陳慶奇，鄭少燕，2，張丹雁

(1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬佛山市婦幼保健院藥劑科，廣東佛山528000;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州510006)

益母草為唇形科植物益母草(Leonurus japonicus Houtt.)的新鮮或干燥地上部分，其味辛、微苦、性微寒，歸心、肝、膀胱經(jīng)，具有活血調(diào)經(jīng)、利水消腫、清熱解毒之功效［1］，素有“血家圣藥”、“經(jīng)產(chǎn)良藥”之稱［2］。益母草中含有生物堿及多糖等多種活性成分［3］，且研究表明益母草多糖(Leonurus japonicus Houtt.polysaccharides，LJP)具有抗氧化［4］、免疫調(diào)節(jié)活性［5］等活性。因此優(yōu)化提取LJP條件以便進(jìn)一步研究LJP活性等具有現(xiàn)實(shí)意義。

目前LJP提取工藝雖有報(bào)道，但僅見正交設(shè)計(jì)優(yōu)化［6］，由于正交設(shè)計(jì)所得優(yōu)化參數(shù)不能全面考察變量之間的交互作用，LJP提取率仍較低，對(duì)其提取方法優(yōu)化還有待于進(jìn)一步研究。Box－Behnken設(shè)計(jì)為響應(yīng)面法(Response Surface Methodology，RSM)中的一種設(shè)計(jì)方法，該方法通過多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，能研究幾種因素之間的交互作用，可有效解決多變量問題。為此，筆者以多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選定超聲提取溫度、提取時(shí)間及固液比作為主要考察因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，再通過3因素3水平Box－Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)，建立益母草多糖提取率的二次多項(xiàng)回歸方程，計(jì)算得到益母草多糖的最佳提取工藝條件，以期為LJP的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器 UV－2450紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司);TGL－16B型臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);KQ－250B超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);F1004N萬分之一分析天平(上海菁海儀器有限公司);傾斜式粉碎機(jī)(上海淀久中藥機(jī)械制造有限公司)。

1.2 材料 益母草(購自廣州采芝林藥店);無水葡萄糖對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)110833－200904);苯酚、乙醇、硫酸、丙酮、無水乙醚均為化學(xué)純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 益母草前處理。將益母草粉碎過60目篩，石油醚回流脫脂，95%乙醇回流除去低聚糖及色素，恒溫干燥，即得預(yù)處理益母草粉末。

1.3.2 多糖含量測定。

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品20.1 mg溶解定容至100 ml，搖勻，即得0.201 mg/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 1.0、2.0、3.0、4.0、8.0 ml，加水定容至10 ml，得標(biāo)準(zhǔn)待測液。再分別吸取2 ml標(biāo)準(zhǔn)待測液，加入2 ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的苯酚，緩慢滴加5 ml濃硫酸，震蕩后靜置，冷卻至室溫。另取2 ml蒸餾水以同樣的方法配制空白對(duì)照組。于490 nm波長處測定吸光度。以濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2.2 供試品溶液制備。精密稱取益母草粉末5.0 g，加入去離子水，按設(shè)定超聲提取溫度、提取時(shí)間及固液比進(jìn)行提取。將提取液置于離心機(jī)中，4 000 r/min離心10 min，回收上清液，下層殘?jiān)ㄟM(jìn)行二次提取。合并2次離心所得上清液定容至 500 ml，得 LJP 供試品溶液。按“1.3.2.1”項(xiàng)方法進(jìn)行硫酸苯酚法顯色，于紫外分光光度計(jì)下200～600 nm掃描。

1.3.2.3 精密度試驗(yàn)。吸取同一已知濃度的LJP供試品6份，按“1.3.2.1”項(xiàng)方法操作，測定 6 份樣品吸光度值，計(jì)算RSD值，要求該值＜3%。

1.3.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)。吸取已知濃度的LJP供試品2 ml，按“1.3.2.1”項(xiàng)方法操作，每隔 1 h 測定 1 次吸光度，連續(xù)測定6次，計(jì)算RSD值，要求該值＜3%。

1.3.2.5 加樣回收率試驗(yàn)。分別吸取已知濃度的LJP溶液6份各1 ml于具塞試管中，分別加入0.21 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液1 ml，按“1.3.2.1”項(xiàng)方法操作，測定吸光度，計(jì)算RSD值，要求該值＜3%。

1.3.2.6 多糖的含量測定。吸取不同提取參數(shù)下的LJP供試品2 ml于具塞試管中，按“1.3.2.1”項(xiàng)方法操作，測定吸光度，按文獻(xiàn)［7］方法計(jì)算多糖含量。

1.3.3 單因素對(duì)LJP提取率的影響。

1.3.3.1 提取溫度對(duì)LJP提取率的影響。精密稱取5.0 g益母草粉末，加入 15倍量去離子水，分別于 20、25、30、35、40、45℃下超聲提取2次，每次20 min，提取功率為320 W，計(jì)算LJP提取率，研究提取溫度對(duì)LJP提取率的影響。

1.3.3.2 提取時(shí)間對(duì)LJP提取率的影響。精密稱取5.0 g益母草粉末，加入15倍量去離子水，35℃下提取2次，每次分別提取 10、15、20、25、30、35 min，超聲功率 320 W，計(jì)算 LJP提取率，研究提取時(shí)間對(duì)LJP提取率的影響。

1.3.3.3 固液比對(duì)LJP提取率的影響。精密稱取5.0 g益母草粉末，35℃下提取20 min，提取2次，超聲功率320 W，分別選擇固液比為 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25(m/v，g/ml)，計(jì)算LJP提取率，研究固液比對(duì)LJP提取率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及優(yōu)化。采用3因素3水平的Box－Behnken設(shè)計(jì)方法對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化，以單因素最佳條件為Box－Behnken設(shè)計(jì)的0值(中心值)進(jìn)行Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖含量測定的方法學(xué)考察

2.1.1 供試品及對(duì)照品紫外掃描圖。從LJP樣品及對(duì)照品在200～600 nm波長掃描圖(圖1)可以看出，LJP樣品與葡萄糖對(duì)照品在490 nm處均有最大吸收峰。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。通過“1.3.2.1”項(xiàng)檢測條件定量測定對(duì)照品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)，數(shù)據(jù)經(jīng)過回歸處理，得回歸方程 A=0.005 7ρ－0.003 2(R2=0.999 7)，表明葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液在20.1 ～160.8 μg/ml線性關(guān)系良好。

2.1.3 精密度試驗(yàn)。測定同一已知濃度的LJP供試品6份，得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=0.86%，表明試驗(yàn)精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)。測定已知濃度的LJP供試品，每隔1 h測定1次吸光度，連續(xù)測定6次，得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=1.27%，表明供試品溶液5 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.5 加樣回收率試驗(yàn)。按照“1.3.2.5”方法，計(jì)算所得加樣回收率為98.4%，RSD=1.93%，表明該試驗(yàn)方法加樣回收率好，方法可行。

2.2 單因素對(duì)LJP提取率的影響

2.2.1 提取溫度對(duì)LJP提取率的影響。由圖3可知，多糖提取率隨著提取溫度的增加呈先上升再平緩的趨勢，這主要因?yàn)闇囟鹊纳咴黾恿硕嗵欠肿拥娜艹觯沟枚嗵堑奶崛÷试黾?。?5℃之后多糖提取率增加不明顯，因此選擇35℃為最佳提取溫度。

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)LJP提取率的影響。由圖4可知，LJP提取率在20 min附近出現(xiàn)最大值，因此，提取時(shí)間確定為20 min。

2.2.3 固液比對(duì)LJP提取率的影響。從圖5可看出，隨著固液比的增大，多糖的提取率逐漸上升，當(dāng)固液比超過1∶20時(shí)，多糖提取率增幅不明顯，因此固液比選為1∶20。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及優(yōu)化

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。以單因素最佳條件為Box－Behnken設(shè)計(jì)的中心值(0值)。試驗(yàn)因素及水平如表1所示，Box－Behnken設(shè)計(jì)的方案及試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。對(duì)表2數(shù)據(jù)采用Design Expert軟件處理、分析，獲得LJP提取率(Y)對(duì)3個(gè)參數(shù)的二次多元回歸方程:Y=－41.06+1.618X1+1.07X2+0.717X3+0.002X1X2－ 0.01X1X3－ 0.005X2X3－0.021X12－0.025X22－0.0047X32。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平

2.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)分析及優(yōu)化。由響應(yīng)面軟件處理所得分析(圖6～8)和回歸方程ANOVA結(jié)果(表3)可見，P模型＜0.01，表明該試驗(yàn)方法可靠;回歸系數(shù) R2=0.993 1 ＞0.9，表明回歸方程相關(guān)度良好;方程“失擬項(xiàng)”不顯著，表明回歸模型可較好地?cái)M合實(shí)際值;回歸方程各項(xiàng)參數(shù)中X1、X2、X3、X1X3、X2X3、X12、X22、X32均達(dá)到顯著水平。

Design Expert軟件分析所得最優(yōu)工藝條件為提取溫度35.3 ℃、提取時(shí)間 20.35 min、固液比 1∶23.66(m/v，g/ml)，LJP提取率可達(dá)7.02%。結(jié)合實(shí)際情況，修正最佳工藝為超聲提取溫度 35.5 ℃、提取時(shí)間 20.5 min、固液比 1∶24(m/v，g/ml)，該條件下，LJP 提取率為(7.10 ±0.13)%(n=3)，與理論值吻合，因此，采用RSM法優(yōu)化得到的提取條件參數(shù)可靠。

表2 LJP超聲提取的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

表3 回歸系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)

3 結(jié)論與討論

該試驗(yàn)使用RSM優(yōu)化超聲提取LJP，得出益母草多糖優(yōu)化提取條件為提取溫度35.5℃、提取時(shí)間20.5 min、固液比1∶24(m/v，g/ml)，益母草多糖的提取率為(7.10 ±0.13)%。該研究對(duì)提升LJP相關(guān)藥物的進(jìn)一步研究開發(fā)具有較大的現(xiàn)實(shí)意義。通過RSM對(duì)超聲提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，相比于正交設(shè)計(jì)優(yōu)化超聲提取方法［6］，具有提取率高的優(yōu)勢，主要是RSM能同時(shí)研究幾種因素之間的交互作用，從而計(jì)算最佳提取參數(shù)。通過單因素分析，當(dāng)超聲提取時(shí)間超過20 min左右時(shí)，多糖提取率反而會(huì)下降，可能因?yàn)槌曁崛r(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致多糖水解或結(jié)構(gòu)遭到破壞，與Ookushi等研究結(jié)果［7］相符。

［1］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典(第一部)［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:272.

［2］南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典［M］.2版.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2010:2892.

［3］范美華，王健鑫，李鵬，等.益母草的研究進(jìn)展［J］.中國藥物與臨床，2006，6(7):528 －530.

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