黃會秋 ， 黃 遜， 余驚筍

（平陽縣疾病預(yù)防控制中心，浙江 溫州325400）

毒 鼠 強（tetramine）、氟 乙 酰 胺（fluoroacetamide）、氟乙酸鈉（fluoroacetamide）、甘氟Ⅰ（1，3-二氟-2-丙醇，1，3-difluoro-2-propanol）與甘氟Ⅱ（1-氯-3-氟-2-丙醇，1-chloro-3-fluoro-2-propanol）是一類有機滅鼠劑，在我國曾被廣泛用于滅鼠。這5 種滅鼠劑毒性強烈，且極易造成二次中毒，對人、畜的危害性很大，我國農(nóng)業(yè)部第199 號公告（2002 年）中已明令禁止生產(chǎn)和使用。

毒鼠強化學名為四亞甲基二砜四氨，毒性比氰化鉀強100 倍，是一種γ-氨基丁酸（GABA）的拮抗物，與神經(jīng)元GABA 受體形成不可逆的結(jié)合，使氯通道和神經(jīng)元喪失功能，尚未有確認的解毒劑，哺乳動物口服的LD50（半數(shù)致死劑量）為0.10 mg／kg；氟乙酰胺是一種具有接觸、熏蒸和內(nèi)吸收作用的有機氟滅鼠劑，對人致死量（經(jīng)口）為23 mg／kg；甘氟Ⅰ與甘氟Ⅱ統(tǒng)稱為甘氟（gliftor），屬于有機氟滅鼠劑，是一種具有選擇毒力的化合物，大鼠的口服LD50 為1.25 mg／kg。氟乙酰胺與甘氟在生物體內(nèi)都可代謝氧化成毒性更大的氟乙酸。氟乙酸（fluoroacetic）及其鈉鹽，在體內(nèi)與三磷酸腺苷和輔酶A作用形成氟乙酸輔酶A，再與檸檬酸作用形成氟檸檬酸，抑制烏頭酸酶，使三羧酸循環(huán)受阻，損害神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致出現(xiàn)一系列的病理改變，對人致死量（經(jīng)口）約為2 ～5 mg／kg［1］。

目前，甘氟Ⅰ與甘氟Ⅱ的檢測報道［2］較少，毒鼠強、氟乙酰胺與氟乙酸（鹽）的檢測方法較多，主要是色譜［3-7］及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用［8-12］等。這些方法一般只能同時檢測這5 種物質(zhì)中的1 ～2 種。關(guān)福玉等［13］采用添加微量三氯化鉻和較常規(guī)提高3 倍靈敏度的核磁共振法，一次性測定生物樣品中氟乙酸鈉、氟乙酰胺、甘氟Ⅰ與甘氟Ⅱ，但檢出限較高（mg／L 級），不適合血液內(nèi)微量（μg／L 級或更低）殘留檢測。尚未見同時檢測這5 種物質(zhì)的方法報道。由于這5 種滅鼠劑都屬于致痙攣性殺鼠劑，急性中毒時中毒癥狀較相似，為了搶救患者生命的需要，很有必要同時快速檢測。

毒鼠強、氟乙酰胺、甘氟Ⅰ與甘氟Ⅱ可直接被有機溶劑萃??；而氟乙酸鈉極性很強，易溶于水，不能從血清等極性基質(zhì)中用有機溶劑直接萃取，這可能是未見同時檢測這5 種物質(zhì)的原因之一。本文探索用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法同時檢測這5 種物質(zhì)。首先須衍生氟乙酸鈉以降低其極性，且衍生化過程不得影響其他4 種物質(zhì)的提取?；诖?，選擇氟乙酸鈉幾種常用衍生化方法中的酰胺化方式［5］，在酸性環(huán)境下于血清中直接添加衍生劑N，N-二乙基對苯二胺硫酸鹽及催化劑N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺，氟乙酸鈉衍生物與毒鼠強、氟乙酰胺、甘氟Ⅰ與甘氟Ⅱ一并被乙酸乙酯萃取，經(jīng)氮吹濃縮后用氣相色譜-質(zhì)譜測定。

另外，毒鼠強、氟乙酰胺、氟乙酸衍生物、甘氟Ⅰ與甘氟Ⅱ的沸點和極性差別很大，尤其是甘氟Ⅰ與萃取劑（如乙酸乙酯）的保留時間很接近，常規(guī)的非離子液體色譜柱都不易實現(xiàn)不分流模式下的分離。本法選用SLB-IL59 離子液體色譜柱，其具有出色的分離能力，可在15 min 內(nèi)較好地分離5 種滅鼠劑。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

GCMS-QP2010 Ultra 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本Shimadzu 公司）；5430R 高速冷凍離心機（德國Eppendorf 公 司）；N-EVAP 氮 吹 儀（24 孔，美國Organomation 公司）；HY-2 往復(fù)振蕩器、渦旋混勻器（金壇市富華儀器有限公司）。色譜柱：SLBIL59（固定液：1，12-二（三丙基磷）十二烷二（三氟甲基磺?；﹣啺?，美國Sigma-Aldrich 公司）。

N，N-二乙基對苯二胺硫酸鹽與N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺均為分析純（上海安譜公司）；乙酸乙酯、甲醇為HPLC 級（德國Merck 公司）；苯為色譜純（天津四友公司）；鹽酸為優(yōu)級純，氫氧化鈉為分析純（上海國藥集團）；氯化鈉為分析純（上海國藥集團），于550 ℃灼燒3 h 以上，干燥器中保存；實驗用水電導(dǎo)率＜3 μS／cm；空白血清來自瑞安血站。

毒鼠強標準溶液（200 mg／L）購自中國疾病預(yù)防控制中心；氟乙酰胺（純度97%）、氟乙酸鈉（純度99%）、甘氟Ⅰ（純度97%）與甘氟Ⅱ（純度96%）均購自德國Dr. Hielscher 公司，分別用甲醇配制成1 000 mg／L 的標準貯備溶液。臨用時用乙酸乙酯稀釋成各種單一或混合標準使用液。

1.2 樣品前處理

吸取2.00 mL 血清，置于10 mL 具塞尖底刻度玻璃離心管（以下稱離心管）中，分別加入100 μL N，N-二乙基對苯二胺硫酸鹽水溶液（100 g／L）和70 μL N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺甲醇溶液（66 g／L），用鹽酸溶液（1.0 mol／L）調(diào)pH 至2.0，混勻，室溫振蕩5 min（240 次／min）后，加入1.0 g 氯化鈉與6.00 mL 乙酸乙酯，用力振搖2 min，以3 000 r／min（離心半徑11.0 cm）離心5 min，吸取5.00 mL 上清液于50 ℃下氮吹近干，加入乙酸乙酯250 μL 并渦旋0.5 min，移至內(nèi)嵌微量尖底襯管（250 μL）的進樣瓶中，上機測定。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件 色譜柱：SLB-IL59（30 m×0.25 mm×0.20 μm，最高溫度：300 ℃）；進樣室溫度：240 ℃；柱溫程序：初始55 ℃，保持1 min，以100 ℃／min 升至150 ℃，再以30 ℃／min 升至240 ℃，保持15 min；載氣：He 氣，恒線速度：1.0 mL／min；進樣體積：1.0 μL，不分流進樣。

質(zhì)譜條件 接口溫度：240 ℃；電子轟擊（EI）離子源溫度：200 ℃；電子能量：70 eV；溶劑延遲時間：2.9 min；全掃描（Scan）模式定性：m／z 30 ～300；選擇離子監(jiān)測（SIM）模式定量。5 種滅鼠劑的分子結(jié)構(gòu)式見圖1，特征離子、定量離子及保留時間見表1。

圖1 5 種滅鼠劑的分子結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Molecular structures of the five rodenticides

表1 5 種滅鼠劑的保留時間、定量與特征離子Table 1 Retention times，quantitative and characteristic ions of the five rodenticides

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

選擇Rtx-5ms（30 m×0.25 mm×0.25 μm）、DB-17ms（30 m×0.25 mm×0.25 μm）、DB-1701（30 m×0.25 mm×0.25 μm）、SLB-IL59（30 m×0.25 mm×0.20 μm）色譜柱進行分離比較試驗。Rtx-5ms 與DB-17ms 可以在分流進樣模式下將甘氟Ⅰ與萃取劑乙酸乙酯分離，但不分流進樣模式下不易分離；DB-1701 無論在分流還是不分流進樣模式下，都能較好地將甘氟Ⅰ與乙酸乙酯分離，但甘氟Ⅰ拖尾較嚴重；SLB-IL59 是離子液體色譜柱，其擔體涂層離子液體呈現(xiàn)的強極性與高沸點特性，克服了傳統(tǒng)色譜柱隨極性增加，耐溫極限下降的不足，極性較現(xiàn)有的非離子液體色譜柱更強，最高使用溫度卻較高（300 ℃）。方法選擇SLB-IL59 色譜柱，不分流進樣模式，采用恒線速度程序升溫，經(jīng)多次試驗確定了1.3 節(jié)的色譜條件，15 min 內(nèi)成功分離了5 種劇毒滅鼠劑，標準品選擇離子色譜圖見圖2。

圖2 5 種滅鼠劑的選擇離子譜圖Fig.2 Selected ion monitoring chromatograms of the five rodenticides

2.2 氟乙酸衍生條件的確定

2.2.1 衍生方法

氟乙酸（鹽）相對分子質(zhì)量小，極性很強，需衍生化以降低其極性，以便從血清中提取，并改善色譜分離與提高靈敏度。目前適用于氣相色譜或氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測的衍生化模式主要有3 種：甲（乙）酯化［14］；用五氟芐基溴將氟乙酸衍生為氟乙酸五氟芐基酯［6］；酰胺化，用N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺催化氟乙酸與N，N-二乙基對苯二胺，衍生化產(chǎn)物為N-（4-N′，N′-二乙氨基）苯基氟乙酰胺，用GCNPD （nitrogen phosphorus detector）［5］或 GCMS［15］測定。前二種衍生方式都需在無水環(huán)境下進行，長時間的萃取及較高溫度的蒸干衍生過程易促使氟乙酰胺水解與甘氟揮發(fā)；而酰胺化衍生可以在水相中室溫下進行，衍生時間也較短，利于直接衍生水性生物樣品如血、尿中的氟乙酸（鹽），不會影響氟乙酰胺與甘氟的提取。本方法采用酰胺化衍生化方法。

2.2.2 衍生pH

氟乙酸酰胺化衍生需在酸性條件下進行。加入衍生劑與催化劑后的血清溶液pH 約為2.3，分別用鹽酸溶液（1.0 mol／L）與氫氧化鈉溶液（0.5 mol／L）調(diào)節(jié)衍生液pH 至1.0、1.8、2.0、2.1、3.0、4.0、5.0、6.0，考察pH 對衍生反應(yīng)的影響。如圖3a所示，pH 2.0 的血清溶液中氟乙酸鈉衍生物的質(zhì)譜峰最高，確定衍生pH 條件為2.0。

2.2.3 衍生溫度與時間

經(jīng)試驗，衍生反應(yīng)速度很快，可在室溫（10 ～30℃）下直接進行。由于催化劑N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺不溶于血清，催化時以振蕩為宜。萃取前分別振蕩0、2、5、10、15、25 min。如圖3b 所示，無須振蕩儀，僅萃取時手工振蕩2 min，衍生反應(yīng)已基本完成；儀器振蕩2 min 后氟乙酸衍生物的峰高已至最高，為保證衍生反應(yīng)充分選擇5 min 為衍生化時間。

2.2.4 衍生劑體積

實驗中分別向2.00 mL 空白血清中加入10、30、50、70、100、150、200 μL N，N-二乙基對苯二胺硫酸鹽溶液（100 g／L）與70 μL N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺甲醇溶液（66 g／L）。如圖3c 所示，隨著N，N-二乙基對苯二胺硫酸鹽溶液的添加量增加，氟乙?酸鈉衍生物的峰高也隨之增高；至100 μL 為最高。確定100 μL 為N，N-二乙基對苯二胺硫酸鹽溶液（100 g／L）的添加量。

2.2.5 催化劑體積

實驗中分別向2.00 mL 空白血清中加入10、30、50、70、100、200 μL N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺甲醇溶液（66 g／L）與100 μL N，N-二乙基對苯二胺硫酸鹽溶液（100 g／L）。如圖3d 所示，隨著N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺甲醇溶液的添加量增加，氟乙酸鈉衍生物的峰高也隨之增高；30 μL 時已近平衡；至70 μL 為最高。確定70 μL 為N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺甲醇溶液（66 g／L）的添加量。

2.3 萃取條件的優(yōu)化

2.3.1 萃取劑的種類

在氣相色譜與氣相色譜-質(zhì)譜方法中，對毒鼠強、氟乙酰胺、氟乙酸鈉衍生物、甘氟Ⅰ與甘氟Ⅱ的提取，苯與乙酸乙酯［16］是最常用的2 種萃取劑。比較了二者對5 種目標物的提取效果。如表2 所示，苯對毒鼠強、氟乙酰胺、氟乙酸鈉衍生物的萃取率要略高于乙酸乙酯，但對甘氟Ⅰ與甘氟Ⅱ的萃取率要低于乙酸乙酯。另外，苯較乙酸乙酯不易與甘氟Ⅰ在不分流狀態(tài)下分離，且毒性較大。因此選擇乙酸乙酯為萃取劑。

表2 乙酸乙酯與苯萃取血清中5 種滅鼠劑的萃取率Table 2 Extraction rates of the five rodenticides from serum with ethyl acetate and benzene

2.3.2 萃取劑的體積

在液液萃取操作實踐中，為了提高回收率，降低檢出限，分析工作者常常采用先少量多次萃取后氮吹濃縮的操作。實驗顯示，新鮮血清與乙酸乙酯二相界面有一約1 mm 乳化層（血清越不新鮮，乳化越嚴重，因此宜在一天內(nèi)完成樣本檢測），不適宜“少量多次”每次吸凈上清液的操作。本實驗采用一次性大劑量萃取，取大部分上清液氮吹濃縮至小體積，并通過基質(zhì)校準曲線消除基質(zhì)對回收率的影響。經(jīng)試驗，確定萃取劑添加量為6.00 mL，吸取5.00 mL上清液，氮吹濃縮至0.25 mL，輔以250 μL 微量尖底襯管，既加快處理速度，又得到較高的濃縮倍數(shù)。

2.3.3 氯化鈉的用量

實驗中分別向2.00 mL 空白血清中加入0、0.3、0.7、1.0、2.0 g 氯化鈉，考察了鹽析效應(yīng)對目標物的提取作用。如表3 所示，隨著氯化鈉添加量的上升，甘氟Ⅰ、甘氟Ⅱ與氟乙酰胺的提取率上升較快，氟乙酸鈉衍生物與毒鼠強上升較小，但都至血清層飽和時最大。因此選擇略超飽和量的1.0 g 氯化鈉添加量。

表3 氯化鈉添加量對5 種滅鼠劑萃取率的影響Table 3 Effect of the sodium chloride amount on the extraction rates of the five rodenticides

2.4 線性關(guān)系與檢出限

向6 支已加入2.00 mL 空白血清的10 mL 離心管中分別添加適量標準溶液，配制0、0.010、0.020、0.050、0.100、0.500、1.00、2.00、5.00、10.0 mg／L的混合標準使用液，按1.2 節(jié)樣品前處理方法處理并進行測定，以各目標物的色譜峰峰高Y 對其質(zhì)量濃度X（mg／L）進行線性回歸。結(jié)果顯示方法線性良好，相關(guān)系數(shù)R2＞0.995；氟乙酰胺的線性范圍為0.02 ～2.0 mg／L，毒鼠強為0.02 ～10 mg／L，其他分析物為0.01 ～1.0 mg／L；檢出限為0.001 ～0.002 mg／L（S／N＝3）（詳見表4）。與文獻［8-12］等報道的方法相比，本文所建立的方法靈敏度更高或相當，加之5 種劇毒滅鼠劑可同時檢測的優(yōu)勢，使得本方法具有更廣泛的適用性。

表4 5 種滅鼠劑的線性方程、相關(guān)系數(shù)（R2）、線性范圍和檢出限Table 4 Regression equations，correlation coefficients （R2），linear ranges and LODs of the five rodenticides

2.5 加標回收率與精密度

取空白血清，分別添加高、中、低3 個水平的標準溶液，靜置2 h 以使目標物與血清基體相互作用至平衡狀態(tài)，然后進行測定，每個水平平行測定6次。如表5 所示，各目標物的回收率介于84.0% 和110.0%之間，相對標準偏差（n ＝6）介于2.9% 和7.5%之間。

表5 5 種滅鼠劑的加標回收率與相對標準偏差（n＝6）Table 5 Recoveries and relative standard deviations of the five rodenticides （n＝6）

3 結(jié)論

本文采用衍生條件簡單、溫和的酰胺化方式衍生血清中的氟乙酸鹽，衍生物與其他目標滅鼠劑一并被乙酸乙酯一次性大劑量萃取，高倍濃縮，采用SIM 模式成功地建立了氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法，實現(xiàn)了準確定性、定量測定5 種劇毒滅鼠劑。方法快速且檢出限較低，作為一種重要的技術(shù)儲備，將應(yīng)用在日后的衛(wèi)生應(yīng)急檢測中。

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