(gòu)功能復雜的蛋白質(zhì)，由四個結(jié)構(gòu)域組成，行使功能的主要為α／β催化核心區(qū)，通過轉(zhuǎn)氨基作用來實現(xiàn)蛋白質(zhì)分子間的共價交聯(lián)反應(yīng)，對蛋白質(zhì)進行翻譯后修飾，從而改變它們的結(jié)構(gòu)，功能及穩(wěn)定性。TG2除了催化鈣依賴性的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，還可以結(jié)合并水解 GTP／ATP，同時也具有蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶活性，甚至在細胞信號傳導過程中充當 G-蛋白的功能［15］。TG2蛋白在人體分布較為廣泛（如血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞以及成纖維細胞等），主要為細胞內(nèi)蛋白質(zhì)，定位在細胞質(zhì)、細胞核、細胞膜等，部分還能分泌到胞外基質(zhì)中，在不同的細胞環(huán)境中發(fā)揮截然不同的生理功能，與組織纖維化、神經(jīng)退行性疾病、動脈粥樣硬化和癌癥等疾病密切相關(guān)［16］。由此可見，TG2的功能取決于它在細胞的定位及其與其它蛋白、輔助因子之間的相互作用所決定。盡管 TG2與腫瘤的關(guān)系較為復雜，在不同組織和細胞中的功能也不盡相同，但隨著對 TG2研究的深入，其各種生物學機制也不斷被揭示，將可能為腫瘤的診斷、療效及預(yù)后提供新的線索。

本研究發(fā)現(xiàn)，RTN4和 TG2蛋白在增生期血管瘤組織中的表達明顯高于正常皮膚組及退化組，推測 RTN4和TG2蛋白在增生期血管瘤組織中呈高表達，導致增生期血管瘤組織內(nèi)皮細胞不斷增殖，使血管瘤不斷發(fā)展，而 RTN4和 TG2蛋白在退化期血管瘤組織中呈低表達，推測 RTN4和 TG2蛋白在退化期血管瘤組織中抗凋亡作用變化有關(guān)。這些結(jié)果預(yù)示RTN4和 TG2蛋白與血管瘤的發(fā)生存在一定關(guān)聯(lián)，將為進一步探討 RTN4和 TG2蛋白在血管瘤發(fā)生和發(fā)展分子機制的研究提供有力的實驗依據(jù)。

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High expression and significance of RTN4 and TG2 in human dermal hemangiomas

Tang Tian，Ge Wei
（Department of Oncology，Renmin Hospital of Wuhan University，Wuhan 430060，China）

Objective To study the expression and clinical significance of RTN4 and TG2 in human dermal hemangiomas. Methods Specimens from 40 cases（15 males and 25 females）of hemangioma were collected from the Department of Pathology in Renmin Hospital of Wuhan University from 2008 to 2011.We examined the expression of RTN4 and TG2 in proliferative，involuting derml hemangiomas and normal skin tissues by using immunohistochemical technique.Average optical density and positive area rates of expression of RTN4 and TG2 were measured by image analysis（HPIAS-1000）.The single factor analysis of variance and SNK test（q）of average optical density and positive area rates were conducted by SPSS13.0 software.Results The expression of RTN4 was obviously higher in the proliferative phase than in involuting hemangioma and normal skin.No significant difference was found in the expression of RTN4 between involuting hemangioma and normal skin.The expression of TG2 was obviously higher in the proliferative phase than in involuting hemangioma and normal skin.No significant difference was found in the expression of TG2 between involuting hemangioma and normal skin.Conclusion The expressions of RTN4 and TG2 are obviously higher in proliferative hemangioma than in involuting hemangioma and normal skin，which suggests that RTN4 and TG2 are closely correlated with cells apoptosis and proliferation.

Hemangiomas；RTN4；TG2；Immunohistochemical

R735.1

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2015.05.009

2015-06-06

2015-09-10

〔項目來源〕國家自然科學基金（青年基金）資助項目（81402242）；湖北省自然科學基金（青年基金）（2014CFB419）

唐甜，女（1981年），漢族 ，主治醫(yī)師