金銀木葉總黃酮提取工藝的響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化

趙小珍， 黃 瀟

(山西省分析科學(xué)研究院，山西太原 030006)

摘要[目的]優(yōu)化并確定金銀木葉中總黃酮的最佳提取工藝。[方法]在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選用乙醇體積分數(shù)、提取溫度、液料比作為研究對象，通過3因素、3水平的Box-Behnken響應(yīng)面法確定金銀木葉總黃酮提取的最佳工藝。[結(jié)果]試驗表明，金銀木葉總黃酮的最佳提取工藝為，乙醇體積分數(shù)68%，提取溫度67 ℃，液料比27∶1 ml/g，在此條件下，黃酮提取率可達到12.88%。[結(jié)論]研究可為金銀木的充分利用以及新的抗氧化藥物的開發(fā)提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞響應(yīng)面法；金銀木葉；黃酮；提取

中圖分類號S789.4;TS255.36;TS218

作者簡介趙小珍(1982- )，女，山西柳林人，工程師，碩士，從事食品中微生物、添加劑和農(nóng)藥殘留的檢測研究。

收稿日期2015-06-11

OptimizationofExtractionConditionsforFlavonoidsfromLoniceramaackiiMaximLeavesbyResponseSurfaceMethod

ZHAOXiao-zhen,HUANGXiao(ShanxiAcademyofAnalyticalScience,Taiyuan,Shanxi030006)

Abstract[Objective] To optimize and determine the extraction techniques for total flavonoids in Loniceramaackii Maxim leaves. [Method]To explore the optimal processing techniques of extraction of flavonoids from Loniceramaackii Maxim, ethanol concentration, temperatureand the ratio of volume of solventtoweight of the dry leaf powder (V/W) were identified asmain affecting parameters and optimized using response surface analysis basedon a three-variable, three-level Box-Behnken design. [Result] The optimal extraction conditionswere determined asethanol concentration of 68%,temperature of 67 ℃, V/W of 27∶1 ml/g.Under these conditions, the extraction rate of flavonoids from Loniceramaackii Maxim was up to 12.88%. [Conclusion] The study can provide reference basis for full use of Loniceramaackii Maxim and development of new anti-oxidative drugs.

KeywordsResponsesurfacemethodology; LoniceramaackiiMaximleaves;Flavonoids;Extraction

金銀木(LoniceramaackiiMaxim)是忍冬科植物，耐寒、耐旱、耐半蔭，易繁殖，抗病蟲，是優(yōu)良的觀花觀果灌木，在我國種植十分廣泛。金銀木不同生長時期的花葉果均含有黃酮，而以葉中含量最高[1-2]。黃酮類化合物主要指以2-苯基色原酮為基核的一類化合物，以游離的苷原或以與糖結(jié)合的苷類等形式存在于很多植物中。研究表明，黃酮類化合物具有多種生物活性，是許多中草藥的有效成分之一，可以保護心血管系統(tǒng)，抗癌，抗病毒，治療慢性支氣管炎、冠心病、動脈硬化及淋巴結(jié)核等病，還具有較強的抗氧化和清除自由基的能力[3-5]，因此在食品領(lǐng)域也有廣闊的應(yīng)用前景。筆者對金銀木葉中總黃酮的提取工藝進行優(yōu)化，確定了最佳工藝條件，為金銀木的充分利用以及新的抗氧化藥物的開發(fā)提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料供試金銀木葉采集于山西大學(xué)院內(nèi)。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、氯化鋁、醋酸、醋酸鈉、乙醇，均為分析純試劑。752N型紫外可見分光光度計，恒溫水浴鍋。

1.2方法

1.2.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。準(zhǔn)確吸取20μg/ml的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲備液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml于10ml容量瓶中，加入0.1mol/L的氯化鋁1.0ml，醋酸-醋酸鈉緩沖液1.5ml，最后用50%乙醇定容至刻度，搖勻。測定上述標(biāo)準(zhǔn)溶液在408nm波長處的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2金銀木葉中黃酮類化合物的提取。稱取1.000g金銀木干葉于具塞錐形瓶中，分別加入不同濃度的乙醇，在恒溫水浴中浸提一定時間，趁熱過濾，冷卻后用同濃度乙醇定容至刻度。

1.2.3黃酮提取的單因素試驗設(shè)計。分別以不同體積分數(shù)的乙醇、不同的料液比、不同的提取溫度、不同的提取時間作為單因素，考察各因素對黃酮提取率的影響。

1.2.4響應(yīng)面優(yōu)化試驗。在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取影響顯著的乙醇體積分數(shù)、液料比、提取溫度3個因素作為Box-Behnken設(shè)計的自變量，以黃酮提取率作為響應(yīng)值進行響應(yīng)面優(yōu)化組合[6]，因素水平設(shè)計見表1。

表1　響應(yīng)面分析因素水平設(shè)計

2結(jié)果與分析

2.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，回歸方程為y=0.036 7x-0.011 3，R2=0.999 9。

2.2黃酮提取的單因素試驗

2.2.1乙醇體積分數(shù)的影響。精確稱取1.000g金銀木葉于具塞錐形瓶中, 分別加入體積分數(shù)為30.0%、40.0%、50.0%、60.0%、70.0%、80.0%的乙醇各30ml，在 60 ℃恒溫水浴中浸提3h，趁熱過濾，冷卻后用同濃度乙醇定容至刻度，然后按照“1.2.1”試驗步驟對黃酮類化合物進行測定(平行取樣3次，提取率取平均值，以下同)，結(jié)果見圖1。由圖1可知，當(dāng)乙醇體積分數(shù)為70%時，黃酮提取率最高，繼續(xù)加大乙醇體積分數(shù)，黃酮提取率反而下降。

2.2.2液料比的影響。精確稱取1.000g金銀木葉，分別加入70.0%的乙醇20、25、30、35、40ml，在 60 ℃恒溫水浴中浸提3h，按上述步驟測定總黃酮提取率。由圖2可知，液料比上升到25∶1ml/g之后，黃酮提取率達到最大并保持穩(wěn)定，再增加乙醇量，提取率基本不變。故從經(jīng)濟角度考慮，最佳液料比應(yīng)為25∶1ml/g。

2.2.3提取溫度的影響。精確稱取1.000g金銀木葉，分別加入70.0%的乙醇30ml，浸提3h，提取溫度分別為：30、40、50、60、70、80 ℃，按照上述步驟測定總黃酮提取率。由圖3可知，提取溫度為70 ℃時，黃酮提取率最高，溫度升到80 ℃，提取率下降。分析是由于溫度高于70 ℃時乙醇揮發(fā)嚴重，影響了黃酮提取率，所以最佳提取溫度應(yīng)為70 ℃。

2.2.4提取時間的影響。精確稱取1.000g金銀木葉，分別加入70.0%的乙醇30ml，提取溫度為60 ℃，浸提時間分別1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5h，按照上述步驟測定總黃酮提取率。由圖3可知，提取時間對黃酮提取率影響并不大，因此在響應(yīng)面試驗設(shè)計中選取了乙醇體積分數(shù)、液料比、提取溫度3個因素。

2.3黃酮最佳提取工藝條件的響應(yīng)面試驗分析以乙醇體積分數(shù)、液料比、提取溫度作為響應(yīng)面設(shè)計的單因素，黃酮提取率為響應(yīng)值，應(yīng)用Box-Behnken試驗設(shè)計[7-9]進行試驗，結(jié)果見表2。利用Minitab15.0軟件對表2試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到三元二次回歸方程如下：Y=12.50-0.58A-0.33B+1.71C-0.12AB+0.075AC-0.15BC-1.09A2-0.64B2-2.26C2?；貧w方程中二次項系數(shù)為負值，表明回歸方程所對應(yīng)拋物線開口向下，有最大值。

表2　響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

對方程的回歸系數(shù)顯著性分析表明，A、B、C、A2、B2、C2這幾個因素影響顯著(P<0.05)，表明提取溫度、乙醇體積分數(shù)和液料比對金銀木葉中黃酮的提取率有顯著影響。A2、B2、C2影響顯著說明試驗因子對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系。

通過上述二次多項回歸方程所做的響應(yīng)面圖和等高線圖見圖6～8，該組圖反映了3個因素中任何2因素交互影響黃酮提取率的效果。從圖6～8可以看出，黃酮提取率在試驗區(qū)域內(nèi)存在最大值，它隨著2個因素值的不斷升高而升高，達到最大值后又逐漸下降。

2.4黃酮最佳提取工藝的確定和驗證根據(jù)Box-Behnken試驗所得的結(jié)果和二次多項回歸方程，利用Minitab15.0軟件獲得金銀木葉黃酮提取率最高時的最佳條件為：乙醇體積

分數(shù)67.63%、提取溫度67.16 ℃、液料比26.91∶1ml/g。在此條件下，黃酮提取率預(yù)測值為12.95%。為了驗證此模型預(yù)測的準(zhǔn)確性，選擇乙醇體積分數(shù)68%、提取溫度67 ℃、液料比27∶1ml/g進行驗證，共試驗3次，黃酮提取率分別為12.84%、12.92%、12.89%，平均值為12.88%，與預(yù)測值接近，證明該模型能較好地預(yù)測金銀木葉中總黃酮的提取率。

3結(jié)論

響應(yīng)面分析法是研究幾個因素間交互作用的分析方法，它克服了正交設(shè)計只能處理離散的水平值，而無法找到整個區(qū)域上因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值的缺陷，是尋找最優(yōu)加工工藝參數(shù)的有效方法。該研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選用乙醇體積分數(shù)、提取溫度、液料比作為研究對象，通過3因素、3水平的Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化提取金銀木葉總黃酮的最佳工藝條件，即乙醇體積分數(shù)68%，提取溫度67 ℃，液料比27∶1ml/g。在此條件下，黃酮提取率可達到12.88%。試驗證明，采用此響應(yīng)面法優(yōu)化得到的提取條件準(zhǔn)確可靠，具有一定的實用價值。

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