徐石蘭 岑秀芬 韋鵬霄李 彬 黃家達(dá) 李祖潭

（廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南寧 530004）

野生毛葡萄是葡萄科葡萄屬真葡萄亞屬東亞種群的一個(gè)種，原產(chǎn)于中國(guó)。野生毛葡萄是廣西原產(chǎn)的野生葡萄資源中分布最廣、種類(lèi)最多的一種［1］。我國(guó)野生葡萄分布有38種，占世界總葡萄種的60%，是野生葡萄資源最為豐富的國(guó)家［2］。孫馬等人對(duì)中國(guó)野生葡萄18個(gè)種和64個(gè)株系的染色體進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)中國(guó)野生葡萄全部為二倍體（2n＝38）［3］。野生葡萄營(yíng)養(yǎng)豐富，至少含有17種氨基酸，其中7種為人體必需的氨基酸，總糖含量、氨基酸含量、VB2含量、K含量較高［4］，還含有豐富的花色素雙糖苷、超氧化歧化酶及白藜蘆醇等物質(zhì)，具有軟化血管、抗衰老、防癌的作用［4］。用野生葡萄釀造的野生葡萄酒，營(yíng)養(yǎng)豐富，抗氧化活性和抗菌性高［5］。近些年來(lái)，國(guó)內(nèi)有研究人員對(duì)野生葡萄的莖段、葉片、葉柄及單芽莖段等進(jìn)行了離體培養(yǎng)研究［6］。劉偉對(duì)貴州成熟的毛葡萄種子用10%濃硫酸浸泡10min，萌芽率達(dá)100%［7］。到目前為止，還沒(méi)有報(bào)道對(duì)野生毛葡萄種子進(jìn)行單因子和多因子的滅菌處理以及用不同的方法處理野生毛葡萄種子探究萌芽特性。所以，本試驗(yàn)對(duì)廣西柳城縣野生毛葡萄種子的單因子和多因子的滅菌研究以及用不同方法處理野生毛葡萄種子探究萌芽特性，對(duì)野生毛葡萄離體繁殖和建立再生體系，對(duì)野生材料的大量繁殖、離體保存提高材料和技術(shù)支撐，為野生毛葡萄的遺傳轉(zhuǎn)化奠定理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料

試驗(yàn)材料為廣西柳城縣的野生毛葡萄種子，在2014年8月份葡萄成熟時(shí)采摘得到種子。

1．2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1．2．1 0．1%升汞不同滅菌時(shí)間的比較試驗(yàn) 本試驗(yàn)通過(guò)同一濃度（0．1%）的升汞對(duì)野生毛葡萄種子處理不同的時(shí)間來(lái)測(cè)定滅菌時(shí)間對(duì)野生毛葡萄種子滅菌效果和發(fā)芽率的影響。滅菌時(shí)間依次為10min、12min、14min、16min、18min共5個(gè)處理。

1．2．2 兩種滅菌劑不同組合的比較試驗(yàn) 為了比較75%酒精和0．1%升汞的組合對(duì)野生毛葡萄種子滅菌效果和發(fā)芽率的影響，設(shè)計(jì)4個(gè)處理組，即先用75%酒精分別處理10s、20s、30s、40s，然后再用0．1%升汞處理16min。

1．2．3 三種滅菌劑不同組合的比較試驗(yàn) 為了比較75%酒精、不同濃度的升汞和次氯酸鈉的不同組合對(duì)野生毛葡萄種子滅菌效果和發(fā)芽率的影響，設(shè)計(jì)4個(gè)處理：（1）75%酒精30s＋0．1%升汞16min＋0．12%升汞5min；（2）75%酒精 30s＋0．1%升汞 16min＋0．15%升汞 5min；（3）75%酒精 30s＋0．1%升汞 16min＋12%次氯酸鈉 5min；（4）75%酒精30s＋0．1%升汞 16min＋15%次氯酸鈉5min。

1．2．4 不同預(yù)處理方法的比較試驗(yàn) 為了比較溫水、赤霉素預(yù)處理對(duì)野生毛葡萄種子污染率和發(fā)芽率的影響，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：首先把野生毛葡萄種子放在冰箱在－4℃的低溫條件下保存40d，然后進(jìn)行3組處理，即（1）低溫處理后不做任何處理；（2）低溫處理后把種子置于40℃的無(wú)菌水中浸2h；（3）低溫處理后把種子置于GA3 0．5mg/L（40℃）溶液中浸 2h。

以上各組試驗(yàn)的每個(gè)處理均接種野生毛葡萄種子60粒，設(shè)三次重復(fù)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS＋6－BA1．0mg/L＋GA3 0．3mg/L＋蔗糖30g/L＋瓊脂6g/L。培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度25±1℃，光照強(qiáng)度1500LX，光照時(shí)間12h/d。對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS方差分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果和分析

2．1 0．1%升汞不同滅菌時(shí)間對(duì)野生毛葡萄種子滅菌效果和發(fā)芽率的影響

表1 0.1%升汞不同滅菌時(shí)間對(duì)野生毛葡萄種子滅菌效果和發(fā)芽率的影響

以0．1%升汞作單一滅菌劑，分別進(jìn)行不同滅菌時(shí)間的對(duì)此試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，0．1%升汞對(duì)野生毛葡萄種子的滅菌時(shí)間不同，滅菌效果不同，發(fā)芽率也不同。不同處理之間對(duì)種子的滅菌效果和發(fā)芽率的差異達(dá)到極顯著水平。滅菌時(shí)間越長(zhǎng)，種子的污染率越低。在0．1%升汞滅菌10－16min的時(shí)間范圍內(nèi)，種子污染率逐步降低，而種子的發(fā)芽率逐漸提高。從5個(gè)滅菌時(shí)間處理中，雖然18min處理的污染率最低，但發(fā)芽率也開(kāi)始降低；16min處理的污染率雖不是最低，但是發(fā)芽率比其他幾個(gè)處理都高，達(dá)到35%。綜合滅菌效果和發(fā)芽率比較，以0．1%升汞滅菌16min的時(shí)間處理最佳。但是用升汞作單一滅菌劑，污染率仍較高，發(fā)芽率也較低，無(wú)法滿足需要。

2．2 兩種滅菌劑不同組合對(duì)野生毛葡萄種子滅菌效果和發(fā)芽率的影響

以0．1%升汞16min與75%酒精不同滅菌時(shí)間組合進(jìn)行比較，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 兩種滅菌劑不同組合對(duì)野生毛葡萄種子滅菌效果和發(fā)芽率的影響

由表2可知，0．1%升汞16min和75%酒精不同滅菌時(shí)間組合，對(duì)野生毛葡萄種子滅菌效果和發(fā)芽率的影響不同。不同處理之間對(duì)種子的滅菌效果的差異達(dá)到極顯著差異水平，對(duì)發(fā)芽率的差異達(dá)到顯著水平。隨著75%酒精滅菌時(shí)間的增加，滅菌效果越好，種子的污染率越低。75%酒精滅菌時(shí)間從10－30s范圍中，發(fā)芽率逐漸提高，但是到了滅菌時(shí)間40s，種子的發(fā)芽率反而下降。所以，綜合比較試驗(yàn)結(jié)果，以75%酒精＋0．1%升汞16min兩種滅菌劑組合表現(xiàn)最佳，野生毛葡萄種子的污染率為36%，發(fā)芽率為48．33%。

2．3 三種滅菌劑不同組合對(duì)野生毛葡萄種子滅菌效果和發(fā)芽率的影響

以75%酒精30s＋0．1%升汞16min與不同濃度的升汞或者次氯酸鈉的組合進(jìn)行比較試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3：

表3 三種滅菌劑組合對(duì)野生毛葡萄種子滅菌效果和發(fā)芽率的影響

由表3可知，以75%酒精＋0．1%升汞16min與不同濃度的升汞或次氯酸鈉的組合不同，滅菌效果和發(fā)芽率也不同。不同處理之間對(duì)種子滅菌效果的差異達(dá)顯著水平，對(duì)發(fā)芽率的差異達(dá)極顯著水平。在75%酒精30s＋升汞16min前提下，在相同的5min滅菌時(shí)間處理時(shí)，0．12%升汞發(fā)芽率比0．15%升汞高，但是0．15%升汞的滅菌效果比0．12%升汞的滅菌效果好。在75%酒精30s＋0．1%升汞前提下，在相同的5min滅菌處理時(shí)，15%次氯酸鈉比12%次氯酸鈉的滅菌效果和發(fā)芽率都好，污染率為16．67%，發(fā)芽率為61．67%。綜合試驗(yàn)比較結(jié)果，以75%酒精＋0．1%升汞16min＋15%次氯酸鈉5min的三種滅菌劑組合效果最佳，野生毛葡萄種子的污染率為 16．67%，發(fā)芽率為 61．67%。

2．4 野生毛葡萄種子不同預(yù)處理對(duì)污染率和發(fā)芽率的效應(yīng)

以常溫（20℃）無(wú)菌水作為對(duì)照，進(jìn)行40℃無(wú)菌水和GA3 0．5mg/L（40℃）無(wú)菌溶液進(jìn)行浸種試驗(yàn)，比較不同處理對(duì)種子發(fā)芽率的影響，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)4。

由表4可知，對(duì)野生毛葡萄種子的預(yù)處理不同，種子的發(fā)芽率也不同。三個(gè)處理之間對(duì)野生毛葡萄種子發(fā)芽率的差異達(dá)到極顯著水平。40℃無(wú)菌水浸種2h的發(fā)芽率比常溫（20℃）無(wú)菌水浸種2h的發(fā)芽率高，達(dá)到66．67%；GA3 0．5mg/L（40℃）無(wú)菌溶液浸種2h的發(fā)芽率比40℃無(wú)菌水浸種2h發(fā)芽率高，達(dá)到73．33%。綜合比較試驗(yàn)結(jié)果，以－4℃冰箱保存40d＋GA3 0．5mg/L（40℃）無(wú)菌溶液浸種2h為最佳野生毛葡萄種子的預(yù)處理方法。

表4 不同預(yù)處理對(duì)野生毛葡萄種子污染率和發(fā)芽率的效應(yīng)

3 結(jié)果與討論

升汞、75%酒精、次氯酸鈉是組織培養(yǎng)中進(jìn)行外植體消毒時(shí)常用的消毒劑。升汞中水解出來(lái)的Hg2＋離子可與帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合，使細(xì)菌蛋白變性，酶失活，達(dá)到消毒目的。75%酒精有很強(qiáng)的滲透力，能穿過(guò)細(xì)菌表面的膜，進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部，使構(gòu)成細(xì)菌生命基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)凝固，將細(xì)菌殺死。次氯酸鈉是強(qiáng)氧化劑，利用其強(qiáng)氧化性能殺死病菌。

試驗(yàn)結(jié)果表明，在單一滅菌劑0．1%升汞的滅菌時(shí)間達(dá)到18min時(shí)，滅菌效果雖然最好，但是種子的發(fā)芽率卻降低。根據(jù)升汞的滅菌原理可知，在滅菌時(shí)間延長(zhǎng)時(shí)，Hg2＋與細(xì)菌蛋白質(zhì)結(jié)合會(huì)更加徹底，滅菌效果就會(huì)更好，但是Hg2＋與種胚中蛋白質(zhì)的結(jié)合機(jī)率也會(huì)加大，從而導(dǎo)致種胚失去活性，發(fā)芽率降低。因此，單一滅菌劑0．1%升汞對(duì)野生毛葡萄種子的適宜滅菌時(shí)間為16min。

在兩種滅菌劑組合的75%酒精滅菌時(shí)間達(dá)到40s，雖然滅菌效果提升，但野生毛葡萄種子的發(fā)芽率卻從滅菌30s時(shí)的48．33%下降到41．67%。由此可知，隨著75%酒精滅菌時(shí)間越長(zhǎng)，酒精對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜的穿透力和對(duì)種胚的穿透力就會(huì)增強(qiáng)，對(duì)細(xì)菌和種胚的破壞性就會(huì)增強(qiáng)。因此，在野生毛葡萄種子的滅菌處理中，0．1%升汞16min組合的75%酒精的適宜處理時(shí)間為30s。

野生毛葡萄種子的萌發(fā)首先要解除種子的休眠，根據(jù)甘陽(yáng)英等人研究不同種源的葡萄種子休眠及其解除時(shí)發(fā)現(xiàn)，野生葡萄種子的休眠為生理休眠［8］。曾有研究證明，次氯酸鈉能在一定程度上解除種子的休眠［9］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，15%次氯酸鈉處理5min的野生毛葡萄種子發(fā)芽率要比0．15%升汞處理5min的好。

用40℃無(wú)菌水和GA3 0．5mg/L（40℃）無(wú)菌溶液浸泡進(jìn)行預(yù)處理，對(duì)野生毛葡萄種子均能提高種子的發(fā)芽率，說(shuō)明溫水和赤霉素在一定程度上可以促進(jìn)野生毛葡萄種子的萌發(fā)。傅強(qiáng)等人研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，熱水浸泡可以軟化種皮，減少種皮表層的蠟質(zhì)和油層，增強(qiáng)種皮的通透性，并且能浸出發(fā)芽抑制物［10］。赤霉素能誘導(dǎo)產(chǎn)生水解酶，使種子中的貯藏物質(zhì)從大分子水解為小分子，如蛋白質(zhì)水解為氨基酸、淀粉水解為糖，為胚所利用，促進(jìn)胚后成熟，至于赤霉素促進(jìn)野生毛葡萄種子萌發(fā)的適宜濃度，還有待進(jìn)一步研究。

［1］鄒瑜．野生毛葡萄種質(zhì)資源及利用研究進(jìn)展［J］．廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，39（5）：664－667．

［2］AlleweldtG，Speigel－Roy P，Reisch B．Grapes（Vitis）［J］．Genetic Resourcesof Temperate Fruitand NutCrops290，1991：291－330．

［3］孫馬，王躍進(jìn)．中國(guó)野生葡萄染色體倍性研究［J］．西北農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào)，2006，15（6）：148－152．

［4］李玉鵬，黃燕，吳紹華．野葡萄營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定［J］．云南化工，2008，35（1）：50－51．

［5］繆冰旋．野生葡萄及葡萄酒抗氧化活性和抗菌性研究［D］．暨南大學(xué)，2014．

［6］張劍俠，王賀飛，徐炎，等．中國(guó)野生葡萄組織培養(yǎng)研究［J］．西北植物學(xué)報(bào)，2003，23（3）：460－463．

［7］劉偉．貴州葡萄屬野生種快速繁殖及離體再生研究［D］．貴州大學(xué)，2010．

［8］甘陽(yáng)英，李紹華，宋松泉，等．不同種源的葡萄種子休眠及其解除的研究［J］．生物多樣性，2008，16（6）：570－577．

［9］比尤利．J．D，布萊克．M．種子萌發(fā)的生理生化，第二卷，生活力、休眠與環(huán)境控制［M］．南京：東南大學(xué)出版社，1989：48－152．

［10］傅強(qiáng)，楊期和，葉萬(wàn)輝．種子休眠的解除方法［J］．廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué)，2003，22（3）：230－234．