王濤，孟穎，鄒冬華，李正東，陳憶九，陶陸陽

（1.司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200063；2.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部法醫(yī)學(xué)系，江蘇蘇州 215123；3.蘇州高新區(qū)人民醫(yī)院ICU，江蘇蘇州 215129）

閉鎖小帶蛋白-1在腦外傷后皮質(zhì)中的表達(dá)變化

王濤1，2，孟穎3，鄒冬華1，李正東1，陳憶九1，陶陸陽2

（1.司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200063；2.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部法醫(yī)學(xué)系，江蘇蘇州 215123；3.蘇州高新區(qū)人民醫(yī)院ICU，江蘇蘇州 215129）

目的觀察閉鎖小帶蛋白-1（zonula occludens-1，ZO-1）在腦外傷后皮質(zhì)中不同時(shí)段的表達(dá)變化。方法建立小鼠腦外傷模型，分為腦外傷后1h、3h、6h、12h、24h、3d、7d組，同時(shí)設(shè)立假手術(shù)組及正常對照組。腦皮質(zhì)中伊文思藍(lán)（Evans blue，EB）含量檢測評估血腦屏障通透性，Western印跡法和免疫組織化學(xué)染色法檢測損傷皮質(zhì)區(qū)ZO-1的表達(dá)。結(jié)果腦外傷后1h皮質(zhì)中EB含量開始增加，傷后1～3d達(dá)高峰，傷后7d接近正常。Western印跡法顯示，ZO-1在損傷1h后表達(dá)下調(diào)，損傷1～3d達(dá)到最低值，損傷7d后明顯回升，但仍低于假手術(shù)組和正常對照組。免疫組織化學(xué)染色顯示，正常腦皮質(zhì)血管中ZO-1呈強(qiáng)陽性表達(dá)，損傷后表達(dá)逐漸減弱，損傷3d后陽性表達(dá)幾乎消失，之后逐漸恢復(fù)。結(jié)論ZO-1在腦外傷后皮質(zhì)區(qū)呈先降低后升高的表達(dá)規(guī)律，與腦外傷后血腦屏障通透性變化規(guī)律呈負(fù)相關(guān)，為推斷腦外傷損傷時(shí)間提供了新指標(biāo)。

法醫(yī)病理學(xué)；腦損傷；閉鎖小帶蛋白-1；小鼠

血腦屏障對于維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定具有重要意義，腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接是血腦屏障結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ)[1]。目前研究發(fā)現(xiàn)，胞質(zhì)附著蛋白、跨膜蛋白及細(xì)胞骨架蛋白共同組成了緊密連接，其中胞質(zhì)附著蛋白是緊密連接結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，包括閉鎖小帶（zonula occludens，ZO）蛋白家族[2]。已有文獻(xiàn)[3]報(bào)道，損傷、缺血、缺氧、感染、免疫及理化因素等均可能引起緊密連接結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生改變造成血腦屏障損害，從而導(dǎo)致其通透性升高引起腦水腫。本研究通過建立小鼠腦外傷模型，觀察損傷后腦皮質(zhì)ZO-1的表達(dá)變化，并檢測腦外傷后皮質(zhì)中伊文思藍(lán)（Evans blue，EB）的含量變化，從而闡述腦外傷后腦水腫的形成機(jī)制，并為推斷腦外傷損傷時(shí)間提供新的指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

兔抗小鼠ZO-1多克隆抗體（ab59720，美國Abcam公司），兔抗小鼠GAPDH多克隆抗體（杭州賢至生物科技有限公司），辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）（A0208，上海碧云天生物技術(shù)有限公司），兔SP檢測試劑盒（SP-9001，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），伊文思藍(lán)（ab120869，美國Abcam公司），ECL試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.2 腦外傷模型的建立及分組

取健康成年雄性CD-1小鼠81只（體質(zhì)量25～30g，購于上海SLAC實(shí)驗(yàn)動物有限公司）。隨機(jī)取63只進(jìn)行建模：4%水合氯醛（1 mL/100 g）腹腔麻醉小鼠，采用改良的自由落體打擊法，建立小鼠腦外傷模型[4]。隨機(jī)分為腦外傷后1h、3h、6h、12h、24h、3d、7d組，每組9只。同時(shí)設(shè)立假手術(shù)組及正常對照組各9只。假手術(shù)組只開顱暴露硬腦膜，不進(jìn)行打擊損傷，正常對照組則不做任何處理。

每組小鼠中3只用于腦皮質(zhì)中EB含量檢測，3只用于Western印跡法，3只用于免疫組織化學(xué)染色法。

1.3 EB含量檢測

小鼠腦皮質(zhì)中EB含量測定的方法參照文獻(xiàn)[5]，并作改進(jìn)。小鼠創(chuàng)傷性腦損傷后于處死前2 h尾靜脈注射2%EB，損傷后不同時(shí)間點(diǎn)4%水合氯醛麻醉后，用生理鹽水對小鼠進(jìn)行心臟灌流，除去未結(jié)合的染料，斷頭處死，迅速取損傷腦皮質(zhì)稱重，放入盛有3 mL甲酰胺的試管中，加上橡皮塞，60℃水浴中（避光）抽提48h，加溫1h后用細(xì)棒將浮在上面的腦組織輕輕壓沉，以便皮質(zhì)中EB充分溶解出來。勻漿液以離心半徑9.35 cm，12 000 r/min，4℃，離心20 min，取200 μL上清液于96孔板中，用ELX800吸光酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）于620nm處測定吸光度。按公式計(jì)算腦皮質(zhì)中EB含量，以EB含量（μg/g）代表血腦屏障通透性的改變。

EB（μg/g）=標(biāo)準(zhǔn)品EB質(zhì)量濃度（μg/mL）×甲酰胺量（mL）/腦濕重（g）。

1.4 Western印跡法

小鼠損傷后在不同時(shí)間點(diǎn)腹腔麻醉，經(jīng)40mL生理鹽水心臟灌流后斷頭處死。取損傷周圍2mm腦皮質(zhì)，-80℃保存。提取腦組織總蛋白，電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，分別加入兔抗小鼠ZO-1（1∶500）和GAPDH （1∶1000）多克隆抗體，4℃孵育過夜，0.01mol/L PBS洗膜，HRP標(biāo)記羊抗兔IgG（H+L）雜交，37℃孵育2 h，ECL試劑盒顯色后X線膠片顯像掃描，檢測ZO-1條帶光密度值，將其與GAPDH的比值作為相對表達(dá)強(qiáng)度。

1.5 免疫組織化學(xué)染色法

小鼠損傷后在不同時(shí)間點(diǎn)用4%水合氯醛腹腔麻醉，經(jīng)生理鹽水40 mL及4%多聚甲醛溶液40 mL心臟灌流后，斷頭取腦皮質(zhì)放入4%多聚甲醛溶液后固定4h，0.01mol/L PBS漂洗3次后轉(zhuǎn)移至30%、20%、10%梯度蔗糖中脫水。冰凍切片（10μm），貼于載玻片上。采用SP法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，具體步驟按照試劑盒說明書。

1.6 圖像采集與數(shù)據(jù)分析

采用Scion Image 4.01軟件對Western印跡法檢測圖像進(jìn)行采集與分析。在每張免疫組織化學(xué)染色切片中，于損傷側(cè)腦皮質(zhì)取5個(gè)視野（×400）攝片。所有數(shù)據(jù)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析及兩兩比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 EB含量檢測結(jié)果

腦外傷后1h皮質(zhì)中EB含量開始增加，至損傷后1～3d達(dá)高峰，傷后7d逐漸降低并接近正常（表1）。

表1 腦外傷后皮質(zhì)中EB含量 （n=3，±s）

表1 腦外傷后皮質(zhì)中EB含量 （n=3，±s）

注：1）與正常對照組比較，P〈0.05

組別EB含量/（μg/g）ZO-1相對表達(dá)強(qiáng)度正常3.47±0.341.32±0.10假手術(shù)3.58±0.351.29±0.10傷后1h4.71±0.200.91±0.081）傷后3h5.92±0.311）0.80±0.051）傷后6h7.65±0.751）0.65±0.081）傷后12h8.97±0.521）0.57±0.071）傷后1d11.84±0.531）0.44±0.041）傷后3d13.94±0.491）0.34±0.061）傷后7d4.39±0.490.99±0.081）

2.2 Western印跡法結(jié)果

假手術(shù)組ZO-1表達(dá)水平與正常對照組相當(dāng)，損傷1h后ZO-1表達(dá)開始下降，并于損傷1～3d達(dá)到最低值，損傷7d后ZO-1表達(dá)明顯回升，但仍低于假手術(shù)組和正常對照組（圖1、表1）。

圖1 腦外傷后皮質(zhì)中ZO-1的表達(dá)變化

2.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

在假手術(shù)組和正常對照組腦皮質(zhì)中可見明顯的ZO-1免疫染色陽性血管，染色血管多，染色深；傷后1 h出現(xiàn)免疫染色陽性血管減少，染色變淡，至傷后1～3d免疫染色陽性血管明顯減少，幾乎消失；至傷后7d免疫染色陽性血管逐漸增多，染色逐漸變深，但仍低于假手術(shù)和正常對照組（圖2）。

圖2 腦外傷后皮質(zhì)中ZO-1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果SP×400

3 討論

創(chuàng)傷性腦損傷，又稱腦外傷，是指一類由外傷導(dǎo)致腦組織嚴(yán)重?fù)p害的疾病，具有高發(fā)生率、高致殘率及高致死率等特點(diǎn)[6]，目前已成為影響人類健康的主要原因，已引起國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界的高度關(guān)注和廣泛研究。外傷后繼發(fā)性腦水腫是腦外傷后最常見的一種繼發(fā)病變，常引起顱內(nèi)壓增高和腦血流灌注減少，加重腦組織缺氧缺血，從而形成惡性循環(huán)，最終造成腦組織不可逆的損壞，是顱腦損傷患者致死和致殘的主要原因[7]。繼發(fā)性腦水腫主要分為兩種類型，細(xì)胞毒性水腫（細(xì)胞內(nèi)水腫）和血管源性水腫（細(xì)胞外水腫）。研究表明[1，8]，血管源性腦水腫的形成與血腦屏障完整性破壞密切相關(guān)。完整的血腦屏障由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、周細(xì)胞以及包繞腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的基底膜構(gòu)成[8]，只允許小分子物質(zhì)通過，當(dāng)血腦屏障發(fā)生破壞時(shí)，血管內(nèi)的大分子物質(zhì)可通過血腦屏障滲出到細(xì)胞外間隙，從而形成血管源性腦水腫。EB與血漿蛋白結(jié)合不能通過完整的血腦屏障，當(dāng)血腦屏障遭受破壞，通透性增大時(shí)，EB-血漿蛋白復(fù)合物可通過損傷的血腦屏障滲出到血管外，因此可通過檢測外源性注射的EB在損傷區(qū)腦組織的含量評估血腦屏障的通透性[9]。本實(shí)驗(yàn)通過檢測腦外傷后不同時(shí)間段皮質(zhì)中EB的含量發(fā)現(xiàn)，腦外傷后1h即發(fā)生血腦屏障的破壞，1～3d時(shí)血腦屏障破壞最為嚴(yán)重，并于7d逐漸修復(fù)。這也印證了前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果[10]，腦外傷后腦水腫在傷后1～3d到高峰，之后逐漸恢復(fù)。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)[1，8]，顱腦損傷后腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接蛋白對維持血腦屏障結(jié)構(gòu)與功能發(fā)揮重要作用。ZO-1是第一個(gè)被證實(shí)的緊密連接胞質(zhì)附著蛋白，相對分子質(zhì)量約220000，隨后ZO-2和ZO-3亞型被發(fā)現(xiàn)，ZO-1與“衛(wèi)星分子”ZO-2、ZO-3組成ZO-1/ZO-2/ZO-3復(fù)合體，具有3個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域，即盤狀同源區(qū)域[2]。ZO-1/ZO-2/ZO-3復(fù)合體通過PDZ結(jié)構(gòu)域與claudin的C端相互作用，并通過C端與肌動蛋白相互作用，將跨膜蛋白和細(xì)胞骨架蛋白連接在一起，從而發(fā)揮“腳手架”的功能，對維持血腦屏障的結(jié)構(gòu)完整和功能發(fā)揮起至關(guān)重要的作用[11]。由于ZO-1對于各種影響血腦屏障功能的刺激敏感，使其成為一種顯示緊密連接功能正常與否的可靠標(biāo)志。本研究中，Western印跡法檢測結(jié)果顯示損傷后ZO-1表達(dá)逐漸減少，并于損傷后1～3 d達(dá)到最低值，之后逐漸回升；免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明在正常腦皮質(zhì)血管中ZO-1呈高強(qiáng)度表達(dá)，腦外傷后皮質(zhì)中血管遭受破壞，ZO-1表達(dá)減弱，并于腦外傷3d后表達(dá)明顯減弱，甚至消失，之后逐漸恢復(fù)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腦外傷后ZO-1呈現(xiàn)先降低后升高的表達(dá)規(guī)律，與腦外傷后腦水腫的變化規(guī)律呈負(fù)相關(guān)，這與腦外傷后血腦屏障的完整性遭受破壞存在直接關(guān)系。

顱腦損傷是法醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中最常見的死亡原因，除研究顱腦損傷的死亡機(jī)制外，準(zhǔn)確推斷顱腦損傷時(shí)間一直是法醫(yī)工作者研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)之一。本研究中Western印跡法檢測結(jié)果與免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的變化規(guī)律一致，為腦損傷形成時(shí)間的推斷提供了新的參考指標(biāo)。但尚未驗(yàn)證ZO-1在實(shí)際檢案中不同時(shí)間腦損傷后腦組織的表達(dá)，且損傷程度及死亡時(shí)間是否會影響ZO-1的表達(dá)尚需進(jìn)一步研究。

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Expression of Zonula Occludens-1 in Cerebral Cortex Following Traumatic Brain Injury

WANG Tao1，2,MENG Ying3,ZOU Dong-hua1,LI Zheng-dong1,CHEN Yi-jiu1,TAO Lu-yang2
（1.Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine,Institute of Forensic Science,Ministry of Justice,Shanghai 200063,China;2.Department of Forensic Medicine,Medical College of Soochow University,Suzhou 215123,China;3.Intensive Care Unit,Suzhou High-tech Zone People's Hospital,Suzhou 215129,China）

Objective To observe the time-course expression of zonula occludens-1（ZO-1）in cerebral cortex after traumatic brain injury（TBI）.Methods The TBI model of mouse was established.The mice were divided in 1 h,3 h,6 h,12 h,24 h,3 d,7 d after TBI,sham and control groups.The permeability of the blood brain barrier was evaluated by measuring the extravasation of Evans blue（EB）dye.The expression of ZO-1 in cerebral cortex in the injured area was detected by Western blotting and immunohistochemistry.Results The extravasation of EB dye of injured cortex gradually increased from 1h, peaked at 1-3 d and approximately decreased to normal at 7 d after TBI.Western blotting revealed that the expression of ZO-1 gradually decreased after 1h,was at the lowest at 1-3d,and then significantly increased after 7d but was still lower than that of normal and sham groups.The result of immunohistochemistry showed that ZO-1 had strong expression in vessel of normal cortex,gradually decreased after TBI,and almost disappeared at 3 d after TBI and gradually recovered to normal level later.Conclusion The expression of ZO-1 in the injured cortex after TBI initially decreases and then increases.The negative correlation between ZO-1 expression and EB extravasation after TBI could be used as a new indicator for wound age estimation.

forensic pathology;brain injuries;zonula occludens-1;mice

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2015.02.002

1004-5619（2015）02-0085-03

2014-12-22）

（本文編輯：劉寧國）

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAK16B02）；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81273338、81172911）；上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目（14DZ2270800）；上海市博士后科研資助計(jì)劃項(xiàng)目（14R21423000）；蘇州市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（SZP201304）

王濤（1984—），男，安徽阜陽人，博士，主要從事顱腦損傷研究；E-mail：0253010217＠163.com

陳憶九，男，研究員，博士研究生導(dǎo)師，主要從事法醫(yī)病理學(xué)研究：E-mail：chenyj＠ssfjd.cn

通信作者：陶陸陽，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事顱腦損傷及ERP研究；E-mail：luyang.tao＠163.com