霍 晶，宋新峰

白癜風(fēng)是一種由于黑素細(xì)胞選擇性破壞引起的特征性色素脫失斑，治療棘手，患者遍布世界各地，約占世界人口的1%～2%。我國(guó)中藥治療白癜風(fēng)歷史悠久，但中藥治療白癜風(fēng)的作用機(jī)制不清。以往研究大多集中在中藥對(duì)黑素細(xì)胞增生和對(duì)黑素細(xì)胞酪氨酸酶的激活，促進(jìn)黑素合成等方面[1,2]。但是白癜風(fēng)病變部位的復(fù)色是黑素細(xì)胞激活-移行-增生-合成黑素的一系列過程，而移行能力的改變?cè)诎遵帮L(fēng)發(fā)病和復(fù)色過程中尤為重要。本實(shí)驗(yàn)研究了中藥補(bǔ)骨脂素和女貞子對(duì)黑素細(xì)胞c-KIT 表達(dá)的影響及意義，探討中藥補(bǔ)骨脂素和女貞子治療白癜風(fēng)的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

小鼠B16 黑素瘤細(xì)胞株（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所），RPMI1640 培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco 公司），10%胎牛血清（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所）；兔抗c-KIT 抗體、β-肌動(dòng)蛋白抗體、二抗山羊抗兔抗體（Santa Cruz 公司）；女貞子（北京同仁堂藥店），補(bǔ)骨酯素單體（monomer）（成都瑞芬思生物科技有限公司）；Access RT-PCR system 試劑盒（美國(guó)Promega 公司），SDS-PAGE 膠（Invitrogen 公司），Bio-Rad 蛋白分析試劑盒，蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量（Bio-Rad 公司），96 孔培養(yǎng)板和Transwell 小室（上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 中藥提取和B16黑素瘤細(xì)胞培養(yǎng) ①中藥制備：女貞子4 g，經(jīng)70%乙醇60 ml 浸泡1周，加熱回流提取3次，提取液過濾并濃縮濃度為 500 g/L，一次性濾器過濾除菌，4℃貯存?zhèn)溆谩Ｖ兴巻误w補(bǔ)骨脂素以二甲基亞砜溶解至50 mmo1/L貯存液，–20 ℃凍存。藥物用時(shí)以RPMI1640培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。②黑素瘤細(xì)胞培養(yǎng)：小鼠B16黑素瘤細(xì)胞， RPMI1640培養(yǎng)基＋10%胎牛血清，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天換液1次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1×105/ml接種于6孔板，細(xì)胞達(dá)50%融合時(shí)處理組加入中藥。女貞子用無血清 RPMI1640培養(yǎng)基稀釋，設(shè)定最終濃度梯度為 0.01、0.1、1.0 g/L；補(bǔ)骨脂素貯液用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋至終濃度梯度為1.0×10-7mmol/L，1.0×10-6mmol/L和 1.0×10-5mmol/L。以不加藥物單純加培養(yǎng)基組作為空白對(duì)照組。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）測(cè)定c-KIT mRNA 表達(dá) 將B16 黑素瘤細(xì)胞以105個(gè)/ml 接種于培養(yǎng)板，24 h 后分別用含1.0×10-5mmol/L 的補(bǔ)骨脂素和1 g/L 女貞子的新鮮培養(yǎng)基換液1 次，72 h 后消化細(xì)胞（操作過程避光進(jìn)行），按照Trizol 試劑盒提供的說明書提取細(xì)胞總RNA。然后采用一步法RT-PCR 試劑盒進(jìn)行RT-PCR。引物（上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成），c-KITm-F：5'-GGA AAG AAG ACA ACG ACA CG 3' ；c-KITm-R ：5'-ACA GAC ACA ACA GGC ACA GC3'； 肌 動(dòng)蛋 白m-F：5'-TGG AAT CCT GTG GCA TCC ATG AAA C-3'；肌動(dòng)蛋白m-R：5'-TAA AAC GCA GCT CAG TAA CAG TCC G-3'。

整個(gè)過程在DNA 擴(kuò)增儀中自動(dòng)完成。RT-PCR產(chǎn)物加入含溴化乙啶的2%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳完畢后在凝膠掃描儀上觀察結(jié)果，拍照記錄并用Quantity One-4.3.0 軟件（Bio-Rad）對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行光密度分析。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）測(cè)定c-KIT 蛋白表達(dá) 用1.0×10-5mmol/L 的補(bǔ)骨脂素和1 g/L 女貞子處理黑素瘤細(xì)胞，培養(yǎng)3 d 后冰上收集、裂解細(xì)胞（操作過程避光進(jìn)行）。根據(jù)上清液中總蛋白的濃度，加蛋白上樣緩沖液，使樣品中總蛋白的濃度為20 μg/μl，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn) PVDF 膜，用5%牛奶封閉。加入（1∶1 000）兔抗c-KIT 抗體，（1∶10 000）兔抗肌動(dòng)蛋白等抗體，4 ℃孵育過夜，繼而與1∶4 000的二抗羊抗兔抗體等室溫反應(yīng)1 h，常規(guī)洗膜?；瘜W(xué)發(fā)光法顯色、顯影、定影，讀取結(jié)果。用Quantity One-4.3.0 軟件讀取蛋白條帶的灰度值。

1.2.4 B16 黑素瘤細(xì)胞遷移功能測(cè)定 Transwell 小室用8.0 μm 微孔聚碳酸酯膜分成上下2 室，實(shí)驗(yàn)前1 d 取出上層小室，將小室底面的聚碳酸酯膜用FN包被，超凈臺(tái)室溫過夜晾干。將黑素瘤細(xì)胞接種于上層小室，嵌入Transwell 小室中，下層小室加入不同濃度藥物處理，培養(yǎng)20 h 后取出聚碳酸酯膜（操作過程避光進(jìn)行）。甲醇固定，甲苯胺藍(lán)染色，膜上層的黑素瘤細(xì)胞用棉拭擦去，遷移至膜下層細(xì)胞在高倍鏡下隨機(jī)選取4 個(gè)視野計(jì)數(shù)，試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示， 應(yīng)用SPSS15.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩樣本均數(shù)的比較采用成組t 檢驗(yàn)（two-sample group t-test）。多樣本均數(shù)的組間差異采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），多樣本均數(shù)的兩兩比較采用Dunnett-t 檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)骨脂素和女貞子對(duì)B16黑素瘤細(xì)胞c-KIT的mRNA表達(dá)影響

1.0×10-5mmol/L 補(bǔ)骨脂素處理組和1.0 g/L 女貞子處理組黑素瘤細(xì)胞的c-KIT mRNA 表達(dá)結(jié)果分別為（1.704±0.001）（IOD/Area）、（1.598±0.001）（IOD/Area），比對(duì)照組（0.812±0.001）（IOD/Area）增加了85.36%和67.52%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.36，P ＜0.05；t=2.78，P ＜0.05)。這表明補(bǔ)骨脂素和女貞子能促進(jìn)小鼠B16 黑素瘤細(xì)胞c-KIT 的mRNA 表達(dá)（圖1）。

圖1 RT-PCR測(cè)定補(bǔ)骨脂素和女貞子對(duì)黑素細(xì)胞c-KIT mRNA表達(dá)電泳圖

2.2 補(bǔ)骨脂素和女貞子對(duì)B16黑素瘤細(xì)胞c-KIT蛋白表達(dá)的影響

1.0×10-5mmol/L 補(bǔ)骨脂素處理組和1.0 g/L 女貞子處理組黑素瘤細(xì)胞c-KIT 的蛋白表達(dá)分別比對(duì)照組增加了119.78%和45.67%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.72，P ＜0.05；t=2.36，P ＜0.05)。這表明補(bǔ)骨脂素和女貞子能促進(jìn)小鼠B16 黑素瘤細(xì)胞c-KIT蛋白的表達(dá)（圖2）。

圖2 蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定補(bǔ)骨脂素和女貞子對(duì)黑素瘤細(xì)胞c-KIT蛋白表達(dá)的電泳圖

2.3 補(bǔ)骨脂素和女貞子對(duì)B16黑素瘤細(xì)胞遷移功能的影響

補(bǔ)骨脂素1.0×10-7mmol/L 組，1.0×10-6mmol/L 組和 1.0×10-5mmol/L 組處理20 h 后，遷移到Transwell小室膜下層的B16 黑素瘤細(xì)胞個(gè)數(shù)每視野分別為（45.3±25.0）個(gè)，（48.9±26.0）個(gè)，（57.7±31.0）個(gè)，對(duì)照組為（17.3±7.0）個(gè)。對(duì)組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，結(jié)果顯示，組間差異顯著（F=10.562，P ＜0.05），與對(duì)照組兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.16，P ＜0.05；t=4.38，P ＜0.05；t=4.87，P＜0.05），且與濃度增加呈劑量依賴性。

女貞子0.01 g /L 組，0.1 g /L 組和1.0 g /L 組處理20 h 后，遷移到Transwell 小室膜下層的黑素瘤細(xì)胞個(gè)數(shù)每視野分別為（46.6±24.0）個(gè)，（50.7±23.0）個(gè)，（56.7±36.0）個(gè)，未用藥組為（17.3±7.0）個(gè)。對(duì)組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，結(jié)果顯示，組間差異顯著（F=12.004，P ＜0.05），與對(duì)照組兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.22，P ＜0.05； t=4.56，P<0.05；t=4.79，P ＜0.05），且與濃度增加呈劑量依賴性。

3 討論

白癜風(fēng)是一種常見的色素性皮膚病，其對(duì)美容所造成的損害嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。研究發(fā)現(xiàn)[3]，窄譜中波紫外線（NB-UVB）對(duì)深膚色人種（主要是印度人）白癜風(fēng)是有效而安全的。但是，某些白癜風(fēng)患者單單依靠NB-UVB 治療是無效的，此種情況下，內(nèi)服或外用補(bǔ)骨脂素長(zhǎng)波紫外線（PUVA）照射能使白癜風(fēng)色素減退皮損復(fù)色，是較為理想的替代療法[4]。目前應(yīng)用傳統(tǒng)中藥治療白癜風(fēng)取得了明顯的療效，臨床上能觀察到白斑區(qū)復(fù)色、毛囊周圍出現(xiàn)色素島，提示與黑素細(xì)胞的遷移以及黑素合成有很大關(guān)聯(lián)[5]。

補(bǔ)骨脂素治療白癜風(fēng)的作用機(jī)制還不清楚。有研究表明補(bǔ)骨脂素可以刺激酪氨酸酶mRNA 轉(zhuǎn)錄起始的一種關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子-Mitf 的表達(dá)[6]，并表明補(bǔ)骨脂素誘導(dǎo)黑素生成作用與蛋白激酶A(PKA)信號(hào)傳導(dǎo)途徑參與調(diào)節(jié)有關(guān)[7]。有研究發(fā)現(xiàn)中藥女貞子能激活酪氨酸酶，促進(jìn)黑素合成[8]；進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)女貞子能促進(jìn)小鼠毛囊的生長(zhǎng)。白癜風(fēng)復(fù)色一方面是促使黑素細(xì)胞的活性增強(qiáng)，黑素合成能力增強(qiáng)；另一方面是促進(jìn)黑素細(xì)胞的遷移功能。因此綜合研究中藥補(bǔ)骨脂素和女貞子對(duì)黑素細(xì)胞遷移的影響，對(duì)深入探討中藥治療白癜風(fēng)的機(jī)制具有重要意義。

c-KIT 是一具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，對(duì)黑素細(xì)胞遷移和生長(zhǎng)存活有重要作用。Noriss 等[9]發(fā)現(xiàn)正常人也有一定水平的c-KIT 基因表達(dá)，并指出可能與保持正常黑素細(xì)胞的分裂潛能有關(guān)，c-KIT表達(dá)減少很可能會(huì)導(dǎo)致黑素細(xì)胞生長(zhǎng)存活缺陷，成為白癜風(fēng)皮損中黑素細(xì)胞丟失的一個(gè)主要原因。研究發(fā)現(xiàn)，c-KIT 還能通過對(duì)酪氨酸酶蛋白磷酸化修飾，激活酪氨酸酶，促使黑素生成增加[10]。目前認(rèn)為白癜風(fēng)色素恢復(fù)的主要機(jī)制是毛囊外毛根鞘無黑素細(xì)胞激活合成黑素，并向表皮遷移所致。因此，c-KIT 在黑素細(xì)胞遷移，從而在白癜風(fēng)復(fù)色中發(fā)揮重要作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度補(bǔ)骨脂素對(duì)B16 黑素瘤細(xì)胞遷移均有顯著促進(jìn)作用，且與濃度增加呈劑量依賴性關(guān)系。補(bǔ)骨脂素10-5mmol/L 劑量組促進(jìn)B16 黑素瘤細(xì)胞的c-KIT 蛋白表達(dá)增加119.78%。這提示臨床上補(bǔ)骨脂素治療白癜風(fēng)的有效機(jī)制可能與促進(jìn)c-KIT 表達(dá)，從而促進(jìn)黑素細(xì)胞遷移有關(guān)。本研究還證實(shí)，女貞子處理后B16 黑素瘤細(xì)胞的遷移能力顯著增強(qiáng)，c-KIT 蛋白表達(dá)明顯增加，增幅達(dá)到45.67%，提示女貞子治療白癜風(fēng)的有效機(jī)制可能與促進(jìn)c-KIT 表達(dá)，從而促進(jìn)黑素細(xì)胞遷移有關(guān)。

本研究闡明了補(bǔ)骨脂素和女貞子對(duì)B16 黑素瘤細(xì)胞遷移的具體分子作用機(jī)制，表明了補(bǔ)骨脂素和女貞子治療白癜風(fēng)有效性的作用機(jī)制；這為臨床篩選中藥治療白癜風(fēng)等色素性皮膚病的機(jī)制研究提供了新思路，為更加科學(xué)、合理、全面、有效地篩選針對(duì)色素性皮膚病的中藥奠定了基礎(chǔ)。

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