任強　陳連水　鄒義冬　吳心怡

摘要：通過對江西省撫州市南豐縣市山鎮(zhèn)郊橘園土壤、萊溪水田邊橘園土壤、軍峰山石橋橘園下層土壤、旴江邊橘園上層土壤的微生物進行培養(yǎng)，再通過菌落觀察、測量、計數(shù)及細胞形態(tài)、大小的觀測，計算出各土壤培養(yǎng)組中固氮菌群落的Margalef豐富度指數(shù)（dma）、Simpson優(yōu)勢度指數(shù)（D）、Shannom-Winener多樣性指數(shù)（H′）、Pielou均勻度指數(shù)（Jsw）、每皿平均種類數(shù)和平均個體數(shù)，再進行種群間的相似性分析，以期能體現(xiàn)南豐蜜橘的獨特性和南豐蜜橘橘園土壤微生物的多樣性狀況。試驗結果表明，南豐蜜橘不同耕作方式對土壤有一定影響，合理的種植措施可以改善土壤微生物多樣性，從而使南豐蜜橘高產、優(yōu)質。初步得出結論：除保證品系、苗木質量、合理施肥外，保護產地的生態(tài)條件是目前情形下保護南豐蜜橘優(yōu)良品質最有效的措施。

關鍵詞：南豐蜜橘；土壤微生物；多樣性；土壤固氮菌；豐富度指數(shù)

中圖分類號： S666.206 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0414-03

南豐蜜橘（Citrus reticulata）香甜可口，核小，果實色澤金黃，皮薄肉嫩，食不存渣，風味濃郁，芳香撲鼻，以其滋味濃醇而著稱于世，是江西省甚至是全國的著名良種。南豐蜜橘的品質是南豐蜜橘研究的核心問題，但隨著種植面積大幅度增加以及產量的提高，人們普遍反映南豐蜜橘的質量和風味下降，值得研究者和種植者關注。品質是蜜橘產業(yè)化的核心，南豐蜜橘發(fā)展的關鍵點應當放在提高品質上，應加大南豐蜜橘產業(yè)產前、產中、產后的投入力度。南豐蜜橘整體品質自1991年大凍后有所下降，在不同程度上出現(xiàn)皮厚、不化渣、味不濃、籽多、偏酸等現(xiàn)象。據(jù)江西省南豐蜜橘普查工作小組1999年對南豐縣36個典型橘園36個果樣的調查分析，符合江西省標準DB36/T127—1993《南豐蜜橘》的僅有13個果樣，占總樣的36%，19%的果樣可溶性固形物含量低于標準，64%的果樣含酸量不符合標準[1-6]。方治軍等研究發(fā)現(xiàn)，南豐蜜橘在果實的色澤、肉質、風味、可溶性固形物含量、維生素C含量等方面存在較大的差異，并與產地氣候、土壤等主要生態(tài)因子有一定的相關性[7]，其中土壤養(yǎng)分是影響土壤性質的重要因子，對南豐蜜橘產量和品質有顯著的影響。土壤中的氮素損失一直是土壤微生物學家重視的問題，目前正在研究以抑制硝化細菌活動的方式減少土壤中的硝化、反硝化作用，從而防止氮肥的損失和避免因形成亞硝酸而污染水域。固氮菌除能固氮之外，還能形成維生素和異生長素，不僅能刺激農作物生長發(fā)育、提高產量，也能加強其他根際微生物的生命活動，促進土壤有機物質的礦化作用，從而改良土壤結構、改善農作物品質[8-13]。許多對植物或動物有害的物質如農藥、重金屬等超過一定限度同樣會影響或危及土壤微生物種類，而土壤具有分解有毒化合物的作用，這種作用是靠土壤中的微生物（主要是細菌）來完成的[14-16]，這也是橘園土壤固氮菌研究的重要性在另一個方面的體現(xiàn)。陳晶等研究表明，不同農藥及其不同濃度對自生固氮菌生長及固氮量的影響有所不同，從而為添加固氮菌以提高農作物產量、監(jiān)測固氮菌含量來評估作物產量，以及田間正確使用農藥提供了理論依據(jù)。另外，目前利用固氮菌開發(fā)的生物型肥料也日益應用在綠色農業(yè)生產中[15-17]。

本研究通過對江西省撫州市南豐縣市山鎮(zhèn)郊橘園土壤、萊溪水田邊橘園土壤、軍峰山石橋橘園下層土壤、旴江邊橘園上層土壤的微生物進行培養(yǎng)、觀察、計算，分析土壤微生物的多樣性指標，以期為保持南豐蜜橘生長所需的土壤條件提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料來源 所用土樣分別采自江西省南豐縣萊溪田邊橘園土壤、市山鎮(zhèn)郊平地橘園土壤、旴江邊平地橘園土壤、軍峰山腳下橘園土壤。

1.1.2 試驗試劑 主要試劑有：50 mg/L重鉻酸鉀抑制劑溶液、1 mol/L NaOH溶液、復紅染劑、改良的Ashby培養(yǎng)基、革蘭氏染色劑、95%乙醇溶液、0.85%生理鹽水、番紅溶液、碘液、結晶紫染液、無菌水等。

1.1.3 儀器與耗材 主要儀器與耗材有：DHG-9003BS-Ⅲ型電熱恒溫鼓風干燥箱、DNP-9002BC-Ⅲ型電熱恒溫培養(yǎng)箱、BD-156CT型超低溫冰柜、SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺、B-103 單目顯微鏡、BCD-193A 冰箱、BS223S 電子天平、CJ-2FD型超凈工作臺、B203LED生物顯微鏡、YX280A手提式不銹鋼蒸氣消毒器、錐形瓶、電爐、無菌試管、無菌培養(yǎng)皿、無菌燒杯、玻璃棒、接種環(huán)、無菌吸管、無菌棉、吸水紙、擦鏡紙、量筒、試管架、刷子、載玻片、顯微鏡、滴管、無菌錐形瓶、石棉網、手套、無菌袋、移液槍、涂棒、錫紙、蓋玻片、精確pH試紙等。

1.2 試驗方法與步驟

1.2.1 配制改良后的Ashby培養(yǎng)基 分別在加有一定蒸餾水的燒杯中加入100 g甘露醇、5 g CaCO3、0.2 g MgSO4·7H2O、0.1 g CaSO4·2H2O、0.2 g KH2PO4、0.1 g CaSO4·2H2O、0.2 g NaCl、20 g瓊脂，加熱使瓊脂融化后加蒸餾水定容至1 000 mL。

1.2.2 南豐蜜橘土壤中固氮菌的分離培養(yǎng) 制備土壤稀釋液，用移液槍吸取0.1 mL土壤稀釋液涂布在改良的Ashby培養(yǎng)基中，將平板倒置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d[18]。之后每過1 d對每個培養(yǎng)皿中產生的固氮菌分別進行計數(shù)并描述各種固氮菌的形態(tài)、生化生理特征[19-21]。

1.2.3 革蘭氏染色及個體形態(tài)觀察與計數(shù) 取固氮菌常規(guī)涂片、干燥、固定。滴加結晶紫（剛好將菌膜覆蓋即可）染色1～2 min，之后水洗。殘水用碘液沖去，并用碘液覆蓋約1 min，再水洗。用濾紙吸去玻片上的殘水，將玻片傾斜，置于白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脫色，直至流出的乙醇不出現(xiàn)紫色時，立即水洗。用番紅液復染約2 min，水洗。干燥后，用油鏡觀察菌種的形態(tài)，結合細菌計數(shù)板計數(shù)。endprint

1.3 計算公式：

總個體數(shù)：N=∑NiSi；

總種數(shù)：S=∑Si；

Margalef豐富度指數(shù)：dma=（S-1）/lnN；

Simpson優(yōu)勢度指數(shù)：D=1-∑P2i；

Shannom-Winener多樣性指數(shù)：H′=-∑PilnPi；

Pielou均勻度指數(shù)：Jsw=H′/H′max。

2 結果與分析

2.1 南豐蜜橘土壤固氮菌多樣性指數(shù)統(tǒng)計分析結果

通過對市山鎮(zhèn)郊橘園土壤（1號土樣）、萊溪水田邊橘園上層土壤（2號土樣）、萊溪水田邊橘園中層土壤（3號土樣）、軍峰山石橋橘園下層土壤（4號土樣）、旴江邊橘園上層土壤（5號土樣）、萊溪水田邊橘土下層土壤（6號土樣）的土壤固氮菌種數(shù)和個體數(shù)對應關系計算出Ni、Si，再運用“1.3”節(jié)各公式計算出各土壤培養(yǎng)組固氮菌群落的Margalef豐富度指數(shù)（dma）、Simpson優(yōu)勢度指數(shù)（D）、Shannom-winener多樣性指數(shù)（H′）、Pielou均勻度指數(shù)（Jsw）、每皿平均種數(shù)和平均個體數(shù)，結果見表1、圖1、圖2。

2.2 根據(jù)固氮菌進行樣點間聚類分析

本試驗中，采用最短距離法進行聚類分析，以2個樣方間距離系數(shù)BC為指標， 各樣方用Sample i表示（Sample 1代表市山鎮(zhèn)郊橘園土壤、Sample 2代表萊溪水田邊橘園上層土壤、Sample 3代表萊溪水田邊橘園中層土壤、 Sample 4代表軍峰山石橋橘園下層土壤、Sample 5代表旴江邊橘園上層土壤、Sample 6代表萊溪水田邊橘園下層土壤），dij表示xi與xj之間的距離，Dpq表示樣方Sample p與樣方Sample q之間的距離。則2個樣方間的最短距離表示為：Ds（p，q）=min{djk︱j∈Gp，k∈Gq}。采用最短距離法對本試驗中的6個樣方進行分類，得各樣方間距離，D（0）矩陣見表2。

從圖3可以通過距離的大小看出聚類的密切程度，距離越大，樣本間的差異也越大；反之，樣本間的差異越小。Sample 1和Sample 2的距離最小，故二者間的相似度也就最高；其次是Sample 3與Sample 6之間的距離，也很近。將Sample 3與Sample 6的交點記為A，則A與Sample 4的距離最短，若將A與Sample 4的距離記為B，則B與Sample 5越近。相似度最遠的是Sample 1與Sample 5。也就是說，從固氮菌豐富性來講，市山鎮(zhèn)郊橘園土壤與萊溪水田邊橘園上層土壤間的相似度最高，萊溪水田邊橘園中層土壤與萊溪水田邊橘園下層土壤相似度次之，而市山鎮(zhèn)郊橘園土壤與萊溪水田邊橘園下層土壤間的相似度最低。

值得注意的是，利用最短距離法進行聚類分析有很多優(yōu)點，其分類簡單、應用廣泛，當兩類合并后與其他類的距離是所有距離中最小者，從而縮小了新合并類與其他類的距離，產生空間收縮，因而其靈敏度相對較低。

3 討論與結論

3.1 討論

微生物參與土壤物質轉化過程，在土壤形成、肥力演變、植物養(yǎng)分有效化和土壤結構的形成與改良、有毒物質降解及凈化等方面起著重要作用，數(shù)量龐大、種類繁多的土壤微生物是豐富的生物資源庫。由于人類對自然環(huán)境、自然資源的過度開發(fā)和干預，使得地球上數(shù)以萬計的物種消失或瀕臨滅絕，生境被嚴重破壞，生物多樣性喪失，生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性變弱，資源日益枯竭。植物根際微生態(tài)環(huán)境中，土壤微生物數(shù)量多、密度大，能在植物根系周圍形成一個物理屏障，由于在根際周圍的分泌物很多，最后在根冠周圍形成黏質層，進而構成一個相對穩(wěn)定的微生態(tài)環(huán)境，這對保護植物根系、提供營養(yǎng)物質、減少病原菌和害蟲入侵具有相當重要的作用。不同污染程度的土壤微生物群落序列在其均勻度指數(shù)、豐富度指數(shù)等方面均存在差異。通過對南豐蜜橘園土壤細菌Margalef豐富度指數(shù)、Simpson優(yōu)勢度指數(shù)、Shannom-Winener多樣性指數(shù)、Pielou均勻度指數(shù)、每皿平均固氮菌種數(shù)和平均固氮菌個體數(shù)的測算，側面反映了南豐蜜橘不同橘園土壤微生物種群在均勻度指數(shù)、豐富度指數(shù)等方面存在的差異。

3.2 結論

通過對6種橘園土樣掛果期土壤固氮菌的培養(yǎng)、菌落計數(shù)及統(tǒng)計計算，根據(jù)公式計算土樣中固氮菌群落的Margalef豐富度指數(shù)（dma）、Simpson優(yōu)勢度指數(shù)（D）、Shannom-Winener多樣性指數(shù)（H）、Pielou均勻度指數(shù)（Jsw）、每皿平均固氮菌種數(shù)、平均固氮菌個體數(shù)。可以得出以下結論：（1）Margalef豐富度指數(shù)（dma）大小為：5號土樣>3號土樣>6號土樣>4號土樣>1號土樣>2號土樣；（2）Simpson優(yōu)勢度（D）大小為：5號土樣>4號土樣>2號土樣>6號土樣>3號土樣>1號土樣；（3）Shannom-Winener多樣性指數(shù)（H′）大小為：5號土樣>4號土樣>2號土樣>3號土樣>6號土樣>1號土樣；（4）Pielou均勻度指數(shù)（Jsw）大小為：5號土樣>4號土樣>2號土樣>3號土樣>6號土樣>1號土樣；（5）平均種類數(shù)大小為：5號土樣>1號土樣=6號土樣=4號土樣>2號土樣=3號土樣；（6）平均個體數(shù)大小為：2號土樣>1號土樣>4號土樣>6號土樣>3號土樣>5號土樣。

萊溪水田邊橘園上層土壤的平均固氮菌個體數(shù)最多，說明其相對穩(wěn)定的環(huán)境比其他樣點的土壤更有利于固氮菌的生長；旴江邊橘園上層土壤擁有的物種豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)要遠高于其他土壤。說明旴江邊橘園上層土壤更有利于固氮菌物種多樣性的發(fā)展。

不同樣地的南豐蜜橘掛果期土壤固氮菌的數(shù)量、種類以及多樣性差異的出現(xiàn)，是由于它們所處的地理位置不同，另外人為干擾也占絕大一部分因素。南豐蜜橘品質的好壞原因中，其地理環(huán)境是最重要的，因為一方面它直接影響到微生物的生長情況，不同的地域可能由于氣候和土壤條件的不同會使微生物的種類、個體數(shù)、多樣性產生明顯的差異。而另一方面人為干擾也會造成蜜橘品質不同，適當?shù)氖┓屎苤匾?，但過度施肥有可能導致南豐蜜橘品質下降，以致失去原味，變得更酸。同時，耕作方式和農藥噴灑等因素都會造成生物群落的改變，從而對南豐蜜橘的品質造成一定的影響。由于旴江邊橘園上層土壤微生物群落除受水質以及外圍雜草侵入等少量因素影響外，基本保持原始狀態(tài)；而其他的樣地耕作方式、化肥和農藥施用等人為環(huán)境的干擾較嚴重，土壤微生物群落變化較大?？梢赃m當?shù)剡M行人為的呵護，從而讓其保持原有生態(tài)布局。本研究表明，土壤微生物的多樣性反映出南豐蜜橘各個橘園的土質情況，應結合當?shù)貙嶋H情況，通過各種途徑進行土壤改良。所以為了保護好南豐蜜橘的優(yōu)良品質，應盡量讓其在原產地生長。endprint

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