◎高延偉

（延安市食品質(zhì)量安全檢驗檢測中心，陜西 延安 716000）

黃曲霉毒素（AFT）是一種毒性極強的劇毒物 質(zhì)，被世衛(wèi)組織癌癥研究機構(gòu)劃定為1類致癌物，在20余種黃曲霉毒素中尤以黃曲霉毒素B1（AFB1）最為危險。AFB1主要污染花生和玉米等糧谷食品，目前檢測方法主要為酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）以及高效液相色譜法（HPLC）。ELISA法操作簡便快捷，但重復性較差，且易出現(xiàn)假陰性結(jié)果；HPLC法定量準確，重復性較好，但進樣前需衍生，前處理相對復雜。本文分別采用ELISA和HPLC法檢測當?shù)丶Z谷食品中AFB1，并對檢測結(jié)果進行比較，比較這兩種檢測方法各自的優(yōu)缺點。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈、甲醇，色譜純；氯化鈉、冰乙酸、三氟乙酸，分析純。

AFB1標準品，含量99.0%，美國RomerLabs公司。

ELISA試劑盒，美國Helica公司，配套相應的反應試劑。

MycoSepTM228 MFC多功能凈化柱，美國RomerLabs公司。

實驗用水均為美國Milli-Q實驗室超純水系統(tǒng)制備，滿足GB/T6682-2008《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》中一級水要求。

1.2 儀器與設備

LC-20A高效液相色譜儀，附熒光檢測器，日本島津公司。

Bio-Rad 1000 PCR儀，美國Bio-Rad公司。

1.3 方 法

1.3.1 ELISA方法

稱取20.0 g充分粉碎的樣品于250 mL具塞錐形瓶中，加入100 mL甲醇-水（70+30）溶液后振搖30 min，經(jīng)微纖維濾紙過濾過濾，收集濾液。

從恒溫箱中取出ELISA試劑盒，室溫下平衡30 min；加入200 μL酶標記物和100 μL標準品及待測樣品提取液于稀釋微孔中，吹吸混勻；轉(zhuǎn)移100 μL稀釋液至包被抗體的微孔中，室溫下孵育15 min；吸取250 μL蒸餾水洗板三次后，加入100 μL發(fā)色劑，充分混勻后暗處孵育5 min；加入100 μL停止液，在450 nm處測量吸光度值。

1.3.2 HPLC方法

稱取25.0 g充分粉碎的樣品于250 mL具塞錐形瓶中，加入125 mL乙腈-水（84+16）溶液和5 g氯化鈉，振蕩30 min，經(jīng)微纖維濾紙過濾，收集濾液。

移取6 mL濾液經(jīng)MFC多功能凈化柱凈化后取1 mL凈化液60 ℃下氮氣吹干，加入500 μL衍生劑，密封混勻30 s，65 ℃衍生8 min。將衍生后的溶液在60 ℃下氮吹至干，加入200 μL乙腈-水（17+83）溶液溶解，漩渦混勻30 s，3000 r/min離心15 min，取上清液供HPLC分析。

HPLC測定條件：色譜柱：SHISEIDO C18，3.0 mm×150 mm，5 μm；柱溫30 ℃；流動相：乙腈-水（17+83），0.8 mL/min；進樣量：25 μL；熒光檢測器：激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長440 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 回收率及重現(xiàn)性

取未檢出AFB1的陰性樣品為空白對照，分別加入三個水平的標準溶液，按照1.3方法分別采用ELISA和HPLC法進行檢驗并計算回收率；同時對各加標水平進行6次平行試驗，計算重現(xiàn)性，結(jié)果見表1。

由表1可以看出HPLC較ELISA法回收率略高，重現(xiàn)性較好，檢測結(jié)果更加穩(wěn)定，說明對于樣品定量分析，HPLC法檢測結(jié)果更為可靠。

2.2 ELISA與HPLC法檢驗結(jié)果比較

分別用ELISA和HPLC法檢測20份樣品中AFB1含量并計算相對偏差，結(jié)果見表2。

表1 回收率及重現(xiàn)驗結(jié)果

表2 樣品檢測結(jié)果

由表2可以看出，ELISA和HPLC法檢測結(jié)果差異不大，但ELISA法易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

2.3 ELISA與HPLC法前處理時間比較

以處理12個樣品為例，分別記錄兩種檢測方法所需時間。ELISA法提取樣品30 min，孵育15 min，洗板3 min，顯色5 min，酶標儀測定2 min，整個檢測過程約55 min，平均耗時約4.58 min/樣；HPLC法樣品提取30 min，凈化0.5 min，衍生8 min，兩次氮氣吹干約30 min，HPLC檢測15 min/樣，整個過程約249 min，平均耗時20.75 min/樣。由此可知，ELISA較HPLC法更加方便快捷，適用于大批量樣品的初篩。

3 結(jié)論

本文將ELISA和HPLC法比較后發(fā)現(xiàn)ELISA法快速、便捷，HPLC法重復性性好，定量準確。在日常檢測工作中，兩種檢測方法可結(jié)合使用，可根據(jù)樣品量等選擇檢驗方法，當樣品量較大時可先用ELISA法初篩，篩選出AFB1結(jié)果可疑的樣品再用HPLC法確認。

[1]陳新,王雄,雷達.免疫親和-光化學柱后衍生高效液相色譜熒光法測定花生粕中黃曲霉毒素的研究[J].中國飼料,2007(24):30-31,34.

[2]龔燕,趙春城,張東升,等.ELISA法檢測五類食品中黃曲霉毒素B1前處理方法的改進研究[J].食品工業(yè)科技,2003(4):82-84.

[3]費得利,烏帕曼,王宏,等.免疫親和層析凈化高效液相色譜法與酶聯(lián)免疫分析法試劑盒檢測花生及玉米中黃曲霉毒素[A]//北京食品學會、北京食品協(xié)會.2010年第三屆國際食品安全高峰論壇論文集[C].2010.

[4]李軍,于一茫,田苗,等.免疫親和柱凈化-柱后光化學衍生-高效液相色譜法同時檢測糧谷中的黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A[J].色譜,2006(6):581-584.