江瑩，桂震，齊杭杭，羅安杰，劉柳，葉鏵駿，蔡亞君(武漢紡織大學(xué)環(huán)境工程學(xué)院，湖北武漢430073)

紡織印染廢水有機(jī)污染物含量高、色度深、堿性大、水質(zhì)變化大，一直是難處理的工業(yè)廢水之一［1］，對(duì)其處理通常是將物理法、化學(xué)法和生物法串聯(lián)在一起進(jìn)行，首先通過(guò)物理、化學(xué)方法將大部分的有機(jī)污染物和色度去除，再采用生物方法將剩余的污染物和色度處理到可以達(dá)標(biāo)排放的水平。因?yàn)樯锾幚矸椒ǔ杀镜投覠o(wú)二次污染，所以在其中起主導(dǎo)作用。但傳統(tǒng)的建立在細(xì)菌系統(tǒng)上的生物處理技術(shù)對(duì)非偶氮染料基本沒(méi)有脫色效果，偶氮染料可以在厭氧條件下脫色，但是幾乎不能在好氧條件下脫色。筆者從印染廢水中篩選到一株既可在厭氧條件下、也可在好氧條件下對(duì)偶氮染料脫色，同時(shí)也能在缺氧條件下對(duì)蒽醌染料脫色的細(xì)菌菌株，對(duì)其進(jìn)行了菌種鑒定，并對(duì)其對(duì)偶氮和蒽醌染料的脫色條件進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1．1 菌株來(lái)源 菌株篩選自某印染廠廢水處理廠二沉池活性污泥。

1．2 主要試劑和儀器 用于總基因組提取、PCR產(chǎn)物回收和pMD 18-T載體連接的試劑盒及大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自Takara公司。主要儀器有紫外分光光度計(jì)、美國(guó)ABI 9800 PCR儀、美國(guó)BioRad DNA電泳系統(tǒng)、美國(guó)VITEK32全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)。

1．3 高效降解菌的分離及鑒定 將印染廢水1∶100加入50 ml濃度為50 mg/L的活性艷藍(lán)KN-R的LB培養(yǎng)基(蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化鈉10 g/L，pH 7．0 ～7．5)中，分別在0、50、100、150、200 r/min 轉(zhuǎn)速下、30 ℃下進(jìn)行培養(yǎng)，定期觀察培養(yǎng)基中菌體量及溶液顏色變化。將上清顏色明顯褪去的培養(yǎng)物按1∶100轉(zhuǎn)接到新鮮的50 ml濃度為50 mg/L的活性艷藍(lán)KN-R的LB培養(yǎng)基中，重新培養(yǎng)，如此富集培養(yǎng)3次后，將上清脫色效果最好的培養(yǎng)液離心分離菌體，并用無(wú)菌水洗滌3次，后懸浮于無(wú)菌水中，采用10倍系列梯度等比稀釋法將其涂布于50 mg/L活性艷藍(lán)KN-R的LB固體培養(yǎng)基上，30℃下培養(yǎng)，將分離得到的單菌落分別挑至5 ml 50 mg/L活性艷藍(lán)KN-R的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察各自脫色情況，選取效果最好的菌進(jìn)行平板劃線分離純化。將分離純化得到的菌株通過(guò)美國(guó)VITEK32全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)進(jìn)行生理生化特性鑒定，并提取其總基因組，通過(guò)PCR擴(kuò)增其16S rDNA，擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物純化后連接到pMD 18-T載體并轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5α菌株中，在含有50 μg/ml氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上挑取克隆子酶切驗(yàn)證后送樣測(cè)序，測(cè)得的序列通過(guò)Blast獲得其種屬信息。

1．4 高效降解菌對(duì)染料的脫色研究 將單菌落轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng)基，30℃、150 r/min培養(yǎng)過(guò)夜后轉(zhuǎn)接到分別含50 mg/L活性艷紅X-3B和50 mg/L活性艷藍(lán)KN-R的LB培養(yǎng)基中，研究在不同溫度、pH、通氣量條件下培養(yǎng)時(shí)該菌對(duì)兩種染料的脫色效果。

2 結(jié)果與分析

2．1 高效染料降解菌株的分離與鑒定

2．1．1 分離。經(jīng)過(guò)篩選，得到一株對(duì)活性艷藍(lán)KN-R染料具有很好脫色作用的細(xì)菌，該菌在初始接種菌體量107～108CFU/ml、30℃左右靜止培養(yǎng)時(shí)，在48 h內(nèi)使50 mg/L以下濃度活性艷藍(lán)KN-R脫色70%左右;而在6 h內(nèi)即可使50 mg/L以下濃度活性艷紅X-3B及多種偶氮染料完全脫色。但對(duì)活性艷藍(lán)進(jìn)行處理時(shí)，以染料作為唯一碳源和能源時(shí)不能脫色，必須添加其他碳源才能具有脫色效果，且培養(yǎng)液顏色褪去時(shí)發(fā)現(xiàn)菌體顏色先變藍(lán)后恢復(fù)原色;而對(duì)活性艷紅等偶氮染料進(jìn)行處理時(shí)，以染料作為唯一碳源和能源時(shí)可將染料脫色，且在平板上培養(yǎng)時(shí)可觀察到水解圈現(xiàn)象，因此推測(cè)該菌可分泌胞外酶降解偶氮染料，而對(duì)活性艷藍(lán)則是一種先吸附、后共代謝的脫色機(jī)制。

2．1．2 鑒定。

2．1．2．1 形態(tài)學(xué)結(jié)果。該菌在LB平板上培養(yǎng)時(shí)，菌落表面濕潤(rùn)、光滑，淺黃色，不透明，邊緣整齊，呈凝滴狀(圖1a)，菌體呈短桿狀(圖1b)。

2．1．2．2 生理生化鑒定結(jié)果。依據(jù)VITEK細(xì)菌鑒定系統(tǒng)的預(yù)處理要求，將4H菌進(jìn)行革蘭氏染色，發(fā)現(xiàn)為陰性;緊接著將菌落做了氧化酶試驗(yàn)，結(jié)果呈陽(yáng)性，屬于非發(fā)酵菌。將純種菌50℃下培養(yǎng)6 h，選擇非發(fā)酵菌的BAC藥敏卡，進(jìn)行全自動(dòng)鑒定，鑒定結(jié)果見表1，最終鑒定結(jié)果顯示該菌為希瓦氏菌(Shewanella sp．)。

表1 菌株4H生理生化鑒定結(jié)果

2．1．2．3 16S rDNA序列鑒定結(jié)果。將該菌的16S rDNA序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行BLAST對(duì)比發(fā)現(xiàn)，該菌與所有希瓦氏菌屬(Shewanella)菌株16S rDNA序列相似性均達(dá)90%以上，與腐敗希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)多個(gè)菌株的16S rDNA序列相似性均達(dá)97%(圖2)，與其他希瓦氏菌的相似性也均達(dá)90%以上。因此，該菌初步可確定為S．putrefaciens，命名為 S．putrefaciens 4H。

2．2 Shewanella sp．4H對(duì)染料的脫色研究 以50 mg/L活性艷紅X-3B和活性艷藍(lán)KN-R為目標(biāo)，將Shewanella sp．4H菌株單菌落轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)基，30℃、150 r/min過(guò)夜活化培養(yǎng)后按1∶100分別轉(zhuǎn)接至裝有50 ml 50 mg/L活性艷紅X-3B和活性艷藍(lán)KN-R LB培養(yǎng)基(pH=7．0)的250 ml三角瓶中，30℃下靜置培養(yǎng)，定時(shí)取樣檢測(cè)菌體生長(zhǎng)量(OD600)和染料脫色效果。由圖3a可知，該菌在含50 mg/L活性艷紅X-3B的LB培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)6 h左右即可將染料完全脫色(肉眼觀察)，此時(shí)仍處于菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期;而在50 mg/L活性艷藍(lán)KN-R的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期，48 h后脫色率可達(dá)最大值(70%左右)(圖3b)。

2．2．1 溫度對(duì)Shewanella sp．4H菌株染料脫色效果的影響。將Shewanella sp．4H菌株在 LB液體培養(yǎng)基中30℃、150 r/min過(guò)夜活化培養(yǎng)的培養(yǎng)物按1∶100分別轉(zhuǎn)接至裝有50 ml含50 mg/L活性艷紅X-3B和活性艷藍(lán)KN-R LB培養(yǎng)基(pH=7．0)的250 ml三角瓶中，不同溫度下靜置培養(yǎng)，定時(shí)取樣檢測(cè)菌體生長(zhǎng)量(OD600)和染料脫色效果。由圖4可知，該菌在37℃時(shí)菌體生長(zhǎng)量及染料脫色率均最高，其次為40℃;在50 mg/L活性艷紅X-3B的培養(yǎng)基中，溫度低于30℃時(shí)菌株生長(zhǎng)量明顯減少，但最終仍能將染料脫色完全，而高于42℃則菌體幾乎不生長(zhǎng)，也不表現(xiàn)脫色作用;在50 mg/L活性艷紅X-3B的培養(yǎng)基中，溫度越低，菌體生長(zhǎng)量及染料脫色率均越低，而在45℃時(shí)菌體少量生長(zhǎng)，具有一定的脫色作用(最高脫色率27．19%)，50℃以上菌體不生長(zhǎng)，也不表現(xiàn)脫色作用。

2．2．2 pH對(duì)Shewanella sp．4H菌株染料脫色效果的影響。將Shewanella sp．4H菌株在 LB液體培養(yǎng)基中30℃、150 r/min過(guò)夜活化培養(yǎng)的培養(yǎng)物按1∶100分別轉(zhuǎn)接至裝有50 ml 50 mg/L活性艷紅X-3B和活性艷藍(lán)KN-R LB培養(yǎng)基(pH不同)的250 ml三角瓶中，37℃下靜置培養(yǎng)，定時(shí)取樣檢測(cè)菌體生長(zhǎng)量(OD600)和染料脫色效果。由圖5可知，在pH為6～8時(shí)，該菌在兩種染料培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)良好;在pH=7和pH=8時(shí)生長(zhǎng)最好，且染料脫色率最高，pH=8時(shí)最優(yōu)(脫色率分別為90．42%和81．84%)。

2．2．3 通氣量對(duì)Shewanella sp．4H菌株染料脫色效果的影響。將Shewanella sp．4H菌株在LB液體培養(yǎng)基中30℃、150 r/min過(guò)夜活化培養(yǎng)的培養(yǎng)物按1∶100分別轉(zhuǎn)接至裝有50 ml 50 mg/L活性艷紅X-3B和活性艷藍(lán)KN-R LB培養(yǎng)基(pH=8．0)的 250 ml三角瓶中，37 ℃下分別在轉(zhuǎn)速 0、50、150 r/min下培養(yǎng)，定時(shí)取樣檢測(cè)菌體生長(zhǎng)量(OD600)和染料脫色效果。由圖6可知，該菌在培養(yǎng)時(shí)搖床轉(zhuǎn)速越高，菌體生長(zhǎng)越快，但脫色效果越差，靜置培養(yǎng)時(shí)對(duì)兩種染料的脫色效果均最好(脫色率分別為99．12%和77．18%)。鑒于此，又進(jìn)一步比較了在相同規(guī)格的三角瓶(250 ml)中裝樣量分別為50、100、150 ml時(shí)該菌的生長(zhǎng)情況及對(duì)染料的脫色情況。結(jié)果顯示(圖7)，裝樣量越少，菌體生長(zhǎng)越好，但對(duì)染料最終的脫色效果影響不大，推測(cè)已有菌體已足夠?qū)⒑械娜玖先棵撋?/p>

3 結(jié)論與討論

篩選到的4H菌株對(duì)50 mg/L偶氮染料活性艷紅X-3B及蒽醌染料活性艷藍(lán)KN-R均具有很好的脫色能力，尤其對(duì)活性艷紅X-3B處理6 h后即能完全脫色。研究結(jié)果顯示，在pH=8、37℃下靜置培養(yǎng)時(shí)脫色效果最好。該菌株在活性艷紅X-3B的平板上培養(yǎng)時(shí)可產(chǎn)生水解圈，推斷該菌株能分泌降解活性艷紅X-3B的胞外酶;該菌株在對(duì)50 mg/L活性艷藍(lán)KN-R處理48 h時(shí)達(dá)到最大脫色率，雖然僅為81．84%，但肉眼觀察已經(jīng)脫色完全，推測(cè)通過(guò)分光光度法檢測(cè)該染料濃度時(shí)受培養(yǎng)基及菌體代謝物的影響較大;而且該菌必須在培養(yǎng)過(guò)程中首先將活性艷藍(lán)KN-R吸入菌體后再逐步將染料降解，推測(cè)該菌株降解活性艷藍(lán)KN-R的方式是先吸附、后共代謝方式。后續(xù)將對(duì)該菌株對(duì)活性艷紅X-3B類偶氮染料和活性艷藍(lán)KN-R類蒽醌染料的脫色機(jī)理進(jìn)行具體研究。

篩選到的4H菌株經(jīng)鑒定屬于希瓦氏菌屬腐敗希瓦氏菌種，目前希瓦氏菌屬已發(fā)現(xiàn)了超過(guò)40個(gè)種的菌株。希瓦氏菌能利用有機(jī)物產(chǎn)生能量，且呼吸類型多樣，其應(yīng)用范圍涵蓋了醫(yī)學(xué)、環(huán)境科學(xué)、電化學(xué)、海洋生物學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域。其中，4H菌株所屬的腐敗希瓦氏菌(S．putrefaciens)在各種環(huán)境中廣泛分布，常見于富含有機(jī)質(zhì)的沉積物和地下厭氧環(huán)境中，在厭氧環(huán)境中，腐敗希瓦氏菌能將腐殖質(zhì)作為電子穿梭物質(zhì)還原 Fe(III)［2－5］、Mn(IV)［5］、Cr(VI)［6］、U(VI)［6－8］等金屬鹽和硝酸鹽［9］以及有機(jī)污染物［9-12］等。近些年來(lái)，還發(fā)現(xiàn)某些腐敗希瓦氏菌株能產(chǎn)電［13］，而腐敗希瓦氏菌對(duì)染料降解方面的研究則主要集中于對(duì)偶氮染料的降解［14-15］，對(duì)蒽醌染料降解方面研究較少。因此，該研究篩選到的S．putrefaciens 4H菌株雖然對(duì)染料的脫色作用不如脫色希瓦氏菌［16］，但其在環(huán)境污染治理方面的潛力巨大，具有很高的研究?jī)r(jià)值。

［1］陸繼來(lái)，任洪強(qiáng)，夏明芳，等．新排放標(biāo)準(zhǔn)的印染廢水深度處理技術(shù)進(jìn)展［J］．工業(yè)水處理，2009，29(7):7-10．

［2］李陛，吳文芳，李金華，等．溫度和電子傳遞體AQDS對(duì)鐵還原細(xì)菌Shewanella putrefaciens CN32 礦化產(chǎn)物的影響［J］．地球物理學(xué)報(bào)，2011，54(10):2631-2638．

［3］EDWARD J，LOUGHLIN O．Effects of electron transfermediators on the bioreduction of lepidocrocite(γ-FeOOH)by Shewanella putrefaciens CN32［J］．Environmental Science and Technology，2008，42(1):6876-6882．

［4］CROSBY H，RODEN E．The mechanisms of iron isotope fractionation produced during dissimilatory Fe(III)reduction by Shewanella putrefaciens and Geobacter sulfurreducens［J］．Geobiology，2007，5(1):169-189．

［5］DOLLHOPF M E，NEALSON K H，SIMON D M，et al．Kinetics of Fe(III)and Mn(IV)reduction by the Black Sea strain of Shewanella putrefaciens using in situ solid state voltammetric Au/Hg electrodes［J］．Marine Chemistry，2000，70(1):171-180．

［6］GU B，CHEN J．Enhanced microbial reduction of Cr(VI)and U(VI)by different natural organic matter fractions［J］．Geochimica et Cosmochimica acta，2003，67(19):3575-3582．

［7］SUZUKI Y，TANAKA K，KOZAI N，et al．Effects of ciitrate，NTA，and EDTA on the reduction of U(VI)by Shewanella putrefaciens［J］．Geomicrobiology Journal，2010，27(3):245-250．

［8］LUO W，GU B．Dissolution and mobilization of uranium in reduced sediment by natural humic substances under anaerobic conditions［J］．Environmental Science and Technology，2008，43(1):152-156．

［9］LUAN F，BURGOS W D．Bioreduction of nitrobenzene，natural organic matter，and hematite by Shewanella putrefaciens CN32［J］．Environmental Science and Technology，2010，44(1):184-190．

［10］LEE I G，KIM S J，AHN T Y．Inhibitory effect of nitrate on Fe(Ⅲ)and humic acid reduction in Shewanella putrefaciens DK-1［J］．J Microbiol，2000，38(3):180-182．

［11］KIM H J，PARK H S，HYUN M S，et al．A mediator-less microbial fuel cell using a metal reducing bacterium Shewanella putrefaciens［J］．Enzyme and Microbial Technology，2002，30(2):145-152．

［12］MARTíN-GIL J，RAMOS-SáNCHEZ M C，MARTíN-GIL F J．Shewanella putrefaciens in a fuel-in-water emulsion from the Prestige oil spill［J］．Antonie Van Leeuwenhoek，2004，86:283-285．

［13］CARMONA-MARTíNEZA A A，HARNISCHA H．Electron transfer and biofilm formation of Shewanella putrefaciens as function of anode potential［J］．Bioelectrochemistry，2013，93:23-29．

［14］RAU J，KNACKMUSS H J，STOLZ A．Effects of different quinoid redox mediators on the anerobic reduction of azo dyes by bacteria［J］．Environmental Science and Technology，2002，36(7):1497-1504．

［15］LI T，GUTHRIE J T．Colour removal from aqueous solutions of metal-complex azo dyes using bacterial cells of Shewanella strain J18143［J］．Bioresource Technology，2010，101(12):4291-4295．

［16］許枚英，孫國(guó)萍，郭俊，等．脫色希瓦氏菌:中國(guó)，CN1621513A［P］．2005-06-01．