蒲俊松，陳 虎，向仲懷，楊光偉*，何寧佳*

（家蠶基因組生物學國家重點實驗室，重慶 400715）

超高效液相色譜法檢測藥桑椹中1-脫氧野尻霉素

蒲俊松，陳 虎，向仲懷，楊光偉*，何寧佳*

（家蠶基因組生物學國家重點實驗室，重慶 400715）

建立超高效液相色譜測定新疆藥桑椹中1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）含量的方法。藥桑椹粉經(jīng)0.05 mol/L鹽酸提取，在pH 8.5的硼酸鹽緩沖液條件下，氯甲酸-9-芴基甲酯（9-fluorenylmethyl chloroformate，F(xiàn)MOC-Cl）與DNJ反應生成具有紫外吸收的絡合物（DNJ-FMOC），然后采用超高效液相色譜-紫外檢測器測定。液相色譜條件為CORTECSTMC18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm），流動相為乙腈-0.5%醋酸（28∶72，V/V），在流速0.6 mL/min、柱溫28 ℃、檢測波254 nm條件下檢測。結(jié)果表明：DNJ與其他組分分離效果良好，方法檢出限為0.1 μg/mL（RSN=3），線性范圍在0.5～20 μg/mL，相關系數(shù)（r）為0.999 970，加標回收率平均為106.4%。精密度實驗、穩(wěn)定性實驗、重復性實驗以及回收率實驗表明，該方法穩(wěn)定可靠，可作為測定藥桑椹中DNJ含量的有效方法。

藥桑；1-脫氧野尻霉素；超高效液相色譜；紫外檢測

藥桑（Morus nigra Linn.）屬桑科桑屬黑桑種。藥桑起源于伊朗，16世紀在我國新疆等地開始栽培，是我國唯一的黑桑種。目前也主要分布于新疆阿克蘇、和田、吐魯番和喀什等地區(qū)[1-4]。藥桑桑椹是維吾爾族歷代的民間藥材，具有降低血糖、血脂的功效[5]?，F(xiàn)代藥理學研究證實藥桑椹具有降三高（高血糖、高血脂、高血壓）、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用[6-8]。藥桑椹中含有黃酮、多糖、生物堿等多種活性成分[9-10]，1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）是一種主要存在于桑樹中的多羥基哌啶生物堿。其具有降血糖[11]、降血脂[12]、抗腫瘤[13]、抑制變形鏈球菌生長[14]、抗病毒[15]等功效。

作為降血糖的重要活性成分，DNJ含量可以作為桑制品降血糖效果的質(zhì)量指標，也是進一步篩選富含DNJ的桑資源重要依據(jù)[16]，因而需要開發(fā)一種可靠的DNJ檢測方法。目前，DNJ的檢測方法主要分為兩類，一類是碘-碘化鉀分光光度法[17]，該方法步驟少，所需試劑易得，儀器要求不高，但是精確度不高；另一類是色譜法，又分為氣相色譜法[18]和液相色譜法，高效液相色譜法為常用分析方法。按照配備的檢測器不同，高效液相色譜法分為蒸發(fā)光散射檢測法[19]、熒光檢測法[20]、紫外檢測法[16]和質(zhì)譜檢測法[21]。除蒸發(fā)光散射檢測法精確度相對較差，其他3 種方法檢測結(jié)果準確、穩(wěn)定、可靠。

近年來基于小顆粒填料、低系統(tǒng)體積及快速檢測等技術發(fā)展的超高效液相色譜法，具有快速高效、高分離度等特點[22]，現(xiàn)已廣泛應用于食品、藥物中各類物質(zhì)的分析檢測。目前國內(nèi)外還沒有采用超高效液相色譜法檢測桑樹中DNJ的方法報道。本研究通過優(yōu)化反應條件，確定最佳儀器分析條件，建立了超高效液相色譜-紫外檢測器法測定藥桑椹中DNJ的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藥桑椹由新疆和田蠶研所提供，采自和田不同地區(qū)；果桑椹采自西南大學桑樹品種資源圃。材料于60 ℃烘干至質(zhì)量恒定，粉碎機粉碎，過40 目篩，置干燥器中冷凍備用。

DNJ（純度≥98%，CAS：19130-96-2） 北京恒元啟天化工技術研究院；氯甲酸-9-芴基甲酯（9-fluorenylmethyl chloroformate，F(xiàn)MOC-Cl，純度≥99.0%，色譜純）、甘氨酸（純度≥99%） 美國Sigma公司；乙腈、甲醇、醋酸（均為色譜純） 美國Thermo Fisher Scientifi c公司。

1.2 儀器與設備

DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海齊欣科學儀器有限公司；FA2004B電子天平 上海精天電子儀器有限公司；KQ-500DV數(shù)控超聲清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；CT15RE冷凍離心機 日本Hitachi公司；ACQUITY超高效液相色譜、I-Class色譜儀（配紫外檢測器及Empower 3工作站） 沃特世科技（上海）有限公司；GX-03 150 g功能粉碎機 浙江高鑫工貿(mào)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的提取

精確稱取待測桑椹粉1 g，加入50 mL 0.05 mol/L HCl溶液，混勻后30 ℃水浴超聲10 min，提取液在20 ℃條件下10 000×g離心5 min，收集上清液，沉淀物再按上述步驟重復提取1 次，合并上清液，超純水定容至100 mL，即得樣品提取液。

1.3.2 DNJ標準液的配制

取DNJ標準品一瓶（20 mg），用10 mL 0.05 mol/L HCl溶液溶解，搖勻配為2 mg/mL的DNJ標準液。用時將DNJ標準液配制成0.5、2、8、12、16、20 μg/mL備用。

1.3.3 DNJ的衍生化

取DNJ提取液（或DNJ標準液）100 μL于1.5 mL的離心管，加入0.4 mol/L硼酸鉀緩沖液（pH 8.5）100 μL，再加入5 mmol/L的FMOC-Cl（溶解于乙腈中）200 μL，混勻后，20 ℃水浴20 min，加入1 mol/L的甘氨酸100 μL中和剩余的FMOC-Cl終止反應，加入1%的醋酸溶液100 μL使衍生物穩(wěn)定，而后加入超純水400 μL稀釋，以0.22 μm針頭式過濾器過濾，即得測試液。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：CORTECSTMC18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；紫外檢測器，檢測波長：254 nm；流動相：乙腈-0.5%醋酸（28∶72，V/V）；流速：0.6 mL/min；柱溫：28 ℃；進樣量：1 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相的選擇及其比例的優(yōu)化

實驗比較乙腈和不同體積分數(shù)醋酸溶液作為流動相的分離效果，結(jié)果顯示較高的醋酸體積分數(shù)能夠改善色譜峰的對稱性，綜合考慮選擇乙腈-0.5%醋酸溶液作為色譜分析時的流動相。DNJ衍生物為弱極性，隨著乙腈比例的降低，流動相極性增加，洗脫能力變?nèi)?，目標物的保留時間也會隨之延長，這有助于目標物與雜質(zhì)的分離。當乙腈-0.5%醋酸（50∶50，V/V）時，因雜質(zhì)干擾，目標物不能有效的分離，最后逐漸降低乙腈的比例，能夠有效分離目標物；當乙腈-0.5%醋酸（28∶72，V/V）時，目標物的峰形良好，分離度為3.4。因此流動相比例選用乙腈-0.5%醋酸（28∶72，V/V）。

2.2 測試樣品的超高效液相色譜圖譜

圖1 DNJ標準品及藥桑椹提取液色譜圖Fig.1 Chromatograms of DNJ standard and black mulberry fruit sample

分別對DNJ標準品及桑椹提取液進行超高效液相色譜分析。如圖1所示，圖1c中DNJ標準品有3 個主色譜峰，但在進行衍生化反應時，若只加FMOC-Cl，不加Gly和DNJ，則僅出現(xiàn)FMOC-OH色譜峰（圖1a）；只加Gly和FMOC-Cl進行衍生化反應，則只出現(xiàn)FMOC-OH和Gly-FMOC色譜峰（圖1b）；通過分析第1個色譜峰峰面積與DNJ標準品的質(zhì)量濃度，發(fā)現(xiàn)其呈線性關系。由此可以斷定，圖1c中3 個色譜峰依次分別為DNJ-FMOC、FMOC-OH、Gly-FMOC。

2.3 DNJ的線性關系

將DNJ標準溶液質(zhì)量濃度梯度按1.3.3節(jié)的方法進行衍生化反應，反應液在上述色譜條件下進行超高效液相色譜-紫外檢測器分析，以色譜峰面積（y）與標準品質(zhì)量濃度（x）繪制標準曲線。結(jié)果表明，DNJ的質(zhì)量濃度與色譜峰面積呈良好的線性關系，經(jīng)回歸分析，二者的回歸方程為y=872x－13.1，相關系數(shù)r=0.999 970，方法檢出限為0.1 μg/mL（RSN=3）。

2.4 精密度和重復性

取同一供試品溶液，分別進樣測定6 次，分別測定DNJ的峰面積值，計算相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為1.32%（n=6），說明本測定方法精密度符合要求。按1.3節(jié)方法操作取桑椹粉6 份，進行超高效液相色譜分析，根據(jù)峰面積值，并對照標準曲線計算樣品中的DNJ含量，如表1所示，6 次測定的平均含量為0.623 4 mg/g，其RSD為1.00%（n=6）。表明本方法的重復性良好。

表1 重復性實驗結(jié)果Table1 Results of repeatability test

2.5 穩(wěn)定性實驗結(jié)果

取桑椹粉提取液進行衍生化反應，分別間隔0、4、8、16、24、48 h進樣，共進樣6 次。測定結(jié)果表明，DNJ-FMOC的峰面積基本一致，計算DNJ峰面積的RSD為2.40%（n=6）。實際上在室溫條件放置一周后再次測定，DNJ-FMOC的峰面積也無顯著變化。

2.6 加標回收率

取測定過DNJ含量的桑椹粉6 份，每份0.5 g，分別加入0.4 mg/mL標準品溶液1 mL，按1.3節(jié)方法制備樣品液和進行衍生反應。超高效液相色譜分析測定DNJ含量，計算加標回收率。如表2所示，測定發(fā)現(xiàn)平均加標回收率為106.4%，RSD為2.43%。此結(jié)果表明，本測定方法符合加標回收率的要求。

表2 加標回收率實驗結(jié)果Table2 Results of recovery rate test

2.7 桑椹樣品DNJ含量測定

表3 7 種桑椹樣品中DNJ含量測定Table3 The contents of DNJ in seven cultivars of mulberry fruit (x± s) mg/g

表3 7 種桑椹樣品中DNJ含量測定Table3 The contents of DNJ in seven cultivars of mulberry fruit (x± s) mg/g

桑椹于田（2012.8）于田（2014.8）策勒和田縣藥桑王和田市5801長江一號DNJ含量0.610 3±0.011 0.672 9±0.010 1.038 3±0.014 1.384 5±0.013 1.501 9±0.019 2.524 7±0.026 1.138 8±0.013 0.792 0±0.009

對7 種桑椹中DNJ含量進行測定，結(jié)果如表3所示。前5 種都是藥桑椹，采自新疆不同地區(qū)，其中包括了2012年和2014年8月采于于田的藥桑椹。藥桑王為單棵，因其栽培歷史悠久而得名。5801和長江一號兩種是果桑，采自西南大學桑樹品種資源圃。從表3可以看出，產(chǎn)自于田2012年和2014年的藥桑椹中DNJ含量相差不大，初步表明同一地區(qū)不同時間的藥桑椹中DNJ含量穩(wěn)定。而不同地區(qū)藥桑椹中DNJ的含量差異較大，其中和田市的含量最高，是于田的4 倍。和田縣、藥桑王和和田市的藥桑椹中DNJ的含量均高于劉凡[23]、肖明[24]等檢測桑葉、桑葉茶中DNJ的含量。Kimura等[25]研究表明DNJ給藥劑量為60 kg人體質(zhì)量6 mg時能夠抑制高血糖，和田市產(chǎn)藥桑椹DNJ含量為2.524 7 mg/g干質(zhì)量，按藥桑椹含水量80%[1]，每次食用12 g鮮果就能達到抑制高血糖的效果。

3 結(jié) 論

本實驗建立了超高效液相色譜-紫外檢測器測定藥桑椹中DNJ含量的方法。 目前已有不少關于桑樹中DNJ檢測方法的報道，大多為高效液相色譜法。與傳統(tǒng)的高效液相色譜相比，超高效液相色譜具有更快的分離速率、更高的分辨率和靈敏度[26]。高效液相色譜的方法不能完全適用于超高效液相色譜的分析，其中流動相的比例對物質(zhì)的分離起著重要的作用。在本實驗中，DNJ衍生物為弱極性，隨著乙腈和0.5%醋酸溶液比例的降低，流動相的極性增強，洗脫能力減弱，分離能力變強，利于目標物與雜質(zhì)的分離，但是檢測時間也更長。即是如此，本方法也能在8 min內(nèi)完成檢測，相對于目前報道的最快速的DNJ檢測方法（12 min完成檢測）[20]，其檢測效率提高33%。當流動相比例為乙腈-0.5%醋酸（28∶72，V/V），DNJ峰形良好，分離度達到了3.4。且本方法流速低，能夠減少有機溶劑的消耗，進樣量少，節(jié)省樣品。通過方法學驗證，該方法具有良好的精密度、重復性和穩(wěn)定性，能夠滿足分析要求。

隨著果汁類飲料的風行和以桑椹為原材料的功能性食品的開發(fā)，DNJ作為該類產(chǎn)品的主要功能性成分，其含量直接影響該類產(chǎn)品的品質(zhì)。藥桑是新疆乃至中東地區(qū)獨特稀貴的藥用果桑種質(zhì)資源[1]，藥桑椹為維吾爾族歷代的民間藥材，具有很高的開發(fā)價值，可作為新疆地區(qū)特有的果桑品種種植，對藥桑椹的開發(fā)更能促進新疆的經(jīng)濟發(fā)展。近幾年關于桑葉中DNJ的研究報道較多，針對桑椹的DNJ含量及差異研究較少，本研究填補了這一空白，所建立的超高效液相色譜檢測藥桑椹中DNJ的方法，快速、簡便、定量準確，適合桑椹樣品中DNJ的快速定量檢測，為藥桑椹的開發(fā)提供科學依據(jù)。

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Determination of 1-Deoxynojirimycin in Black Mulberry Fruit by Ultra Performance Liquid Chromatography

PU Junsong, CHEN Hu, XIANG Zhonghuai, YANG Guangwei*, HE Ningjia*
(State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, Chongqing 400715, China)

The contents of 1-deoxynojirimycin (DNJ) in the fruits of black mulberry (Morus nigra L.) were measured using ultra performance liquid chromatography (UPLC). Dried fruits were pulverized and extracted with 0.05 mol/L HCl, and then incubated with 9-fl uorenylmethyl chloroformate (FMOC-Cl) in pH 8.5 borate buffer to produce the complex DNJ-FMOC. The concentration of DNJ-FMOC was detected by UPLC coupled with UV detector. A CORTECSTMC18column was used and the column temperature was kept at 28 ℃. The mobile phase was acetonitrile-0.5% acetic acid solution (28:72, V/V) with a fl ow rate of 0.6 mL/min. The UV detection wavelength was 254 nm. The results indicated that DNJ was separated well with a linearity ranging from 0.5 to 20 μg/mL. The limit of detection (LOD) was 0.1 μg/mL and the correlation coeffi cient (r) between the peak area of DNJ-FMOC and DNJ concentration was 0.999 970 and the average recovery from spiked samples was 106.4%. The tests for precision, stability, reproducibility and recovery rate showed that the method was stable and reliable, and could be used as an effective method for the determination of DNJ content in black mulberry fruits.

Morus nigra L.; 1-deoxynojirimycin; ultra performance liquid chromatography; UV detection

TS207.5

A

1002-6630（2015）20-0207-04

10.7506/spkx1002-6630-201520040

2015-01-09

國家高技術研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2013AA100605）；國家農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)2003科研專項（201403064）

蒲俊松（1990—），男，碩士，研究方向為植物化學。E-mail：466342842@qq.com

*通信作者：楊光偉（1958—），男，研究員，博士，研究方向為植物生理。E-mail：yanggw@swu.edu.cn

何寧佳（1971—），女，教授，博士，研究方向為功能基因組與分析生物學。E-mail：hejia@swu.edu.cn