李 闖，王 超，胡雪芹*，張洪斌(.合肥工業(yè)大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，安徽合肥30009;.合肥工業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，安徽合肥30009)

葡聚糖的生產(chǎn)是制備多糖類產(chǎn)品的技術(shù)核心，隨著我國蔗糖農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，其產(chǎn)值每年劇增，而右旋糖酐蔗糖酶(Dextransucrases)在其中扮演著重要角色。該酶能夠水解斷裂蔗糖分子內(nèi)的α(1→2)糖苷鍵并將D-吡喃葡萄糖基催化轉(zhuǎn)移到與酶分子C端的葡聚糖鉚合域(Glucan binding domains)緊密結(jié)合的右旋糖酐大分子鏈上［1］，從而生成百萬級分子量的右旋糖酐。在整個催化反應(yīng)過程中果糖被釋放出來，并大量游離于催化體系中。

果糖(Fructose)，分子式為C6H12O6，是一種最為常見的己酮糖，與葡萄糖是同分異構(gòu)體，被認(rèn)為是最甜最優(yōu)的天然營養(yǎng)型甜味劑。果糖的代謝過程不依賴胰島素［2］，其注射液可用于燒傷、創(chuàng)傷、術(shù)后及感染等胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下或不適宜使用葡萄糖時需補充水分或能源的患者的補液治療。此外，果糖還具有促進微量元素吸收、保護肝細(xì)胞、輔助治療酒精中毒、預(yù)防齲齒和強化耐力等保健功能。其中，結(jié)晶果糖由于具有純度高、性質(zhì)穩(wěn)定等特點而逐漸在食品、醫(yī)藥等行業(yè)得到開發(fā)與應(yīng)用，其市場需求將不斷擴大［3］。

然而，由于果糖獨特的理化性質(zhì)又使其晶體的制備技術(shù)面臨著兩大瓶頸。一是果糖在純水中的溶解度極大(30℃下果糖的飽和溶液濃度為81.9%，m/m)，致使飽和溶液的黏度也很大，較大的黏度會降低母液的流動性，阻礙結(jié)晶過程中的傳質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，向結(jié)晶體系內(nèi)加入乙醇等能夠與水互溶的有機試劑可以降低果糖的溶解度與其母液的黏度［4－5］。Flood等［6］分別對果糖在不同的水－乙醇比例和不同溫度下的折射指數(shù)、黏度、密度和溶解度等進行了較為深入的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在水∶乙醇為1∶4(m/m)的體系下果糖的溶解度大幅度減少且結(jié)晶母液的黏度大幅下降，故將此作為果糖結(jié)晶體系，進行較為細(xì)致的工藝參數(shù)研究。除加入乙醇，也有通過加入表面活性劑來改善糖漿的黏度［7］。二是果糖的理化性質(zhì)較為活潑，晶體放置在空氣中極易吸水潮解，在加熱過程中容易氧化分解生成棕黃色的5-羥甲基糠醛［8］，而后者作為雜質(zhì)在我國藥典中受到嚴(yán)格控制［9］。

筆者以前期工作摸索出的最佳酶催化及純化條件為基礎(chǔ)，研究了果糖在水－乙醇體系中的結(jié)晶條件，并進行了相關(guān)工藝參數(shù)的優(yōu)化，最后，對結(jié)晶產(chǎn)品進行了高效液相色譜、中紅外光譜及元素檢測分析，以期解決果糖結(jié)晶中所遇到的上述兩大問題，為實現(xiàn)葡聚糖生產(chǎn)過程中副產(chǎn)物果糖的回收利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 果糖、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，BR)，色譜級乙腈(TEDIA公司)，無水乙醇(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，AR)。

右旋糖酐蔗糖酶粗酶液(80 U/ml)來自重組大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3)/pET28-dexYG(合肥工業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)工程學(xué)院藥物設(shè)計實驗室構(gòu)建并保藏)，酶的制備方法參見文獻［10］。

1.2 試驗方法

1.2.1 果糖的酶法制備。

1.2.1.1 右旋糖酐蔗糖酶的酶催化反應(yīng)。用乙酸－乙酸鈣緩沖液配制濃度為125 g/L的蔗糖底物溶液作為酶的催化反應(yīng)體系，并按2 U/ml的用量比例加入右旋糖酐蔗糖酶酶液，控制溫度在25～30℃，150 r/min反應(yīng)30 h。

1.2.1.2 果糖的分離與純化。酶的催化體系在70℃下水浴加熱20 min以終止反應(yīng)，加入乙醇沉淀、過濾去除右旋糖酐，之后濃縮上清液去除乙醇及部分水，濃縮得到的糖漿再經(jīng)鈣型陽離子交換樹脂色譜分離精制后得到純度較高的果糖溶液。

1.2.2 果糖結(jié)晶條件的研究。

1.2.2.1 晶種的制備。將結(jié)晶果糖在研缽中研磨過篩，取100～150目的粉末作為晶種，其粒徑在100～165 μm，密封保存以備用。

1.2.2.2 結(jié)晶方法。將果糖溶液濃縮至一定濃度后，按照水∶乙醇=1∶4的質(zhì)量比加入無水乙醇提高結(jié)晶母液的流動性和過飽和度，之后加入果糖晶種，控制整個結(jié)晶體系以0.5～1.0℃/h的降溫速率從50℃至10℃冷卻結(jié)晶，期間保持150 r/min的攪拌轉(zhuǎn)速。最后經(jīng)過濾、乙醇清洗、60～70℃真空干燥至恒重，計算結(jié)晶收率。

結(jié)晶收率的計算公式:

1.2.2.3 結(jié)晶母液的純度對結(jié)晶的影響。按照酶催化反應(yīng)液中所含有的組分及含量，將蔗糖、葡萄糖和麥芽糖按照2∶1∶4的比例充分混合，分別配制成果糖純度為75%、80%、85%、90%、95%(m/m)的混合糖溶液，并按照基本試驗方法進行結(jié)晶。

1.2.2.4 母液白利度對結(jié)晶收率的影響。將精制后純度在90%以上的果糖溶液濃縮至70、75、80、85 和90 Brix°，進行批次冷卻結(jié)晶，依次測定結(jié)晶收率，重復(fù)3次并取平均值作圖。

1.2.2.5 晶種的添加量對結(jié)晶收率的影響。將精制后純度在90%以上的果糖溶液濃縮至85 Brix°，分別添加總固形物質(zhì)量0、5%、10%、15%和20%的果糖晶種進行批次冷卻結(jié)晶，依次測定結(jié)晶收率，重復(fù)3次并取平均值作圖。

1.2.2.6 養(yǎng)晶時間對結(jié)晶收率的影響。將精制后純度在90%以上果糖溶液濃縮至85 Brix°，并添加總固形物質(zhì)量10%的果糖晶種，經(jīng)冷卻結(jié)晶過程之后保持15℃和150 r/min的轉(zhuǎn)速分別養(yǎng)晶0、3、6、9和12 h后，依次測定結(jié)晶收率，重復(fù)3次并取平均值作圖。

1.2.3 分析檢測方法。

1.2.3.1 純度的檢測。果糖溶液純度的測定采用高效液相色譜層析(HPLC)外標(biāo)法［11］，德國 Waters示差檢測器，色譜條件為:Rezex RCM-Monosaccharide Ca+2(300 mm ×7.80 mm)，柱溫為85 ℃，流動相為去離子水，流速1.0 ml/min，進樣量為20 μl。以被檢物質(zhì)的濃度Y(mg/ml)對峰面積的lg值x作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程分別為:Y=0.214+2.774x;R=0.988 4，線性范圍在20 ～120 mg/ml。

1.2.3.2 結(jié)晶產(chǎn)物中5－羥甲基糠醛的檢測。取0.5 g結(jié)晶產(chǎn)物，加水10 ml充分溶解后，經(jīng)紫外－可見分光光度法檢測，在284 nm 波長處測定，吸光度不能超過 0.32［9］。

1.2.3.3 其他檢測方法。溶液中總固形物含量的測定采用阿貝折光儀，即折光法，單位為Brix°，又稱白利度。

傅立葉中紅外光譜分析采用溴化鉀壓片，檢測波數(shù)在4 000 ～400 cm－1。

元素分析測定條件為爐溫1 150℃，還原管850℃，對結(jié)晶果糖進行元素含量測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)晶母液的純度對結(jié)晶的影響 結(jié)晶雖然是一種有效的分離手段，但雜質(zhì)，甚至是微量的雜質(zhì)會給結(jié)晶過程帶來很大影響［12］，如果結(jié)晶母液中目的產(chǎn)物的純度達不到結(jié)晶要求，最終可能只得到產(chǎn)物與雜質(zhì)的無定型油狀沉積物［13］。Chu等［14］分別以葡萄糖和聚果二糖作為果糖結(jié)晶過程中的雜質(zhì)進行了研究，結(jié)果表明，雜質(zhì)的存在在一定程度上影響晶體的生長速率。在相同純度條件下含有聚果二糖結(jié)晶體系的平均生長速率比含有葡萄糖的結(jié)晶體系低。因此，母液的純度對物質(zhì)的結(jié)晶起著至關(guān)重要的作用。

表1 母液的純度對結(jié)晶的影響

在其他雜糖的干擾下果糖晶體的生長速率明顯減小，宏觀體現(xiàn)在最終的結(jié)晶收率上。此外，雜糖含量過多還會對結(jié)晶體系的穩(wěn)定性造成破壞，在果糖純度只有75%時，結(jié)晶母液在加入乙醇改性之后體系會迅速轉(zhuǎn)變?yōu)槿榘咨?5］，為保證較高的結(jié)晶率以及較好的晶體質(zhì)量，要求純度在90%以上的果糖才可以進行結(jié)晶(表1)。

2.2 母液白利度對結(jié)晶收率的影響 母液白利度對結(jié)晶收率的影響見圖1。由圖1可知，起始結(jié)晶時母液的白利度在75 Brix°以下時沒有結(jié)晶果糖生長或產(chǎn)率極低，說明此濃度下糖漿溶液在降溫過程中始終沒有達到結(jié)晶所要求的過飽和度。此外，結(jié)晶產(chǎn)率在母液的白利度達到80 Brix°以上時顯著提高，(在 85 Brix°時最大，為 52.36%)，在 90 Brix°時雖然有所增加但濃縮時間越長，果糖越容易氧化變色，且產(chǎn)率增加不大，綜合考慮認(rèn)為起始結(jié)晶時母液的白利度在85 Brix°左右最為合適。在此條件下，可以計算出50℃、水－乙醇比例為 1∶4的結(jié)晶體系下的初始過飽和度為 1.21［6，16］。

2.3 晶種的添加量對結(jié)晶收率的影響 晶種的添加量對結(jié)晶收率的影響見圖2。由圖2可知，當(dāng)晶種添加量在總固形物質(zhì)量10%時收率最高，達到56.73%。在不添加晶種時雖然也有結(jié)晶析出，但由于沒有外加晶種的誘導(dǎo)作用只靠自發(fā)成核生長;當(dāng)晶種添加過多時會由于晶體粒徑不均勻所產(chǎn)生的奧斯特瓦爾德熟化(Ostwald Ripening)、生長速率分散(Growth Rate Dispersions)等現(xiàn)象的發(fā)生，使得收率降低和結(jié)晶質(zhì)量下降［17－18］。

2.4 養(yǎng)晶時間對結(jié)晶收率的影響 養(yǎng)晶時間對結(jié)晶收率的影響見圖3。由圖3可知，養(yǎng)晶時間對于結(jié)晶收率的影響作用較小，在養(yǎng)晶時間達到9 h時收率達到最大60.51%，且一直維持在60%左右。

2.5 酶法制備結(jié)晶果糖的檢測與分析

2.5.1 高效液相色譜(HPLC)檢測。將精制后的催化反應(yīng)液與結(jié)晶產(chǎn)物溶液分別進行HPLC檢測，結(jié)果見圖4。由圖4可知，果糖在鈣離子色譜柱的出峰時間為14 min左右，表明純化精制后的果糖經(jīng)結(jié)晶操作后其純度有很大提高。

2.5.2 傅立葉中紅外光譜檢測分析。由圖5可知，制備的結(jié)晶果糖與標(biāo)品均在3 400、2 890、2 830、1 640、1 410、1 080、868和818 cm－1處有較強的吸收峰，其中，3 400 cm－1附近為糖分子中 －OH的伸縮振動峰，2 890與2 830 cm－1為 C-H伸縮振動峰，1 640 cm－1為糖類－OH的吸收峰，1 410 cm－1為C-H的彎曲振動峰，1 080 cm－1為糖環(huán)的特征吸收峰，868與818 cm－1為吡喃環(huán)的特有吸收峰［19－20］，證明了結(jié)晶形態(tài)下的果糖是一種吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)［21］。

2.5.3 元素分析。由表2可知，該結(jié)果符合果糖(C6H12O6)中各個元素所占比例的理論值，所以通過該方法得到的結(jié)晶果糖中不含游離水及結(jié)晶水。

表2 元素分析 %

3 結(jié)論與討論

該研究較為詳細(xì)地探索了果糖在水－乙醇為1∶4體系下的結(jié)晶條件，并對部分工藝參數(shù)進行了優(yōu)化。首先，母液的純度是果糖結(jié)晶的必要前提，雜質(zhì)含量大于10%的體系在加入乙醇改性后，體系的穩(wěn)定性降低，最終僅得到油狀沉淀物。其次，與過飽和度密切相關(guān)的濃度參數(shù)同樣對結(jié)晶產(chǎn)生重大影響。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)晶收率在母液的白利度達到80 Brix°以上時顯著提高，此條件下的過飽和度在1.20左右。此外，晶種的量與養(yǎng)晶時間均對結(jié)晶收率具有一定的影響。

試驗中果糖作為右旋糖酐蔗糖酶的副產(chǎn)物得到有效的回收，且相對于國內(nèi)一些利用該酶制備結(jié)晶果糖的工藝，其流程得到較大簡化，加之結(jié)晶過程能耗低，符合當(dāng)今綠色工業(yè)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟的要求，為結(jié)晶果糖的制備開辟了一條嶄新的道路。

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