黃添毅，李亮，余雪芳，李欣欣，李永裕，吳少華(福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建福州35002)

‘黃花梨’是我國南方主栽的一個(gè)砂梨品種，屬于薔薇科(Rosaceae)梨屬植物(Pyrus L.)，具有良好的風(fēng)味、豐富的營養(yǎng)，是優(yōu)良栽培品種之一，栽培范圍遍布我國長江流域以南地區(qū)，在福建省廣受人們的喜愛，福建建寧縣更有“黃花梨之鄉(xiāng)”的美稱?！S花梨’具有落葉果樹共有的特性，其花芽在冬季會經(jīng)歷休眠，并需要足夠的低溫積累量才能解除休眠，廖光升［1］認(rèn)為‘黃花梨’在建寧栽植時(shí)花芽休眠期在11月～次年3月份，并需5℃以下低溫750 h才能打破自然休眠。如能縮短‘黃花梨’休眠期，將有利于該優(yōu)良品種的向南推廣，但梨休眠生理機(jī)制仍很不清楚阻礙了短低溫梨育種，不利于擴(kuò)大梨生長種植南限。因而研究梨花芽休眠的分子機(jī)制，闡明梨花芽休眠進(jìn)程，對于短低溫梨育種和早熟梨品種在我國南方推廣栽培，促進(jìn)南方梨產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重大意義。

脫落酸(Abscisic acid，簡稱ABA)是植物生長調(diào)節(jié)劑之一，可以在多種組織中活躍地運(yùn)轉(zhuǎn)，其作用貫穿于從種子萌發(fā)到生殖發(fā)育的植物生命周期，介導(dǎo)多種生理過程［2］。研究表明ABA是花芽休眠的促進(jìn)物和萌發(fā)的抑制物，其含量與GA3含量的比例變化對花芽休眠的進(jìn)程有重要影響［3］。ABA分解途徑上關(guān)鍵調(diào)控酶ABA 8’－羥化酶的編碼基因被證實(shí)為 CYP707A，對 ABA 的含量變化有重要作用［4－6］。CYP707A蛋白結(jié)構(gòu)、基本性質(zhì)等是研究ABA調(diào)控梨花芽休眠進(jìn)程分子機(jī)制的重要內(nèi)容。筆者從‘黃花梨’克隆到2個(gè)CYP707A基因，分析CDS序列，探討生物學(xué)信息特征，為進(jìn)一步分離酶蛋白和研究其功能、活性及闡明CYP707A在‘黃花梨’花芽休眠過程中的調(diào)控模式提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 ‘黃花梨’花芽采自福建省建寧縣，選取長勢健壯梨樹作為采樣母株。樣品取回后，挑取飽滿的芽體，去芽鱗片和絨毛，挑取花芽，經(jīng)液氮速凍于－80℃冰箱貯藏。試驗(yàn)在福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，于2014年1～7月進(jìn)行。

1.2 主要儀器 冷凍離心機(jī)(eppendorf 5810R)、PCR儀(BIO-RAD T100TM Thermal Cycler)、水平電泳槽(DYCP-31DN型)、電泳儀(DYY-10C)、凝膠成像儀(BIO-RAD Universal HoodⅡ)、振蕩器(IKA MS 3 B S25)、紫外分光光度計(jì)(Quawell q5000，USA)。

1.3 總RNA提取和cDNA合成 液氮研磨花芽后用Biospin多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(博日科技有限公司，中國杭州)提純RNA，并用紫外分光光度計(jì)、瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量。選用TransScript One－Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金有限公司，中國北京)合成‘黃花梨’cDNA，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 基因克隆 以 NCBI數(shù)據(jù)庫下載已登錄的薔薇科CYP707A基因序列作為參考，通過Bioedit軟件(版本號:v7.0.9)的blast功能從梨基因組 CDS數(shù)據(jù)庫(Pear Genome Project網(wǎng)站 http://peargenome.njau.edu.cn:8004/)獲得同源序列;將同源序列返回到NCBI網(wǎng)站在線blast驗(yàn)證;而后以梨基因組CDS數(shù)據(jù)庫得到的2條序列為參照，設(shè)計(jì)引物。PCR 反應(yīng)體系 25 μl(模板 1 μl，10 μmol/μl上游引物 1 μl，10 μmol/μl下游引物 1 μl，10 mmol/L dNTP mixture 1 μl，10× Ex-Taq Buffer 2.5 μl，5 U/μl EX-Taq 0.15 μl，ddH2O 18.35 μl)，目的基因擴(kuò)增引物見表1。以‘黃花梨’花芽總RNA逆轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序:94℃預(yù)熱5 min;94℃變性45 s，48～55℃退火45 s，72℃延伸1.5 min;共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min;4℃保存。凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1)，并切下1 400 bp左右的目的條帶，經(jīng)膠回收(EasyPure Quick Gel Extraction Kit，北京全式金有限公司，中國北京)純化，連接到PMD18-T(Takara，中國大連)上，后轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，在AMP培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌，將菌液PCR鑒定的陽性克隆送至英濰捷基貿(mào)易有限公司(中國上海)測序。

表1 目的基因擴(kuò)增引物

1.5 生物信息學(xué)分析 運(yùn)用blastp在線程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)、DNAMAN(6.0.3.99)進(jìn)行核酸、氨基酸同源性比對及系統(tǒng)發(fā)育樹分析。運(yùn)用ExPASy ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)、Npsa － pbil(http://npsa － pbil.ibcp.fr/cgi－ bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopm.html)、NetPhos2.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)、TMHMM Server V.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM － 2.0/)、TMpred(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)、SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、Prot(http://psort.hgc.jp/form.html)、SWISS － MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)等在線工具對蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、氨基酸磷酸化位點(diǎn)、跨膜螺旋區(qū)、信號肽、亞細(xì)胞定位及結(jié)構(gòu)等進(jìn)行分析和預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘黃花梨’CYP707A基因的克隆 從‘黃花梨’花芽上克隆得到2個(gè)CYP707A基因序列，通過DNAMAN比對，發(fā)現(xiàn)兩者之間的相似性高達(dá)94.27%(圖2)，氨基酸相似性94.96%。為此，從梨基因組數(shù)據(jù)庫找到2個(gè)基因的內(nèi)含子和外顯子基因組序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示其相似性為69.95%，說明這2個(gè)CYP707A基因?yàn)橄嗨菩暂^高的不同基因。將克隆到的‘黃花梨’CYP707A基因分別定名為PpCYP707A4(Genbank登錄號:KP279630)、PpCYP707A5(Genbank登錄號:KP279631)。

PpCYP707A4的CDS序列全長為1 431 bp，編碼476個(gè)氨基酸;其氨基酸序列與蘋果(Malus domestica XP_008346457.1)相似性 97%，與碧桃(Prunus persica XP_007210577.1)相 似 性 90%，與 梅(Prunus mume XP_008245093.1)相似性87%，與草莓(Fragaria vesca subsp.Vesca XP_004300683.1)相似性83%，與甜橙(Citrus sinensis NP_001275876.1)相似性 84%。

PpCYP707A5的CDS序列全長為1 425 bp，編碼474個(gè)氨基酸;其氨基酸序列與蘋果(Malus domestica XP_008382035.1)相似性 97%，與碧桃(Prunus persica XP_007210577.1)相 似 性 89%，與 梅(Prunus mume XP_008245093.1)相似性86%，與草莓(Fragaria vesca subsp.Vesca XP_004300683.1)相似性84%，與甜橙(Citrus sinensis NP_001275876.1)相似性 85%。

在線blastp分析，2個(gè)PpCYP707As基因均具有1個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，為PLN02196(圖3)，屬于P450超基因家族。以Pp-CYP707A4和PpCYP707A5的氨基酸序列作為參考，從NCBI數(shù)據(jù)庫上blast其他物種的CYP707A氨基酸序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。僅蘋果 blast到2個(gè)基因(XP_008346457.1、XP_008382035.1)，其他物種均只blast到1個(gè)基因。系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示(圖4)，薔薇科植物的CYP707A基因聚為一大支，PpCYP707A4與蘋果 XP_008346457.1基因，PpCYP707A5與蘋果XP_008382035.1基因單獨(dú)聚類。

2.2 蛋白性質(zhì)預(yù)測 采用 ExPASy ProtParam、TMpred、SignalP 4.1預(yù)測蛋白性質(zhì)和Prot預(yù)測亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示，PpCYP707A4蛋白的理論分子質(zhì)量為54.4 kDa，理論等電點(diǎn)為9.01，不穩(wěn)定系數(shù)為48.48，屬于不穩(wěn)定蛋白，分子式可寫為C2493H3901N645O679S20，原子數(shù)7 338，帶負(fù)電荷(Asp+Glu)氨基酸50，帶正電荷(Arg+Lys)氨基酸59，脂溶系數(shù)為92.39，GRAVY 為 －0.100，是親水性蛋白;在6～23位點(diǎn)含有一個(gè)由內(nèi)向外的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，8～26位點(diǎn)有一個(gè)由外向內(nèi)的跨膜螺旋結(jié)構(gòu);不含信號肽，為非分泌蛋白;并定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，概率為 0.820。

PpCYP707A5蛋白的理論分子質(zhì)量為54.1 kDa，理論等電點(diǎn)為9.03，不穩(wěn)定系數(shù)為47.78，屬于不穩(wěn)定蛋白，分子式可寫為C2481H3874N640O673S21，原子數(shù)7 689，帶負(fù)電荷(Asp+Glu)氨基酸49，帶正電荷(Arg+Lys)氨基酸59，脂溶系數(shù)為91.96，GRAVY 為 －0.089，是親水性蛋白。在6 ～23 位點(diǎn)含有一個(gè)由內(nèi)向外的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，8～27位點(diǎn)有一個(gè)由外向內(nèi)的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)。與PpCYP707A4蛋白相同，也不含信號肽，為非分泌蛋白;定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，概率為0.820。

2.3 蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測 采用Npsa－pbil、NetPhos 2.0 Server在線工具預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)、磷酸化位點(diǎn)。PpCYP707A4有243個(gè)氨基酸殘基形成α－螺旋，32個(gè)形成β－螺旋，78個(gè)形成延伸鏈和132個(gè)形成無規(guī)則卷曲;有12個(gè)絲氨酸(serine，S)殘基、7 個(gè)蘇氨酸殘基(threonine，T)，2 個(gè)酪氨酸(tyrosine，Y)參與磷酸化過程。PpCYP707A5有226個(gè)氨基酸殘基形成α－螺旋，27個(gè)形成β－螺旋，81個(gè)形成延伸鏈和140個(gè)形成無規(guī)則卷曲;有13個(gè)絲氨酸(serine，S)殘基、6個(gè)蘇氨酸殘基(threonine，T)，3 個(gè)酪氨酸(tyrosine，Y)參與磷酸化過程。Swiss－model預(yù)測蛋白三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示 PpCYP707A4、PpCYP707A5蛋白的 QMEAN4 值分別為 －5.67、－4.79，三級結(jié)構(gòu)存在較大差異(圖5)。

3 討論

休眠的長短決定落葉果樹的地理分布，是落葉果樹的重要性狀之一［7］。我國梨的種質(zhì)資源大體分為北方品種群和南方品種群，北方品種群的特點(diǎn)為抗寒力較強(qiáng)、休眠期較長，南方品種群表現(xiàn)出早熟、休眠期短等優(yōu)勢［8］?！S花梨’在福建省建寧縣能夠正常開花結(jié)果，產(chǎn)量較大，而在緯度較低的福建省上杭縣其萌芽不整齊的現(xiàn)象明顯，休眠期的長短對于‘黃花梨’的產(chǎn)量和栽培具有重要的制約作用，休眠影響梨品種的選育和梨產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，研究梨的休眠意義重大。對桃［3］、大櫻桃［9－10］、歐洲甜櫻桃［11］、葡萄［12］、牡丹［13］等的研究表明ABA的含量變化是影響木本植物芽休眠進(jìn)程的重要因素。從分子水平探討ABA調(diào)控梨花芽休眠進(jìn)程的分子機(jī)制，將有利于構(gòu)建梨休眠的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而有助于梨品種的選育。

該研究從‘黃花梨’上分離到ABA分解途徑關(guān)鍵酶基因PpCYP707A4和PpCYP707A5，采用生物信息學(xué)方法分析其核苷酸序列、氨基酸序列，構(gòu)建相關(guān)系統(tǒng)發(fā)育樹并預(yù)測蛋白結(jié)構(gòu)。分析結(jié)果顯示，PpCYP707A4與PpCYP707A5核苷酸序列和氨基酸序列相似度較高，為94.27%和94.96%，兩者蛋白理化性質(zhì)相近，符合家族基因的特點(diǎn)。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，‘黃花梨’的PpCYP707A4和PpCYP707A5與蘋果的2個(gè)基因(XP_008346457.1、XP_008382035.1)分別單獨(dú)聚類，而非 PpCYP707A4 和 PpCYP707A5 獨(dú)自聚類。對蘋果［14］、大豆［15］、劍蘭［16］的研究結(jié)果也顯示CYP707A家族基因在系統(tǒng)發(fā)育樹并未單獨(dú)聚為一類而是分散到幾類中。梨基因組數(shù)據(jù)發(fā)表后，Wu等［17］認(rèn)為薔薇科的染色體是由祖先7個(gè)染色體發(fā)展形成的，梨和蘋果基因組之間具有高共線性。該研究克隆的2個(gè)基因很可能產(chǎn)生于梨和蘋果的共同祖先，而后遺傳給梨和蘋果。CYP707A是一個(gè)多基因家族，它們在不同組織中的轉(zhuǎn)錄模式不同［2］，以功能交迭的方式參與環(huán)境脅迫應(yīng)答［4，18－19］、休眠解除［20］等不同的生理反應(yīng)過程，共同調(diào)控植物體內(nèi)源ABA的分解。因而，需進(jìn)一步研究該基因家族各基因的特性，研究它們的生物學(xué)功能，為開展‘黃花梨’花芽休眠的研究提供信息，為短低溫梨品種的選育奠定基礎(chǔ)。

［1］廖光升.黃花梨低溫需冷量研究［J］.落葉果樹，2010(1):4.

［2］許智宏，薛紅衛(wèi).植物激素作用的分子機(jī)理［M］.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2012:67－69.

［3］王海波，高東升，王孝娣，等.赤霉素和脫落酸與桃芽自然休眠誘導(dǎo)［J］.果樹學(xué)報(bào)，2006，23(4):599 －601.

［4］SAITO S，HIRAI N，MATSUMOTO C，et al.Arabidopsis CYP707As encode(+)－abscisic acid 8'－h(huán)ydroxylase，a key enzyme in the oxidative catabolism of abscisic acid［J］.Plant Physiology，2004，134(4):1439 －1449.

［5］NAMBARA E，MARION－POLL A.Abscisic acid biosynthesis and catabolism［J］.Annu Rev Plant Biol，2005，56:165 －185.

［6］KUSHIRO T，OKAMOTO M，NAKABAYASHI K，et al.The Arabidopsis cytochrome P450 CYP707A encodes ABA 8'‐hydroxylases:key enzymes in ABA catabolism［J］.The EMBO Journal，2004，23(7):1647 －1656.

［7］王海波，高東升，王孝娣，等.落葉果樹芽自然休眠誘導(dǎo)的研究進(jìn)展［J］.果樹學(xué)報(bào)，2006，23(1):91 －95.

［8］柴明良，沈德緒.中國梨育種的回顧和展望［J］.果樹學(xué)報(bào)，2003，20(5):379－383.

［9］段成國，李憲利，高東升，等.剝鱗和激素處理對大櫻桃花芽休眠解除及內(nèi)源激素變化的影響［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2004，24(4):615－620.

［10］段成國，李憲利，劉煥芳，等.摘葉對大櫻桃休眠花芽內(nèi)源激素及活性氧代謝的調(diào)控［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，38(1):203 －207.

［11］段成國，李憲利，高東升，等.內(nèi)源ABA和GA3對歐洲甜櫻桃花芽自然休眠的調(diào)控［J］.園藝學(xué)報(bào)，2004(2):149－154.

［12］曹慕明，白先進(jìn)，黨劍，等.巨峰葡萄春季催芽過程中芽內(nèi)內(nèi)源激素及有機(jī)物質(zhì)變化研究［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，17(2):155－160.

［13］鄭國生，蓋樹鵬，蓋偉玲.低溫解除牡丹芽休眠進(jìn)程中內(nèi)源激素的變化［J］.林業(yè)科學(xué)，2009，45(2):48 －52.

［14］KONDO S，SUGAYA S，SUGAWA S，et al.Dehydration tolerance in apple seedlings is affected by an inhibitor of ABA 8'－h(huán)ydroxylase CYP707A［J］.Journal of Plant Physiology，2012，169(3):234 －241.

［15］ZHENG Y，HUANG Y，XIAN W，et al.Identification and expression analysis of the Glycine max CYP707A gene family in response to drought and salt stresses［J］.Annals of Botany，2012，110:743 －756.

［16］LUO X，YI J，ZHONG X H，et al.Cloning，characterization and expression analysis of key genes involved in ABA metabolism in Gladiolus cormels during storage［J］.Scientia Horticulturae，2012，143:115 －121.

［17］WU J，WANG Z，SHI Z，et al.The genome of the pear(Pyrus bretschneideri Rehd.)［J］.Genome Research，2013，23(2):396 －408.

［18］YANG S H，ZEEVAART J A.Expression of ABA8'‐hydroxylases in relation to leaf water relations and seed development in bean［J］.The Plant Journal，2006，47(5):675 －686.

［19］YANG S H，CHOI D.Characterization of genes encoding ABA 8'－h(huán)ydroxylase in ethylene－induced stem growth of deepwater rice(Oryza sativa L.)［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2006，350(3):685 －690.

［20］OKAMOTO M，KUWAHARA A，SEO M，et al.CYP707A1 and CYP707A2，which encode abscisic acid 8'－ hydroxylases，are indispensable for proper control of seed dormancy and germination in Arabidopsis［J］.Plant Physiology，2006，141(1):97 －107.