譚小方，金華，徐麗，施蔚虹，丁家怡

（江蘇省南通市婦幼保健院生殖中心，南通 226006）

體外受精-胚胎移植（IVF-ET）是目前治療不育癥的重要手段。雖然IVF 的受精率達(dá)到了60%以上，但臨床妊娠率仍相對(duì)較低，只有30%～50%［1］。有研究認(rèn)為，在IVF-ET 技術(shù)中評(píng)估胚胎活力所使用的形態(tài)學(xué)評(píng)分法的準(zhǔn)確性有限，也是造成IVF-ET 低妊娠率和高多胎妊娠率的重要原因之一［2］。然而，有研究認(rèn)為檢測(cè)卵裂早期胚胎的氨基酸代謝水平可以提高胚胎活力評(píng)估的準(zhǔn)確性，并認(rèn)為受精后第3～5天胚胎氨基酸代謝水平更能反映胚胎活力［3］。本研究通過檢測(cè)受精后第3天胚胎培養(yǎng)基中氨基酸的水平，探討其與IVF-ET 妊娠結(jié)局的相關(guān)性。

資料與方法

一、臨床資料

回顧性分析我院生殖中心2012年4月至2014年1月行IVF-ET 助孕的不育夫婦163對(duì)。所納入的病例均在患者同意和我院生殖醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審議批準(zhǔn)的前提下，以體外培養(yǎng)的胚胎及培養(yǎng)基為研究對(duì)象，檢測(cè)了胚胎在受精后第3天的氨基酸水平。

納入對(duì)象標(biāo)準(zhǔn)如下：（1）女方年齡≤35歲；（2）平時(shí)月經(jīng)基本規(guī)律；（3）首次接受IVF-ET 助孕；（4）HCG 注射日子宮內(nèi)膜厚度≥8mm；（5）男方精液常規(guī)檢查基本正常。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）種植失敗1次以上者；（2）患有確診的多囊卵巢綜合征（PCOS）和子宮內(nèi)膜異位癥或子宮腺肌癥；（3）促排卵過程中B 超或者子宮輸卵管造影（HSG）見明顯的輸卵管積液或?qū)m腔積液；（4）B超下內(nèi)膜有明顯異?；芈暪鈭F(tuán)。

共收集了163 個(gè)胚胎的卵裂液培養(yǎng)基檢測(cè)結(jié)果。根據(jù)移植胚胎是否妊娠分成2組：A 組為移植妊娠組，共81例，年齡在25～34歲之間；B 組為移植未妊娠組，共86例，年齡在24～35歲之間。

二、患者治療回顧

1.IVF-ET：采用常規(guī)長(zhǎng)方案超促排卵，即對(duì)兩組患者均使用促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑（GnRHa，達(dá)菲林，博福-益普生，法國(guó)）進(jìn)行垂體降調(diào)節(jié)，垂體降調(diào)節(jié)14d左右達(dá)到降調(diào)標(biāo)準(zhǔn)后使用促性腺激素（Gn）促排卵，并記錄Gn用量；陰道超聲檢查監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育情況，當(dāng)有2個(gè)卵泡平均直徑≥18mm 或3個(gè)卵泡平均直徑≥17 mm 時(shí)，當(dāng)晚肌注HCG 5 000～10 000U，36h后在陰道超聲引導(dǎo)下取卵。卵母細(xì)胞經(jīng)ECM 卵裂培養(yǎng)液（Sage，美國(guó)）洗滌后行常規(guī)IVF 或卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）受精。取卵后72h（D3）后行胚胎移植，移植后給予黃體酮40mg／d（河南益康制藥）肌注＋地屈孕酮20mg bid口服行黃體支持。

2.胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分：采用Scott評(píng)分法對(duì)原核期評(píng)分；參照文獻(xiàn)對(duì)卵裂期胚胎評(píng)分和分級(jí)（Gardner評(píng)分法）［1］：D3優(yōu)質(zhì)胚胎是指6～10細(xì)胞I級(jí)或8細(xì)胞Ⅱ級(jí)的胚胎。

3.妊娠結(jié)局判斷：胚胎移植后第14 天，晨尿HCG 或血HCG 檢驗(yàn)，陽(yáng)性者為生化妊娠；移植后第4周，B超檢查見孕囊者為臨床妊娠。

4.培養(yǎng)液中氨基酸水平檢測(cè)：在胚胎移植當(dāng)日收集培養(yǎng)基163份，并將樣本于-80 ℃長(zhǎng)期保存；檢測(cè)前在室溫下解凍后進(jìn)行高效液相色譜法（HPLC）檢測(cè)培養(yǎng)基中20種游離氨基酸水平。

三、觀察指標(biāo)

D3胚胎培養(yǎng)液中20種游離氨基酸水平；兩組患者年齡、降調(diào)天數(shù)、血清FSH 水平、不孕癥時(shí)間、體重指數(shù)（BMI）、Gn給藥時(shí)黃體生成素（LH）水平、Gn起始量、Gn天數(shù)、HCG 注射日的孕激素水平及子宮內(nèi)膜厚度、獲卵數(shù)、移植胚胎數(shù)、受精率、卵裂率、取卵后黃體酮用量等資料。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、兩組患者一般情況比較

兩組患者在年齡、基礎(chǔ)FSH、BMI、不孕年限、持續(xù)降調(diào)時(shí)間等16項(xiàng)指標(biāo)中，僅兩組的Gn起始量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其他均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P 均＞0.05）（表1）。

未妊娠組患者的年齡為（31.26±3.68）歲，略高于妊娠組患者的年齡（30.97±4.23）歲，未妊娠組患者在BMI、不孕時(shí)間、降調(diào)時(shí)間、Gn 起始量、Gn 天數(shù)、HCG 日雌激素水平、取卵數(shù)、取卵后黃體酮用量上要略高于妊娠組，但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（表1）。

二、妊娠組與未妊娠組培養(yǎng)基中氨基酸水平比較

采用HPLC法對(duì)妊娠組和未妊娠組培養(yǎng)基中20種氨基酸水平進(jìn)行分析，并取空白培養(yǎng)基作為對(duì)照。結(jié)果顯示，妊娠組和未妊娠組中天冬氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸水平均高于空白對(duì)照組（P＜0.05），而丙氨酸-谷氨酰胺水平均低于空白對(duì)照組（P＜0.05）；妊娠組中天冬氨酸、谷氨酰胺和丙氨酸低于未妊娠組（P＜0.05），但丙氨酸-谷氨酰胺水平高于未妊娠組（P＜0.05）（表2）。

表1 兩組患者一般情況比較（±s）

表1 兩組患者一般情況比較（±s）

注：與未妊娠組比較，＊P＜0.05

組 別 例數(shù) 年齡（歲） 基礎(chǔ)FSH（U／L） BMI（kg／m2） 不孕年限（年） 持續(xù)降調(diào)時(shí)間（d）未妊娠組 86 31.26±3.68 7.57±1.79 23.91±2.76 4.8±0.8 11.49±3.99妊娠組 81 30.97±4.23 8.02±2.16 22.78±2.57 4.1±1.1 12.07±3.2組 別 例數(shù) Gn起始量（U） Gn天數(shù)（d） Gn日LH 水平（U／L）HCG日雌激素水平（pmol／L）HCG日LH 水平未妊娠組 86 213.89±37.69 11.88±1.96 1.87±0.48 12 056±3 821 1.78±0.4妊娠組 81 176.52±41.03＊ 12.31±2.04 1.79±0.39 12 439±2 985 1.59±0.4組 別 例數(shù) HCG 日內(nèi)膜厚度（mm）取卵數(shù)（個(gè)） 移植胚胎數(shù)（個(gè)） 受精率（%）卵裂率（%）取卵后黃體酮用量未妊娠組 86 12.28±2.54 18.36±4.82 1.54±0.39 88.7±9.3 94.6±9.7 51.88±10.39妊娠組 81 13.07±2.52 14.29±5.49 1.86±0.52 89.9±8.9 96.8±9.1 54.69±11.79

表2 二十種游離氨基酸在不同組胚胎培養(yǎng)液的表達(dá)水平（μmol／ml，±s）

表2 二十種游離氨基酸在不同組胚胎培養(yǎng)液的表達(dá)水平（μmol／ml，±s）

注：與空白對(duì)組相比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與未妊娠組相比，＃P＜0.05

氨基酸名稱 空白對(duì)照組（n＝10） 未妊娠組（n＝86） 妊娠組（n＝81）天冬氨酸 21.36±3.80 75.91±16.50＊＊ 69.54±8.97＊＃谷氨酸 1.78±0.64 3.67±1.28＊ 3.67±0.73＊天冬酰胺 76.71±11.29 76.43±9.87 78.35±10.55絲氨酸 81.29±11.59 82.39±11.41 84.25±10.36谷氨酰胺 16.71±1.69 84.69±9.87＊＊ 57.48±8.99＊＊＃甘氨酸 40.59±10.43 74.48±11.66＊ 71.38±11.22＊蘇氨酸 309.81±51.58 318.23±47.35 311.29±49.31組氨酸 139.99±21.67 140.12±22.51 140.39±21.55丙氨酸 9.79±1.76 88.21±16.43＊＊ 57.89±12.36＊＊＃?；撬?67.62±13.33 68.71±9.98 70.13±11.69丙氨酸-谷氨酰胺 641.19±68.17 505.61±78.64＊ 579.98±79.36＊＃精氨酸 497.88±51.94 501.44±48.94 503.77±61.29酪氨酸 150.51±22.79 149.33±27.51 148.91±29.39纈氨酸 331.49±51.61 325.71±47.69 330.09±55.51蛋氨酸 71.61±14.88 70.66±10.11 72.78±12.57色氨酸 29.41±7.79 30.01±6.97 29.83±7.98苯丙氨酸 154.38±25.07 151.77±20.69 152.06±17.28異亮氨酸 318.98±31.76 321.49±49.56 324.71±24.66亮氨酸 316.91±57.49 323.80±53.60 317.93±49.44賴氨酸276.17±24.87 280.58±29.88 282.73±41.22

三、Logestic回歸分析培養(yǎng)基中氨基酸水平與IVF-ET 妊娠結(jié)局的關(guān)系

在單因素非條件Logistic回歸分析培養(yǎng)基中氨基酸水平與IVF-ET 妊娠結(jié)局的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，谷氨酰胺、丙氨酸和丙氨酸-谷氨酰胺與妊娠結(jié)局呈負(fù)相關(guān)性（表3）；多因素Logistic回歸分析中以IVF-ET 妊娠結(jié)局為因變量，以谷氨酰胺、丙氨酸為自變量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在取卵數(shù)和移植胚胎數(shù)校正后，谷氨酰胺、丙氨酸與妊娠結(jié)局仍然呈負(fù)相關(guān)性（表4）。

表3 單因素非條件Logistic回歸分析培養(yǎng)基中氨基酸水平與IVF-ET 妊娠結(jié)局的關(guān)系

表4 多因素非條件Logistic回歸分析培養(yǎng)基中氨基酸水平與IVF-ET 妊娠結(jié)局的關(guān)系

討 論

人類輔助生殖技術(shù)（ART）對(duì)于臨床不孕不育的治療無(wú)疑是20世紀(jì)偉大的成就之一。研究報(bào)道顯示，采用IVF-ET 妊娠率達(dá)到30%～50%左右。影響胚胎種植的因素是多方面的，而胚胎的質(zhì)量是影響胚胎種植的最關(guān)鍵因素之一［4-6］。

氨基酸在卵母細(xì)胞成熟及早期胚胎中發(fā)揮重要的作用［7］，參加一系列重要的生理過程。胚胎蛋白質(zhì)合成與20種氨基酸有關(guān)。其中，谷氨酸通過氨基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺，然后分解成α-酮戊二酸并通過檸檬酸循環(huán)形成三磷酸腺苷（ATP）；谷氨酰胺還具有其他的功能包括為再次合成嘌呤和嘧啶提供碳源和氮源，作為還原劑來保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷，調(diào)節(jié)糖代謝；天冬氨酸通過蘋果酸穿梭機(jī)制參與代謝調(diào)節(jié)，在乳酸代謝中發(fā)揮著重要的作用；精氨酸在一氧化氮合酶的作用下合成一氧化氮，從而參與胚胎的多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［8］。有研究顯示，受精后2～3d內(nèi)在形成完整胚胎與未形成完整胚胎的培養(yǎng)液中部分氨基酸有著顯著差異［9］；也有研究顯示部分氨基酸對(duì)于IVF-ET 妊娠結(jié)局有著重要影響［10］，氨基酸的種類以及含量在胚胎的染色體正常配對(duì)與異常配對(duì)、非整數(shù)倍染色體細(xì)胞中存在明顯差異，此外線粒體的活性與部分氨基酸的水平呈正相關(guān)。

本研究顯示，妊娠組和未妊娠組中天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸水平均高于空白對(duì)照組，而妊娠組天冬氨酸、谷氨酰胺和丙氨酸水平與未妊娠組有顯著性差異（P＜0.05），這一結(jié)果同以往的研究報(bào)道基本一致。在鄧彬等［3］的研究中，未妊娠組與妊娠組存在差異的主要為谷氨酰胺、丙氨酸，而本研究顯示除了上述兩個(gè)指標(biāo)以外，天冬氨酸水平兩組也顯示出有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但本研究所收集的觀測(cè)指標(biāo)在受精后第3d，比鄧彬所收集對(duì)象早2d。以往有研究顯示受精后1～2d胚胎培養(yǎng)液中天冬氨酸、甘氨酸、亮氨酸與妊娠結(jié)局有很大關(guān)系［10］；也有研究顯示，在形成桑椹胚以及早期胚胎形成階段，培養(yǎng)液中谷氨酰胺起著重要的作用［11］。這些研究結(jié)果說明，在胚胎形成早期可能有更多的氨基酸參與其形成和發(fā)展。

氨基酸參與胚胎發(fā)育的多種重要生理過程，在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，氨基酸代謝水平可在一定程度上反映胚胎的發(fā)育潛能。隨著胚胎序貫培養(yǎng)基的發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識(shí)到氨基酸代謝在人類早期胚胎發(fā)育過程中具有重要的作用。研究顯示，IVF的妊娠結(jié)局與胚胎培養(yǎng)基中的甘氨酸、亮氨酸和天冬氨酸的水平變化有關(guān)，且氨基酸水平的變化與胚胎的形態(tài)學(xué)級(jí)別、胚胎的種植潛能有關(guān)，發(fā)現(xiàn)它可以被視為胚胎移植臨床妊娠率和活產(chǎn)率的一個(gè)獨(dú)立的預(yù)測(cè)因子［13-14］。本研究留取受精后第3 天（D3）胚胎培養(yǎng)基進(jìn)行氨基酸代謝水平的檢測(cè)，同以往的文獻(xiàn)報(bào)道［3，10］在時(shí)間上略有提前，旨在更早發(fā)現(xiàn)在體外受精過程中氨基酸的代謝情況。有研究顯示，胚胎從解凍開始的0.5h內(nèi)氨基酸水平就處于不斷的變換當(dāng)中［15］，在受精后盡早檢測(cè)胚胎培養(yǎng)液中氨基酸的水平，尤其是采集大樣本量建立IVFET 早期胚胎培養(yǎng)液中氨基酸可控水平是值得研究的。

雖然科學(xué)技術(shù)在不斷創(chuàng)新和進(jìn)步，但是臨床研究顯示，ART 技術(shù)在提高妊娠率方面還有諸多問題亟待解決，如社會(huì)壓力導(dǎo)致婦女將妊娠期推遲，而年齡是影響妊娠和IVF-ET 種植率的主要原因［4，12］。在本研究中，我們也考慮是否上述原因會(huì)影響胚胎培養(yǎng)液中氨基酸的水平。本研究發(fā)現(xiàn)妊娠組較非妊娠組女方略顯年輕，但在Logistic回歸顯示該因素對(duì)妊娠結(jié)局無(wú)顯著影響。另外，未妊娠組較妊娠組的不孕年限略長(zhǎng)，Gn用量、HCG 日LH 值也略高，雖然無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，也可能提示不孕年限的增長(zhǎng)會(huì)增加IVF-ET 的失敗率。但通過Logistic回歸分析排除了這類干擾因素，顯示氨基酸水平是影響妊娠結(jié)果的關(guān)鍵因素，至少在本研究中可以說明這一點(diǎn)。

目前，國(guó)內(nèi)對(duì)于IVF-ET 早期胚胎培養(yǎng)液中氨基酸水平變化的研究報(bào)道較少，尤其是IVF-ET 早期胚胎發(fā)育中氨基酸對(duì)胚胎的形成以及妊娠結(jié)局的影響及影響機(jī)制還有待更多地研究。結(jié)合本文結(jié)果以及文獻(xiàn)報(bào)道，我們認(rèn)為，胚胎早期發(fā)育階段部分氨基酸（谷氨酰胺、丙氨酸）代謝水平的明顯變化與妊娠結(jié)局有一定的關(guān)系，但是氨基酸的水平變化到底影響妊娠哪一環(huán)節(jié)還有待進(jìn)一步研究。

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