王 莉，張曉凱，張 鵬，王娟娟，吳志慧，林 晨，蔣建偉

（1．廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州511400；2．南陽市第一人民醫(yī)院普外科，河南南陽473000；暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院3．生物化學(xué)教研室，4．微生物與免疫學(xué)教研室，廣東廣州510632）

水飛薊賓通過上調(diào)P15INK4B和P21WAF1／CIP1活化JNK誘導(dǎo)人胰腺癌細(xì)胞G1期阻滯及細(xì)胞凋亡

王 莉1，張曉凱2，3，張 鵬4，王娟娟3，吳志慧3，林 晨4，蔣建偉3

（1．廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州511400；2．南陽市第一人民醫(yī)院普外科，河南南陽473000；暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院3．生物化學(xué)教研室，4．微生物與免疫學(xué)教研室，廣東廣州510632）

目的：探討水飛薊賓對(duì)胰腺癌AsPC－1細(xì)胞的增殖抑制作用及其作用機(jī)制．方法：MTT法和克隆形成抑制實(shí)驗(yàn)觀察水飛薊賓對(duì)人胰腺癌AsPC－1細(xì)胞的增殖抑制作用，碘化丙錠（PI）單染色檢測(cè)細(xì)胞周期改變，Annexin V－FITC／PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平，Western blotting檢測(cè)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)．結(jié)果：不同濃度的水飛薊賓對(duì)胰腺癌AsPC－1細(xì)胞的生長(zhǎng)均有抑制作用，且呈劑量－效應(yīng)和時(shí)間－效應(yīng)關(guān)系（P＜0．05），水飛薊賓作用于AsPC－1細(xì)胞48、72 h的IC50濃度分別為224．20、87．25 μmol／L；克隆形成抑制實(shí)驗(yàn)顯示，隨著水飛薊賓濃度增加，AsPC－1細(xì)胞克隆形成逐漸減少．細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著水飛薊賓濃度的增加，胰腺癌AsPC－1細(xì)胞出現(xiàn)明顯G1期阻滯；水飛薊賓處理組細(xì)胞的周期蛋白CyclinD1、CyclinE2、CyclinA、CyclinB1表達(dá)下降，細(xì)胞周期蛋白激酶CDK4、CDK6表達(dá)不變，細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶抑制蛋白P15INK4B、P21WAF1／CIP1表達(dá)升高，與流式檢測(cè)的結(jié)果相一致．不同濃度水飛薊賓作用48 h后，出現(xiàn)明顯的凋亡細(xì)胞群；同時(shí)發(fā)現(xiàn)Caspase－9、Caspase－3活化降解，Caspase3下游效應(yīng)蛋白PARP出現(xiàn)切割條帶．JNK蛋白表達(dá)增加并磷酸化活化，Bcl－2蛋白家族中抗凋亡蛋白Bcl－2、Bcl－xL、Mcl－1表達(dá)明顯降低，促凋亡蛋白Bax表達(dá)基本不變，BH3－only蛋白Bclxs、Bid、Bim表達(dá)增加．結(jié)論：水飛薊賓明顯抑制胰腺癌細(xì)胞增殖，通過誘導(dǎo)P15INK4B、P21WAF1／CIP1表達(dá)阻滯細(xì)胞周期在G1期，并通過誘導(dǎo)JNK活化激活線粒體細(xì)胞凋亡途徑，進(jìn)而誘導(dǎo)胰腺癌AsPC－1細(xì)胞凋亡．

水飛薊賓；胰腺癌AsPC－1細(xì)胞；細(xì)胞周期；凋亡

胰腺癌，主要發(fā)生在胰外分泌腺的惡性腫瘤，是一種常見的惡性程度很高的消化道腫瘤，位居美國惡性腫瘤死亡原因的第4位，占中國惡性腫瘤死亡原因的第5位，胰腺癌的發(fā)病率和死亡率近些年來在中國呈逐年上升趨勢(shì)［1］．胰腺癌起病隱匿，早期多無特殊臨床表現(xiàn)，目前能夠發(fā)現(xiàn)屬于Ⅰ期的病人的機(jī)會(huì)是非常少．同時(shí)，即使是早期的胰腺癌，診斷時(shí)經(jīng)常已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移．手術(shù)治療仍然是胰腺癌的主要治療方法，但是臨床上確診胰腺癌患者中僅有10%～20%的人能夠行外科手術(shù)治療，胰腺癌切除后的5年生存率不超過10%，而5年生存的患者中50%將在隨后的5年內(nèi)死于復(fù)發(fā)，更早期的切除或更廣泛的切除并不能明顯改變此現(xiàn)狀［2］．無手術(shù)切除機(jī)會(huì)的胰腺癌病人，需要化療或者放療等輔助治療手段延長(zhǎng)生存期．目前胰腺癌的化療通常選用吉西他濱、卡培他濱、愛斯萬、氟尿嘧啶、絲裂霉素、阿霉素、三氧化二砷等藥物聯(lián)合化療，但胰腺癌對(duì)于化療不敏感，療效不佳［2－3］．因此，尋找對(duì)胰腺癌敏感的化療藥物或者提高胰腺癌對(duì)化療藥物敏感性的方法、減輕放化療的毒副作用，對(duì)于目前提高胰腺癌的治療效果，改善預(yù)后具有十分重要的意義．

水飛薊賓（silibinin）是從菊科植物水飛薊中提取的黃酮類化合物．水飛薊已經(jīng)被用于解毒和治療肝臟疾病，被稱為天然的護(hù)肝藥物，在治療肝臟疾病、糖尿病、蕈類中毒、神經(jīng)變性疾病和各種類型的癌癥等疾病中具有潛在的臨床價(jià)值［4－5］．研究發(fā)現(xiàn)，水飛薊賓能抑制許多不同類型的腫瘤細(xì)胞增殖：皮膚癌、乳腺癌、宮頸癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、卵巢癌、腎癌、舌癌、肝癌及白血病等，其主要機(jī)制為：預(yù)防腫瘤發(fā)生，抗炎、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抗遷移和抗血管生成［6－10］．但是對(duì)胰腺癌的研究報(bào)道較少，本實(shí)驗(yàn)以人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，探討水飛薊賓對(duì)胰腺癌細(xì)胞的增殖抑制作用及其作用機(jī)制．

1 材料與方法

1．1 材料

轉(zhuǎn)移性胰腺腺癌細(xì)胞AsPC-1由暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室提供；水飛薊賓標(biāo)準(zhǔn)品購自于四川省維克奇生物科技有限公司；胎牛血清、RPMI 1640干粉培養(yǎng)基、胰蛋白酶和EDTA購自美國Gbico公司；噻唑藍(lán)（3-（4，5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3，5-diphenytetrazoliumromide，MTT）、二甲基亞砜（dimethylsulphoxide，DMSO）、膜連蛋白－異硫氫酸熒光素（AnnexinV-FITC）、碘化丙錠（propidium iodide，PI）購自于美國Sigma公司；CyclinD1、CyclinE2、CyclinA、CyclinB2、CDK4、CDK6、P15、P21、Bax、Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1、Bid、Bim、Caspase-9、Caspase-3、PARP、GAPDH一抗均購于美國Cell Signaling Technology公司．電化學(xué)發(fā)光液（electrochemiluminescence，ECL）購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司．

1．2 方法

（1）細(xì)胞培養(yǎng) 人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞加入含體積分?jǐn)?shù)為5%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁達(dá)到70%時(shí)，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0．25%胰蛋白酶與0．01%EDTA的細(xì)胞消化液消化傳代．

（2）細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期AsPC-1細(xì)胞和L02細(xì)胞，用含有體積分?jǐn)?shù)為5%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞密度5．0×104／mL，接種到96孔板，每孔100 μL，即每孔5 000個(gè)細(xì)胞．培養(yǎng)24 h后，分別加入濃度為25、50、100、200、300、400和500 μmol／L的水飛薊賓，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)不加藥物的細(xì)胞對(duì)照組和溶劑對(duì)照組，置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24、48和72 h時(shí)，每孔加入質(zhì)量濃度5 mg／mL的MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于波長(zhǎng)570 nm處（參考波長(zhǎng)為600 nm）測(cè)定各孔吸光度（A）值，并計(jì)算各組抑制率，抑制率（%）＝（1－A實(shí)驗(yàn)組／A對(duì)照組）×100%．

（3）克隆形成抑制實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Aspc-1細(xì)胞，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞懸液為300個(gè)／孔接種于12孔培養(yǎng)板，每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔，水飛薊賓終濃度為0、12．5、25、50 μmol／L，置37℃，體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，吸去培養(yǎng)液，PBS洗滌兩次后，V甲醇∶V冰醋酸＝3∶1固定液固定10 min，結(jié)晶紫染色20 min后流水沖洗，照相．

（4）碘化丙錠（propidine iodide，PI）單染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期胰腺癌AsPC-1細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞3．0×105／mL，接種于6孔板．培養(yǎng)24 h之后分別加入濃度為50、100和200 μmol／L的水飛薊賓，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照組和DMSO溶劑對(duì)照組，終體積2 mL．繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，消化收集細(xì)胞，1 000 r／min離心5 min，棄去上清．預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞，離心、洗滌2次，用體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇4℃固定過夜．上機(jī)前用預(yù)冷的PBS洗滌3次后，加入PI染色液（含RNA酶），終質(zhì)量濃度500 g／L，避光染色30 min，用300目尼龍網(wǎng)過濾后，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞DNA含量的變化，每個(gè)樣本分析104個(gè)細(xì)胞．

（5）Annexin V-FITC／PI雙染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期胰腺癌AsPC-1細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞3．0×105／mL，接種于6孔板．培養(yǎng)24 h后分別加入濃度為50、100和200 μmol／L的水飛薊賓，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照組和DMSO溶劑對(duì)照組，終體積2 mL．培養(yǎng)48 h后，消化收集細(xì)胞，1 000 r／min離心5 min，棄去上清．PBS重懸細(xì)胞，離心、洗滌2次，以染色緩沖液重懸，分別加入10 μL Annexin VFITC和5 μL PI，輕輕混勻，室溫避光反應(yīng)15 min．加入200 μL染色緩沖液，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，并分析早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的百分率，每個(gè)樣本分析104個(gè)細(xì)胞．

（6）免疫印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)的變化 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期AsPC-1細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞3．0×105／mL，接種于6孔板．培養(yǎng)24 h后，分別加入濃度為50、100、150和200 μmol／L的水飛薊賓，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照組和DMSO溶劑對(duì)照組，終體積2 mL．培養(yǎng)48 h后，收集懸浮及貼壁的細(xì)胞，1 000 r／min離心5 min，用PBS洗2次，吸盡PBS；細(xì)胞裂解液于冰上裂解30 min，12 000 r／min離心15 min，收集上清液．經(jīng)BCA法測(cè)蛋白濃度后，以上樣30 μg為基準(zhǔn)，計(jì)算出上樣體積．樣品蛋白置于1×SDS凝膠加樣緩沖液中，95℃5 min；電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%脫脂奶粉封閉后，一抗孵育過夜，再以辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，ECL發(fā)光液孵育后，在凝膠成像系統(tǒng)中拍照．

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果均3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)采用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）（±s）表示，P＜0．05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異．

2 結(jié)果

2．1 水飛薊賓對(duì)人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞對(duì)照組（0濃度組）和DMSO組相比，差異無顯著性（P＞0．05）．不同濃度的水飛薊賓分別作用于人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞24、48、72 h后，高濃度組出現(xiàn)明顯的增殖抑制作用，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），水飛薊賓作用于AsPC-1細(xì)胞在48和72 h的IC50分別為224．20、87．25 μmol／L．隨著水飛薊賓藥物濃度的增加以及作用時(shí)間的增加，AsPC-1細(xì)胞增殖抑制現(xiàn)象越來越明顯，表明水飛薊賓以劑量依賴和時(shí)間依賴的方式抑制細(xì)胞增殖（圖1）．

圖1 不同濃度的水飛薊賓對(duì)胰腺癌AsPC-1細(xì)胞的增殖抑制作用Fig．1 Proliferation inhibition of pancreatic cancer AsPC-1 cells by Silibinin of different concentration

2．2 水飛薊賓對(duì)人胰腺癌Aspc-1細(xì)胞克隆形成的影響

水飛薊賓作用于胰腺癌AsPC-1細(xì)胞7 d，隨著水飛薊賓藥物濃度的增加，低濃度組（12．5 μmol／L）出現(xiàn)細(xì)胞克隆較對(duì)照組增多，具有促增殖作用，與MTT法的結(jié)果相一致．高濃度組（50 μmol／L）與DMSO對(duì)照組比較，細(xì)胞克隆明顯減少（圖2）．

圖2 不同濃度的水飛薊賓對(duì)胰腺癌AsPC-1細(xì)胞的克隆形成抑制作用Fig．2 Clone formation inhibition of pancreatic cancer AsPC-1 cells by silibinin of different concentration

2．3 PI單染色檢測(cè)胰腺癌AsPC-1細(xì)胞周期改變

流式細(xì)胞術(shù)PI單染色分析顯示：不同濃度的水飛薊賓作用于胰腺癌AsPC-1細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組相比，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞G1期DNA的含量明顯增加，S期和G2期百分比減少，表明細(xì)胞周期阻滯于G1期（圖3）．

2．4 Western blot檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)

水飛薊賓作用于人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞48 h后，免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與G1期相關(guān)的細(xì)胞周期蛋白Cyclin D的表達(dá)明顯減少，與G1晚期、S期、G2期相關(guān)的細(xì)胞周期蛋白Cyclin E2、Cyclin A、Cyclin B1的表達(dá)均減少，細(xì)胞周期蛋白激酶CDK4和CDK 6的表達(dá)變化不明顯，與G1期相關(guān)的負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白P15INK4B和P21WAF1／CIP1的表達(dá)則明顯增加，表明細(xì)胞周期被阻滯于G1期，與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的結(jié)果一致（圖4）．

2．5 Annexin V-FITC／PI雙染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡

水飛薊賓作用于胰腺癌AsPC-1細(xì)胞48 h后，利用Annexin V-FITC／PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，左下限（LL）為正常細(xì)胞群，右下限（LR）為早期凋亡細(xì)胞群，左上限（LU）為自噬性死亡和非特異性死亡細(xì)胞群，右上限（UR）為晚期凋亡細(xì)胞，與DMSO對(duì)照組相比，加藥處理組細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡率隨藥物濃度的增加而增多，200 μmol／L的水飛薊賓作用胰腺癌AsPC-1細(xì)胞48 h后，細(xì)胞凋亡率為29．44%（圖5）．

圖3 水飛薊賓對(duì)AsPC-1細(xì)胞細(xì)胞周期的影響Fig．3 Effect of silibinin on cell cycle distribution of AsPC-1 cells

圖4 Western blotting檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)水平Fig．4 The expression of cell cycle associate proteins analyzed by Western blotting

2．6 Western blotting檢測(cè)Caspase-9、Caspase-3和PARP的表達(dá)

水飛薊賓作用于胰腺癌AsPC-1細(xì)胞48 h后，Caspase-9、Caspase-3蛋白表達(dá)減少，PARP蛋白也減少，且出現(xiàn)了切割條帶，提示發(fā)生細(xì)胞凋亡（圖6）．

2．7 Western blotting檢測(cè)SAPK／JNK通路蛋白的表達(dá)

免疫印跡法檢測(cè)SAPK／JNK通路蛋白JNK和P-JNK．不同濃度的水飛薊賓作用于人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞后，磷酸化JNK表達(dá)增加，提示JNK通路的活化（圖7）．

2．8 Western blotting檢測(cè)Bcl-2家族蛋白表達(dá)

水飛薊賓處理后的細(xì)胞，Bcl-2家族中的抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1、Bcl-xL的表達(dá)均減少，BH3-only蛋白家族成員Bcl-xs、Bid、Bim表達(dá)明顯增加，促凋亡蛋白Bax的表達(dá)未見明顯變化．Bcl-2／Bax、Mcl-1／Bax、Bcl-xL／Bax比值下降，表明激活線粒體凋亡途徑（圖8）．

圖5 不同濃度水飛薊賓對(duì)AsPC-1細(xì)胞凋亡的影響Fig．5 Effect of Silibinin on the induction of apoptosis in AsPC-1 cells

圖6 Western blotting檢測(cè)Caspase-9、Caspase-3和PARP的表達(dá)水平Fig．6 The expression of Caspase-9，Caspase-3 and PARP analyzed by Western blotting

圖7 Western blotting檢測(cè)JNK和P-JNK的表達(dá)水平Fig．7 The expression of JNK and P-JNK analyzed by westernblotting

圖8 Western blotting檢測(cè)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)水平Fig．8 The expression of Bcl-2 family analyzed by Western blotting

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，水飛薊賓對(duì)多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)均具有抑制作用，包括皮膚癌、乳腺癌、宮頸癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、卵巢癌、腎癌、舌癌、肝癌和白血病等［6－10］．最近有研究報(bào)道，水飛薊賓抑制胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，但對(duì)作用機(jī)制研究較少［11－12］．本研究采用MTT法證實(shí)，水飛薊賓對(duì)人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞具有顯著的增殖抑制作用，且呈時(shí)間和濃度依賴關(guān)系，水飛薊賓作用于胰腺癌AsPC-1細(xì)胞48、72 h的IC50濃度分別為224．20、87．25 μmol／L；同時(shí)，隨著水飛薊賓作用濃度增加，AsPC-1細(xì)胞克隆形成逐漸減少．

細(xì)胞通過多種周期相關(guān)蛋白調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)展，保證細(xì)胞周期的順利交替．細(xì)胞周期相關(guān)蛋白有細(xì)胞周期蛋白（Cyclins）和細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶（cyclin-dependent kinases，CDKs）、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制因子（cyclin-dependent kinase inhibitors，CKIs），其中Cyclins、CDKs對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)展起正調(diào)控作用，CKIs起負(fù)性調(diào)控作用，如CDK 4、CDK 6和CDK 2與Cyclin D、Cyclin E的復(fù)合體激活能直接促進(jìn)G1／S轉(zhuǎn)折，同時(shí)CKIs家族中的P15、P16、P18與P19可以特異性抑制CDK4或CDK6的活性，而P21與P27可以廣泛地抑制CDKs-Cyclins復(fù)合物的活性．在本實(shí)驗(yàn)中，水飛薊賓處理胰腺癌AsPC-1細(xì)胞48 h后，細(xì)胞周期被阻滯于G1期，進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與G1／S檢驗(yàn)點(diǎn)調(diào)控有關(guān)的Cyclin D1與Cyclin E2的表達(dá)減少，細(xì)胞周期蛋白激酶CDK4和CDK 6的表達(dá)變化不明顯，與G1期相關(guān)的負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白P15INK4B和P21WAF1／CIP1的表達(dá)則明顯增加，Cyclin D1／CDK4、Cyclin D1／CDK6活性抑制，胰腺癌細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯，與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果一致．

目前研究發(fā)現(xiàn)有3條細(xì)胞凋亡途徑，即死亡受體相關(guān)途徑、線粒體凋亡途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的細(xì)胞凋亡途徑，最終都引起Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活．Caspase家族屬于半胱氨酸蛋白酶，其中Caspase-9是線粒體細(xì)胞凋亡途徑的1個(gè)蛋白，線粒體凋亡途徑活化將導(dǎo)致Caspase-9的酶切活化，切割下游Caspase-3，進(jìn)而切割聚ADP-核糖多聚酶（PARP）．Caspase-3和PARP的降解，是細(xì)胞凋亡的分子標(biāo)志．本實(shí)驗(yàn)中，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表明，水飛薊賓處理AsPC-1細(xì)胞后，細(xì)胞發(fā)生了凋亡，并導(dǎo)致Caspase-9、Caspase-3與PARP蛋白酶切活化，提示水飛薊賓通過誘導(dǎo)線粒體凋亡途徑促進(jìn)胰腺癌AsPC-1細(xì)胞凋亡．

SAPK／JNK信號(hào)通路對(duì)凋亡具有調(diào)控作用，JNK的磷酸化活化，促進(jìn)Bcl-2、Bcl-xL的磷酸化，導(dǎo)致Bax／Bcl-2、Bax／Bcl-xL異二聚體解離，促進(jìn)Bax寡聚化，促進(jìn)線粒體凋亡途徑的發(fā)生［13－14］．本研究結(jié)果提示水飛薊賓作用于AsPC-1細(xì)胞，JNK的表達(dá)增加，且JNK磷酸化水平增加，與Duan的報(bào)道相一致［15］，表明水飛薊賓作用于胰腺癌細(xì)胞后，激活了JNK信號(hào)通路，并進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡．

線粒體凋亡途徑與Bcl-2蛋白家族表達(dá)和活化相關(guān)．Bcl-2蛋白家族分Bcl-2抗凋亡蛋白家族和促凋亡蛋白家族．抗凋亡蛋白家族成員有Bcl-2、BclxL、Mcl-1、A1／BFL-1、Bcl-w、Boo／DIVA與NR-13等；促凋亡的Bcl-2家族蛋白根據(jù)BH結(jié)構(gòu)域的數(shù)量分為兩個(gè)亞家族，包含3個(gè)BH結(jié)構(gòu)域（BH1-3）的Bax、Bak和Bok，以及只含有BH3結(jié)構(gòu)域的BH-3 only蛋白包括Bid、Bad、Bcl-xs、Bik／NBK、BLK、HRK、Bim、BNIP3、NIX與NOXA等［16］．Bcl-2蛋白家族成員調(diào)控著線粒體細(xì)胞凋亡途徑［17－19］．本實(shí)驗(yàn)中，水飛薊賓處理AsPC-1細(xì)胞后，隨著水飛薊賓作用濃度的增加，抗凋亡蛋白Bcl-2，Mcl-1和Bcl-xL的表達(dá)下降或被降解，而BH3-only蛋白Bid，Bim和Bcl-xs的表達(dá)則逐步增加，且呈濃度依賴性，促凋亡蛋白Bax表達(dá)不變．BH3-only蛋白Bid，Bim和Bclxs可通過與Bcl-2，Mcl-1和Bcl-xL等形成異二聚體，促進(jìn)Bcl-2／Bax、Mcl-1／Bax、Bcl-xL／Bax異二聚體的解離，促進(jìn)Bax的游離和寡聚化，促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素C，促進(jìn)線粒體凋亡途徑發(fā)生．同時(shí)抗凋亡蛋白Bcl-2，Mcl-1和Bcl-xL的蛋白水平下降，Bax／Bcl-2、Bax／Mcl-1、Bax／Bcl-xL比值增高，促進(jìn)Bax的游離，促進(jìn)線粒體凋亡途徑的發(fā)生．

綜上所述，水飛薊賓明顯抑制胰腺癌細(xì)胞增殖，通過誘導(dǎo)P15INK4B、P21WAF1／CIP1表達(dá)阻滯細(xì)胞周期在G1期，并誘導(dǎo)JNK活化激活線粒體細(xì)胞凋亡途徑，進(jìn)而誘導(dǎo)胰腺癌AsPC-1細(xì)胞凋亡．JNK的活化可轉(zhuǎn)錄激活p53，p53的活化可轉(zhuǎn)錄激活p21，水飛薊賓誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞周期阻滯是否存在此代謝通路的活化還有待進(jìn)一步證明，水飛薊賓活化JNK后是否促進(jìn)Bcl-2與Bax，Bcl-xL與Bax的解離，進(jìn)而促進(jìn)Bax的寡聚化，另外，水飛薊賓在整體水平如何抑制胰腺癌腫瘤生長(zhǎng)還有待進(jìn)一步證明．

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［責(zé)任編輯：朱穎嫄］

Silibinin trigged G1 arrest and apoptosis of human pancreatic cancer cells via upregulating P15INK4B，P21WAF1／CIP1and activating JNK

WANG Li1，ZHANG Xiaokai2，3，ZHANG Peng4，WANG Juanjuan3，WU Zhihui3，LIN Chen4，JIANG Jianwei3
（1．Department of Laboratory，Panyu Center Hospital，Guangzhou 511440，China；2．Department of General Surgery，the First Hospital of Nanyang，Henan 473000，China；3．Department of Biochemistry，4．Department of Microbiology and Immunology，Medical College，Jinan University，Guangzhou 510632，China）

Aim：To investigate the inhibitory effects of Silibinin on pancreatic cancer AsPC-1 cells and the possible mechanism．Methods：MTT and cell clone formation inhibitory assay were used to in-vestigate the inhibitory effects of Silibinin on human pancreatic cancer AsPC-1 cells．Cell cycle distribution and cell apoptosis were determined by flow cytometry staining with propidium iodide（PI）or AnnexinⅤ-FITC and PI respectively．The expressions of cell cycle and apoptosis related proteins were analyzed by Western blotting．Results：MTT results showed that Silibinin inhibited pancreatic cancer AsPC-1 cells′proliferation in dose and time-dependent manner（P＜0．05）．The IC50of Silibinin against pancreatic cancer AsPC-1 cells for 48 hours and 72 hours was 224．20 μmol／L and 87．25 μmol／L，respectively．Cell colony formation inhibition assay showed that the number of cell clones were decreased with the increasing of Silibinin′s concentration．PI staining analysis showed that cell cycle was arrested at G1 phase．Western blotting assay showed that the levels of Cyclins（D1，E2，A，B1）decreased，without changes in cyclin-dependent kinases（CDK4 and CDK6），but cyclin-dependent kinase inhibitors（P15INK4B，P21WAF1／CIP1）increased，which was in consistence with the results of flow cytometric analysis．Annexin VFITC／PI staining analysis also showed a dose-dependent effect on apoptotic cells when the pancreatic cancer cells were incubated with Silibinin for 48 hrs．Caspase-9，Caspase-3 were cleaved，and the cleaved bands of PARP were detected．The expression of JNK and phospho-JNK were found to be increased，while the anti-apoptotic proteins of Bcl-2，Bcl-xL and Mcl-1 were decreased，and pro-apoptotic proteins Bax was not changed．The BH-3 only proteins，Bcl-xs，Bid and Bim，were found to be increased by Western blotting．Conclusion：Silibinin inhibits proliferation of pancreatic cancer AsPC-1 cells，induces G1 phase arrest via upregulating P15INK4Band P21WAF1／CIP1，and induces cell apoptosis through the mitochondrial pathway with activation of JNK．

Silibinin；pancreatic cancer AsPC-1 cells；cell cycle distribution；apoptosis

R329．24，329．25

A

1000－9965（2015）01－0021－08

10．11778／j．jdxb．2015．01．004

2014－06－16

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011B031800012）；廣東省醫(yī)學(xué)基金項(xiàng)目（A2013338）

王 莉（1969－），女，主任技師，碩士，研究方向：免疫學(xué)，腫瘤分子生物學(xué)

蔣建偉（1966－），男，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，Tel：020－85220256；E-mail：jjw703＠163．com