胡昌清楊 楊陳 靜豐 雷④史曉寧田騰飛甄 龍王 剛⑤

急性期精神分裂癥5-HT轉(zhuǎn)運體mRNA表達研究*

胡昌清①②楊 楊①陳 靜③豐 雷①④史曉寧①田騰飛①甄 龍①王 剛①⑤

目的：探討急性期精神分裂癥與正常人群比較，外周血粒細胞5-HT轉(zhuǎn)運體（Serotonin Transporter，SERT）mRNA表達水平的差異及各組SERT mRNA表達水平的性別差異。方法：選取2013年5月-11月于本院就診的精神分裂癥急性期患者44例為患者組，另選取與患者組性別、年齡匹配的正常人群42例為對照組，收集人口學資料，以陽性和陰性癥狀量表（PANSS）評估患者的癥狀嚴重程度，采用RT-PCR方法測定受試者的SERTmRNA表達水平。結(jié)果：精神分裂癥患者組外周血粒細胞SERT mRNA表達水平高于正常對照組，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。兩組不同性別的SERT mRNA表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)論：外周血粒細胞SERT mRNA表達水平增高可能是潛在的精神分裂癥急性期生物學標記物之一。

精神分裂癥； 5-HT轉(zhuǎn)運體； mRNA表達； RT-PCR

精神分裂癥是一種常見的病因尚未完全闡明的重性精神病。因為其病程易慢性化，有致殘性，且終身患病率較高，約為1％，它的發(fā)病機制一直是精神科的研究熱點[1]。在眾多的病因?qū)W假說中，神經(jīng)遞質(zhì)失調(diào)學說占據(jù)重要地位。5-HT是重要的神經(jīng)遞質(zhì)之一，它與許多神經(jīng)精神疾病的行為表現(xiàn)和軀體功能可能相關(guān)，主要受到5HT轉(zhuǎn)運體（SERT）的調(diào)節(jié)[2-4]。

國內(nèi)外的研究表明：精神分裂癥患者的SERT可能存在異常，但結(jié)論不一[5-13]。然而，這些研究大多數(shù)為基因多態(tài)性研究，很少涉及轉(zhuǎn)錄水平，在有限的涉及SERT mRNA研究中，大部分數(shù)據(jù)來自于尸腦或動物，僅小部分數(shù)據(jù)來源于急性期精神分裂癥患者。但是，由于這些研究所選的受試者多是正在接受抗精神病藥物治療的患者，而目前越來越多的學者認為藥物治療對基因表達可能產(chǎn)生影響，故本文探討未經(jīng)治療的精神分裂癥患者外周血粒細胞SERT mRNA表達水平與正常對照的差異性，進一步探求精神分裂癥病因?qū)W的分子遺傳學基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 急性期精神分裂癥患者組由2013年5-11月在首都醫(yī)科大學附屬北京安定醫(yī)院就診的精神分裂癥患者中抽取，共44例，其中男34例，女10例，平均年齡（33.86±11.27）歲。正常對照組為同期北京市社區(qū)的正常人群，共42例，男25例，女17例，平均年齡（31.61±8.10）歲。兩組研究對象的性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）?；颊呓M的平均發(fā)病年齡為（25.55±9.02）歲，平均病程為（99.82±88.14）個月?；疾〗M：符合美國精神障礙與行為問題診斷標準第四版（DSM-Ⅳ）精神分裂癥的診斷標準，由2名高年資主治醫(yī)師確診為精神分裂癥，年齡在18～60歲，漢族，簽署知情同意書，入組時陽性與陰性癥狀量表（PANSS）＞70分，除外其他精神疾病或物質(zhì)濫用史，除外就診前2個月內(nèi)正在接受系統(tǒng)精神科藥物治療和無抽搐電痙攣治療（MECT）的患者，除外重大軀體疾病及無法配合取血者。正常對照組：目前無符合DSM-Ⅳ診斷標準的精神疾病，年齡在18～60歲，漢族，簽署知情同意書，無重大軀體疾病及精神疾病家族史。

1.2 方法

1.2.1 自編一般情況調(diào)查表 包括受試者年齡、性別、起病年齡、初治時間、停藥時間等，目前診斷，家族史等，由研究者詢問受試者并參考既往病歷記錄后據(jù)實填寫。

1.2.2 樣本采集 所有受試者于入組當天用EDTA管取肘靜脈血1次2 mL，血液標本在采集后3 h內(nèi)進行總RNA的提取。

1.2.3 實驗室技術(shù)及檢測指標

1.2.3.1 總RNA提取 用Qiagen公司提取小量RNA，用試劑盒（QIAamp RNA Blood Mini Kit）提取新鮮全血中的總RNA，以紫外分光光度計（Biochrom公司）測定RNA的濃度和純度，要求紫外吸光值A(chǔ)260/A280≥1.8，計算出樣本的RNA含量，-80 ℃凍存。

1.2.3.2 cDNA合成及反應體系的建立 從樣本中提取2 μg總RNA，以Sigma公司的Enhanced Avian HS 反轉(zhuǎn)錄試劑盒對其進行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA模板。反應體系：cDNA模板 100 ng，SERT基因特異性PCR上下游引物各100 nM，Power SYBR Green I染料（美國 ABI公司）12.5 μL，制成25 μL的終體積。

1.2.3.3 引物設(shè)計合成 人類SERT引物參考hSERT編碼序列（GenBank 登記號NM_001045）進行設(shè)計合成，引物方向為5’端至3’端：上游是：GTGGTGAACTGCATGACGAG，下游是：GGCCACCTCAGACACATCTT。管家基因次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶1（HPRT）引物同樣參考其編碼序列（GenBank登記號 X62085）進行設(shè)計合成。

1.2.3.4 RT-PCR 使用Applied Biosystems 公司的2 X SYBR Green Master Mix 試劑盒，應用ABI Prism 7000型實時檢測擴增儀，通過兩步法PCR反應程序?qū)崿F(xiàn)對mRNA的定量表達。反應條件為：95 ℃預變性10 min，60 ℃復性和延伸45 s，95 ℃變性15 s，共做45個循環(huán)，并做溶解曲線以判定PCR產(chǎn)物的狀態(tài)?；驍U增后，由儀器自動讀取熒光信號數(shù)據(jù)，以域值（Ct）大小量化mRNA的表達水平。為了降低樣本之間RNA含量的內(nèi)在差異性，進一步提高反轉(zhuǎn)錄的效能，測定同一樣本中管家基因HPRT的表達水平，以此對SERT mRNA的表達水平進行標準化調(diào)整。用以下公式：倍數(shù)變化=2-ΔΔCt，△△Ct=待測基因Ct-管家基因（HPRT）Ct。

1.3 統(tǒng)計學處理 使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料采用（±s）表示，樣本的SERT mRNA表達水平的變化數(shù)值進行正態(tài)性檢驗，數(shù)據(jù)不符合正態(tài)性分布進行秩轉(zhuǎn)換后采用ANOVA進行統(tǒng)計學分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組SERT mRNA表達水平比較 通過ANOVA檢驗，患者組平均秩（0.294±0.950），對照組平均秩（-0.315±0.940），兩組SERT mRNA表達水平比較差異有統(tǒng)計學意義（F=8.805，P=0.004）?；颊呓MSERT mRNA表達水平明顯高于對照組，見圖1。分別對兩組中男女間SERT mRNA表達水平進行ANOVA檢驗，兩組不同性別間SERT mRNA表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.09），見表1。

圖1 兩組粒細胞SERT mRNA的表達**與對照組比較，P＜0.01

表1 兩組不同性別SERT mRNA表達水平結(jié)果比較

2.2 患者發(fā)病年齡、病程與SERT mRNA表達水平的關(guān)系 患者的發(fā)病年齡與SERT mRNA表達水平間無相關(guān)性，患者的病程與SERT mRNA表達水平間存在正相關(guān)（P＜0.05），見表2。

表2 患者發(fā)病年齡及病程與SERT mRNA表達水平的相關(guān)性比較

3 討論

本研究顯示精神分裂癥急性期患者較正常人的SERT mRNA表達水平明顯升高，間接說明患者組SERT的功能增強，與Govitrapong等[11]研究相符合，支持Joyce等[5]關(guān)于精神分裂癥Brodmann9區(qū)的5HTT mRNA表達水平增高的研究結(jié)果。既往發(fā)現(xiàn)吲哚類物質(zhì)，如麥角酸二乙酰胺（LSD）、仙人掌毒堿能夠引起精神病癥狀，便有學者提出精神分裂癥患者存在5-HT功能亢進。這一假說在多巴胺功能亢進假說提出后一度被忽略，隨著非典型性抗精神病藥物的問世又重獲關(guān)注[14-15]。此外，精神分裂癥患者5-HT受體密度降低，多巴胺（DA）轉(zhuǎn)運體和SERT的相互作用等，都可能導致突觸間隙內(nèi)的5-HT遞質(zhì)水平增加，SERT對5-HT遞質(zhì)的再攝取也會相應增加，SERT功能活躍，而SERT mRNA表達水平也會因此升高[16-21]。

眾所周知，不同性別也可能對基因表達水平產(chǎn)生影響，男性和女性體內(nèi)的5HT遞質(zhì)水平不同，而男性的SERT被認為是對全血的5HT水平起到定量的作用[22]。然而本研究顯示精神分裂癥組和正常對照組男女間的SERTmRNA的表達水平比較差異均無統(tǒng)計學意義，這一結(jié)果與Jun-ichi等[23]研究不同性別重性抑郁癥和正常對照5HTT mRNA的表達水平時類似，也可能與本研究的樣本量不大有關(guān)。

本研究顯示精神分裂癥患者病程越長，其SERT mRNA表達水平越高。精神分裂癥患者在起病初期癥狀尚未充分暴露，有時不易被識別，影響早期診治。隨著病程的延長，典型的精神分裂癥癥狀充分的表現(xiàn)出來，患者才開始接受抗精神病藥物治療。因此，SERT mRNA表達水平增高在某種程度上反映了精神分裂癥患者的疾病嚴重度。

本研究只是對急性期精神分裂癥患者SERT mRNA表達水平的初步探討，在今后的研究中，希望能夠收集SERT多態(tài)性信息，對藥物治療前后的患者進行動態(tài)SERT mRNA表達水平檢測，同時檢測同一樣本的DNA水平、蛋白水平，了解精神分裂癥患者SERT在轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平及表達水平的變化差異，更加深入細致的分析SERT在精神分裂癥中所起的作用。

[1]陳昌惠，沈漁村.中國七個地區(qū)精神分裂癥流行病學調(diào)查[J].中華精神科雜志，1998，31（2）：72-74.

[2] Lauder J M.Hormonal and humoral influences on brain development[J]. Psychoeuroendocrinology，1983，8（4）：121-155.

[3] Jacobs B L.Serotonin and behavior： emphasis on motor control[J].J Clin Psychiatry，1991，52（Suppl 1）：17-23.

[4] Fernstrom J D，Wurtman R J.Brain serotonin content：increase following ingestion of carbohydrate diet[J].Science，1971，174（6）：1023-1025.

[5] Joyce J N，Shane A，Lexow N，et al.Serotonin uptake sites and serotonin receptors are altered in the limbic system of schizophrenics[J]. Neuropsychopharmacology，1993，8（4）：315-336.

[6] Hernandez I，Sokolov B P.Abnormal expression of serotonin transporter mRNA in the frontal and temporal cortex of schizophrenics[J].Molecular Psychiatry，1997，2（4）：57-64.

[7] Kasper S，Tauscher J，Willeit M，et al.Receptor and transporter imaging studies in schizophrenia，depression， bulimia and Tourette's disorder -implications for psychopharmacology[J].World J Biol Psychiatry，2002，3（3）：133-146.

[8] Frankle W G，Narendran R，Huang Y，et al.Serotonin transporter availability in patients with schizophrenia： a positron emission tomography imaging study with [11C] DASB[J].Biol Psychiatry，2005，57（12）：1510-1516.

[9] Bordukalo N T，Cicin S L，Jernej B. Expression of brain and platelet serotonin transporters in sublines of rats with constitutionally altered serotonin homeostasis[J].Neurosci Lett，2004，369（1）：44-49.

[10]Barkan T，Gurwitz D， Levy G，et al.Biochemical and pharmacological characterization of the serotonin transporter in human peripheral blood lymphocytes[J].Eur Neuropsychopharmacol，2004，14（3）：237-243.

[11] Govitrapong P， Mukda S， Turakitwanakan W， et al. Platelet serotonin transporter in schizophrenic patients with and without neuroleptic treatment[J].Neurochem Int，2002，41（4）：209-216.

[12] Dubertret C，Hanoun N，Adès J，et al.Family-based association study of the 5-HT transporter gene and schizophrenia[J].Int J Neuropsychopharmacol，2005，8（1）：87-92.

[13] C-U Pae A，Serretti P，Artioli T S，et al.I-H Paik and C Lee Interaction analysis between 5-HTTLPR and TNFA-238/-308 polymorphisms in schizophrenia[J].J Neural Transm，2006，113（7）：887-897.

[14] Silver H，Barash I，Aharon N，et al.Fluvoxamine augmentation of antipsychotics improves negative symptoms in psychotic chronic schizophrenic patients： a placebo-controlled study[J].Int Clin Psychopharmacol，2000，15（5）：257-261.

[15] Goff D C，Midha K K，Sarid-Segal O，et al.A placebocontrolled trial of fluoxetine added to neuroleptic in patients with schizophrenia[J]. Psychopharmacology （Berl），1995，117（4）：417-423.

[16] Pralong D，Tomaskovic-Crook E，Opeskin K，et al.Serotonin（2A）receptors are reduced in the planum temporale from subjects with schizophrenia[J].Schizophr Res，2000，44（1）：35-45.

[17] Kang K，Huang X F，Wang Q，et al.Decreased density of serotonin 2A receptors in the superior temporal gyrus in schizophrenia-a postmortem study[J].Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry，2009，33（5）：867-871.

[18] Lian J，Huang X F，Pai N，et al.Chronic betahistine co-treatment reverses olanzapine's effects on dopamine D but not 5-HT2A/2C bindings in rat brains[J].Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry，2015，56（2）：75-80.

[19] Markota M， Sin J， Pantazopoulos H，et al.Reduced dopamine transporter expression in the amygdala of subjects diagnosed with schizophrenia[J].Schizophr Bull，2014，40（5）：984-991.

[20] Padín J F，Rodríguez M A， Domínguez E，et al.Parallel regulation by olanzapine of the patterns of expression of 5-HT2A and D3 receptors in rat central nervous system and blood cells[J]. Neuropharmacology，2006，51（4）：923-932.

[21] Morgan D G， May P C， Finch C E.Dopamine and serotonin systems in human and rodent brain： effects of age and neurodegenerative disease[J].J Am Geriatr Soc，1987，35（4）：334-345.

[22] Weiss L A，Abney M，Cook Jr E H，et al.Sex-specific genetic architecture of whole blood serotonin levels[J].Am J Hum Genet，2005，76（1）：33-41.

[23] Jun-ichi I，Shu-ichi U，Ken Y，et al.Serotonin transporter mRNA expression in peripheral leukocytes of patients with major depression before and after treatment with paroxetine[J].Neuroscience Letters，2005，389（1）：12-16.

The Expression Levels Study of Serotonin Transporter mRNA in the Acute Phase of Schizophrenia/

Objective： To study the differences of serotonin transporter （SERT）mRNA expression levels in peripheral leukocytes between acute phase of schizophrenia patients and healthy control. To study the gender differences in the SERT mRNA expression levels between two groups. Method： 44 patients with acute phase of schizophrenia were selected in our hospital from May 2013 to November 2013， and then 42 healthy cases with the same age and gender were selected as the control group. The diagnosis of schizophrenia was established according to the DSM-IV-TR criteria. The severity of schizophrenia was assessed by the positive and negative syndromes scales（PANSS）.All subjects were interviewed using self-designed questionnaire on general information and tested by quantitative real-time PCR method in SERT mRNA levels.Result：SERT mRNA levels in leukocytes in acute phase of schizophrenia patients were significantly higher than that in control group，the difference was statistically significant（P＜0.05）.Compared the SERT mRNA levels of two groups’gender， the difference was no statistically significant（P＞0.05）. Conclusion： The over expression of SERT mRNA levels may be one of the biomarkers of schizophrenia in acute phase.

Schizophrenia； Serotonin transporter； mRNA expression； RT-PCR

10.3969/j.issn.1674-4985.2015.20.002

2015-03-28） （本文編輯：周亞杰）

重大新藥創(chuàng)制科技重大專項（2012ZX09303014-002）；國家自然科學基金面上項目（81171269）；北京市教委面上項目（SQKM201210025021）

①首都醫(yī)科大學附屬北京安定醫(yī)院抑郁癥治療中心 北京 100088

②國家精神心理疾病臨床醫(yī)學研究中心（首都醫(yī)科大學附屬北京安定醫(yī)院）

③北京市懷柔安佳醫(yī)院

④精神疾病診斷與治療北京市重點實驗室

⑤北京腦重大疾病研究院抑郁癥研究所

胡昌清

HU Changqing，YANG Yang，CHEN Jing，et al.//Medical Innovation of China，2015，12（20）：006-009

First-author’s address：Capital Medical University Affiliated Beijing Anding Hospital of Mood Disorders Center，Beijing 100088，China