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樺褐孔菌總?cè)铺崛」に嚨难芯?/h1>
2015-12-24 03:30戚月婷玄光善
應(yīng)用化工 2015年5期
關(guān)鍵詞:孔菌三萜類異丙醇

戚月婷,玄光善

(青島科技大學(xué) 藥學(xué)系,山東 青島 266042)

樺褐孔菌(Inonotus obliquus)又名樺樹菇、西伯利亞靈芝,中文學(xué)名為白樺茸。在外文資料中,其學(xué)名常以Inonotus obliquus(Fr. )Pilat 出現(xiàn)[1]。樺褐孔菌是一種極其珍貴的藥用真菌,屬多孔菌科褐臥孔菌屬,是一種生長在寒帶的木腐菌。樺褐孔菌菌核呈現(xiàn)瘤狀、無柄,外表黑色或黑褐色,內(nèi)部黃褐色,老后表面深裂,很硬,干時脆。野生樺褐孔菌生于白樺、銀樺等樹的活立木的樹皮下或砍伐后樹木的枯干上。樺褐孔菌主要分布在北緯45 ~50°的中國的黑龍江和吉林、波蘭、芬蘭、北美北部、俄羅斯、日本北海道等地。樺褐孔菌是俄羅斯及東歐地區(qū)一帶的民間藥用真菌,其有效成分已經(jīng)引起美國、韓國、日本等國科學(xué)家的高度重視。俄羅斯認(rèn)為,樺褐孔菌是上帝賜給苦難人類的禮物。日本的研究人員高度評價樺褐孔菌為“萬能藥”。美國則把樺褐孔菌列入“特殊的天然物質(zhì)”,作為未來宇航員們的飲品。

隨著對樺褐孔菌化學(xué)成分的研究日漸深入,大量活性成分被分離出來,包括多糖、三萜類化合物、樺褐孔菌素、樺褐孔菌醇、栓菌酸、木質(zhì)素類和黑色素類等200 多種化學(xué)成分。研究發(fā)現(xiàn),樺褐孔菌具有抗癌、防治糖尿病、抗衰老、增強機體免疫、防治艾滋病等多種藥理作用[2]。三萜類化合物作為樺褐孔菌的一種主要活性成分,可用于惡性腫瘤、糖尿病、肝病、心血管疾病以及艾滋病的預(yù)防和治療[3]。研究發(fā)現(xiàn),其主要有效成分為羊毛脂烷型四環(huán)三萜[4]。

三萜類化合物的結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜,而且性質(zhì)不太穩(wěn)定,溫度太高會破壞其結(jié)構(gòu);難溶于水,易溶于有機溶劑。根據(jù)相似相容的原理,可選用極性相近的異丙醇作為提取溶劑[5]。超聲波輔助提取法,作為一種新技術(shù),是利用超聲波產(chǎn)生的高速、強烈的空化效應(yīng)和攪拌作用,破壞藥材細(xì)胞,促進溶劑滲透到藥材細(xì)胞中,大大縮短了提取時間。此技術(shù)效率高、節(jié)省溶劑,尤其對植物細(xì)胞壁內(nèi)活性物質(zhì)的提取具有優(yōu)勢[6]。本實驗采用超聲輔助-回流提取法提取樺褐孔菌總?cè)?,以獲得最佳提取工藝參數(shù),為后續(xù)的純化分離及工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

樺褐孔菌,購于吉林長白山,干燥、粉碎、過40目篩后保存;齊墩果酸對照品(Sigma 公司,純度>98%);香草醛、冰醋酸、高氯酸、異丙醇等均為分析純。

FW100 型高速萬能粉碎機;HB-6 型磁力攪拌恒溫水浴鍋;RE-5 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;KH-250DB 型數(shù)控超聲波清洗器;UV762 型紫外-可見分光光度計。

1.2 實驗方法

準(zhǔn)確稱取1.00 g 樺褐孔菌粉,按料液比1 ∶10 g/mL加入異丙醇,在90 Hz、50 ℃的條件下超聲30 min,然后加熱回流提取2 h。減壓過濾,濾液旋蒸除去溶劑。用甲醇定容至50 mL 容量瓶用于含量測定。

1.3 分析方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以齊敦果酸為標(biāo)準(zhǔn)品,采用香草醛-冰醋酸-高氯酸分光光度法進行總?cè)坪繙y定[7-8]。準(zhǔn)確稱取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg,置于50 mL 容量瓶,用甲醇稀釋至刻度,并搖勻,即得質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。準(zhǔn)確移取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液0,0. 10,0. 20,0. 30,0. 40,0.50,0.60,0.70 mL,分別加入10 mL 具塞試管中,水浴揮盡溶劑,然后加入0.3 mL 新鮮配制的質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%香草醛-冰醋酸溶液和1 mL 高氯酸,60 ℃水浴中反應(yīng)20 min,流水冷卻至室溫,加冰醋酸至10 mL,搖勻,在550 nm 波長處測定吸光值。以齊墩果酸質(zhì)量x 為橫坐標(biāo),吸光度y 為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,見圖1。

圖1 三萜類化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of triterpenoids

由圖1 可知,標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y =3.524 6x-0.002 2,相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2。結(jié)果表明,齊墩果酸在0 ~0.14 mg 范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

1.3.2 含量測定 準(zhǔn)確移取0.1 mL 提取液,水浴揮干,按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作方法測定樣品在550 nm 波長時的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 定性分析

三萜類化合物的定性分析采用氯仿-濃硫酸顯色反應(yīng)[9],取一定量的樺褐孔菌異丙醇提取物,溶于氯仿,加入濃硫酸,氯仿層呈現(xiàn)紅色,說明有三萜類化合物存在。將氯仿層點樣在濾紙上,在254 nm的紫外分析儀下可以觀察到綠色熒光現(xiàn)象,說明提取液中有三萜類化合物存在。

2.2 單因素實驗

2.2.1 物料比對總?cè)频寐实挠绊?物料比對總?cè)频寐实挠绊懀妶D2。

圖2 物料比對總?cè)频寐实挠绊慒ig.2 Effects of material-liquid ratio on the yield of total triterpenoids

由圖2 可知,隨著物料比逐漸增大,總?cè)频寐氏仍龃蠛鬁p小,在物料比為1∶10 g/mL 時,達(dá)到最大值。2.2.2 提取溫度對總?cè)频寐实挠绊?提取溫度對總?cè)频寐实挠绊?,見圖3。

圖3 提取溫度對總?cè)频寐实挠绊慒ig.3 Effects of extraction temperature on the yield of total triterpenoids

由圖3 可知,隨著溫度的不斷升高,總?cè)频寐孰S之增加,70 ℃時,得率最高。在70 ~90 ℃的溫度范圍內(nèi),得率相對穩(wěn)定。過高的溫度會對三萜類化合物造成破壞。所以最佳提取溫度選擇80 ℃。

2.2.3 提取時間對總?cè)频寐实挠绊?提取時間對總?cè)频寐实挠绊懀妶D4。

圖4 提取時間對總?cè)频寐实挠绊慒ig.4 Effects of extraction time on the yield of total triterpenoids

由圖4 可知,總?cè)频寐孰S提取時間的延長先增大后減小,2 h 時達(dá)到最大值。原因可能是,提取時間>2 h 后,雜質(zhì)也會被溶出到提取溶劑中。

2.2.4 提取次數(shù)對總?cè)频寐实挠绊?提取次數(shù)對總?cè)频寐实挠绊?,見?。

表1 提取次數(shù)對總?cè)频寐实挠绊慣able 1 Effect of extraction times on the yield of total triterpenoids

由表1 可知,第一次提取的得率比較高,第二次及第三次的得率低很多。而且,多次提取會嚴(yán)重浪費時間和能源,也增加了后續(xù)濃縮工藝的難度。因此,提取1 次即可。

2.3 正交實驗結(jié)果

在單因素實驗的基礎(chǔ)上,以總?cè)频寐蕿榭疾熘笜?biāo),采用L9(34)正交實驗進行優(yōu)化。因素水平見表2,結(jié)果見表3。

表2 正交實驗因素水平Table 2 Factors and levels of orthogonal test

表3 正交實驗結(jié)果Table 3 The results of orthogonal test

由表3 可知,影響樺褐孔菌總?cè)频寐实囊蛩爻潭却笮∫来螢锳 >B >C,即物料比>提取溫度>提取時間。最優(yōu)組合為A2B3C3,即10 倍量異丙醇、提取溫度80 ℃、提取時間2.5 h。

考慮到提取時間對總?cè)频寐实挠绊懽钚?,而且? h 后,總?cè)频寐薀o明顯增加,從節(jié)約時間和能源的角度考慮,工業(yè)化生產(chǎn)時可采用10 倍量異丙醇,提取溫度80 ℃,提取時間2 h。

2.5 驗證實驗

為進一步考察最優(yōu)提取工藝的穩(wěn)定性,在該條件下,即物料比1∶10 g/mL、提取溫度80 ℃、提取時間2 h,進行3 次重復(fù)實驗,結(jié)果見表4。

表4 驗證實驗結(jié)果Table 4 The results of proof test

由表4 可知,平均得率為1.42%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 為2.14%,數(shù)據(jù)相對穩(wěn)定,表明該最佳提取工藝合理可行。

3 結(jié)論

用異丙醇提取樺褐孔菌總?cè)频淖罴压に嚍?料液比1∶10 g/mL,提取溫度80 ℃,提取時間2 h。采用該提取工藝提取樺褐孔菌總?cè)?,其得率可達(dá)1.42%。

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