劉　輝， 郭　凱， 段聰越， 湯　妮， 沈婉秋

(陜西科技大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安　710021)

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血紅蛋白在海膽狀WO3微球上的直接電化學(xué)性質(zhì)及對(duì)過氧化氫的傳感性能研究

劉輝， 郭凱， 段聰越， 湯妮， 沈婉秋

(陜西科技大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安710021)

摘要：采用溶劑熱法并結(jié)合熱處理，合成了納米線自組裝的海膽狀WO3微球，并將其用于構(gòu)筑血紅蛋白(Hb)基直接電化學(xué)生物傳感器，并采用掃描電子顯微鏡(SEM)、X-射線衍射(XRD)等對(duì)所制材料進(jìn)行了形貌與結(jié)構(gòu)表征.光譜與電化學(xué)分析表明,這種WO3微球具有很好的生物相容性，能夠保持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性與生物活性;電化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，海膽狀WO3微球的特殊結(jié)構(gòu)，可以促進(jìn)Hb的直接電子轉(zhuǎn)移.所組裝的生物傳感器具有較低的檢測(cè)極限(0.1 μm)和較寬的線性范圍(0.5～230 μm)，同時(shí)還具有快速響應(yīng)性與優(yōu)異的長(zhǎng)效穩(wěn)定性.

關(guān)鍵詞：海膽狀氧化鎢; 血紅蛋白; 直接電化學(xué); 生物傳感器

0引言

研究氧化還原蛋白質(zhì)在電極上的直接電子轉(zhuǎn)移，不但能知悉氧化還原蛋白質(zhì)催化反應(yīng)的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，有助于了解其在生命體內(nèi)的電子轉(zhuǎn)移機(jī)理和生理作用機(jī)制，而且還可以為開發(fā)新型生物傳感器和生物反應(yīng)器提供理論指導(dǎo)[1,2].

由于氧化還原蛋白質(zhì)的電活性中心深埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部，故在普通電極表面實(shí)現(xiàn)直接電子轉(zhuǎn)移十分困難.因此，需要借助特殊電極材料作為蛋白質(zhì)的固定基體，在維持其生物活性的同時(shí)，還促進(jìn)直接電化學(xué)反應(yīng)[2,3].最近的研究顯示，納米材料具有特殊的電學(xué)效應(yīng)和表面效應(yīng)，可以促進(jìn)氧化還原蛋白質(zhì)的直接電子轉(zhuǎn)移[3,4].現(xiàn)有研究表明納米材料的形貌和結(jié)構(gòu)對(duì)固定酶的能力與生物傳感器的檢測(cè)性能具有重要影響[5].其中，具有特殊結(jié)構(gòu)和形貌的三維結(jié)構(gòu)金屬氧化物納米材料在生物傳感器的研究方面已得到了廣泛關(guān)注.

Wang等[6]采用海膽狀MnO2作為血紅蛋白的基體構(gòu)筑直接電化學(xué)生物傳感器，實(shí)現(xiàn)了對(duì)CCl3COOH高效檢測(cè)；Dong等[7]采用多種具有三維結(jié)構(gòu)的NiO納米材料構(gòu)筑直接電化學(xué)生物傳感器，并研究了納米材料形貌對(duì)傳感性能的影響；Xie等[8]研究了具有空心核殼結(jié)構(gòu)的TiO2微球在生物傳感方面的應(yīng)用；Lu等[9]采用納米片自組裝ZnO微球負(fù)載血紅蛋白構(gòu)筑傳感器，并研究了該傳感器對(duì)H2O2和NaNO2的傳感性能.但目前尚未有報(bào)道采用具有三維納米結(jié)構(gòu)的WO3作為基體構(gòu)筑直接電化學(xué)生物傳感器.

本文采用溶劑熱法并結(jié)合熱處理成功地制備出了納米線自組裝海膽狀氧化鎢微球.這種氧化鎢微球在固定蛋白質(zhì)方面具有諸多優(yōu)勢(shì).第一，已有的研究[10]與本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果都表明WO3具有很優(yōu)異的生物相容性，能夠?yàn)榈鞍踪|(zhì)提供一個(gè)良好的生物微環(huán)境，有利于其保持生物結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定；第二，組成海膽狀氧化鎢微球的納米線直徑小于30 nm，這使其擁有大量的活性表面區(qū)域，有利于蛋白質(zhì)的吸附.同時(shí)，納米線還可以提供一個(gè)一維電子通路，促進(jìn)蛋白質(zhì)與電極表面的電子交換.此外，納米線之間的空隙還可以成為電解質(zhì)的擴(kuò)散通路，電解質(zhì)溶液中的底物可以較容易地接近固定于納米線上的蛋白質(zhì)，從而有利于提高蛋白質(zhì)與底物之間有效碰撞的次數(shù).可見，這種納米線自組裝海膽狀氧化鎢微球在酶的固定與生物傳感器方面具有廣闊的應(yīng)用前景.

血紅蛋白(Hb)是目前研究得最為清楚的蛋白質(zhì)之一，而且相對(duì)價(jià)廉易得，因此已成為研究生物大分子電化學(xué)的理想模型物.本文采用Hb作為模型蛋白質(zhì)，用所制備的海膽狀氧化鎢作為固定基體材料，組裝了直接電化學(xué)生物傳感器，并研究了該生物傳感器的電化學(xué)性質(zhì)及對(duì)H2O2的檢測(cè)性能.

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑和儀器

血紅蛋白(Hb)與Nafion(5 wt%)購(gòu)自Sigma公司；六氯化鎢(WCl6)、無(wú)水乙醇(CH3CH2OH)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、過氧化氫(H2O2,30 wt%)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)，均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水.

采用日本Rigaku的D/Max-2200型X射線衍射儀對(duì)樣品的物相和結(jié)晶性進(jìn)行分析，(Cu Kα輻射，λ=0.154 18 nm)；采用S-4800型日立掃描電子顯微鏡對(duì)樣品的形貌進(jìn)行觀察分析；采用PerkinElmer Lambda 950型紫外可見吸收光譜儀(UV-VIS)與Bruker V70型紅外光譜儀(Fourier Transform Infrared,FT-IR)對(duì)復(fù)合膜中的Hb進(jìn)行檢測(cè)；使用辰華660D電化學(xué)工作站進(jìn)行電化學(xué)測(cè)試.測(cè)試使用三電極體系，修飾的玻碳電極(GCE)為工作電極，鉑絲電極為對(duì)電極，Ag/AgCl電極為參比電極.

1.2海膽狀WO3微球的制備

稱量0.6 g WCl6溶解于60 mL 無(wú)水乙醇中，得到黃色透明溶液.將所得溶液轉(zhuǎn)移至100 mL聚四氟乙烯內(nèi)襯的水熱釜中，并將其放置于180 ℃的烘箱中保溫24 h，自然冷卻至室溫得到藍(lán)色反應(yīng)產(chǎn)物 (WO2.72).將反應(yīng)產(chǎn)物用去離子水和無(wú)水乙醇分別洗滌三次，50 ℃ 干燥24 h.對(duì)所得藍(lán)色產(chǎn)物進(jìn)行熱處理，熱處理溫度為450 ℃，升溫速率為1 ℃/min，保溫30 min自然冷卻至室溫而得到黃色產(chǎn)物 (WO3).

1.3制備酶電極

玻碳電極(GCE)在使用前，分別在撒有1.0μm、0.3μm、0.05μm Al2O3粉的麂皮上打磨成鏡面，用去離子水沖洗，并用純氮?dú)獯蹈纱?采用簡(jiǎn)單的涂抹法制備修飾電極.首先，取10 mg 所制備的WO3微球加入5 mL 去離子水中，超聲分散并結(jié)合攪拌獲得了WO3分散液;隨后，將Hb溶液(10 mg mL-1溶于PBS,pH=7.0)、Nafion(5.0 wt%)與WO3分散液按體積比1∶1∶2制成混合液(記為I液).在此混合液中，Hb為2.5 mg mL-1，WO3為1 mg mL-1，Nafion為1.25 wt%.用微量計(jì)量器取4μL I液涂抹在拋光的GCE上，用燒杯蓋上，使水分緩慢揮發(fā)，待完全干燥后在電極表面形成一層均勻的復(fù)合膜，即制備出Nafion/Hb/WO3/GCE.將所制成的修飾電極存儲(chǔ)于4 ℃的冰箱中待用.

作為對(duì)比，采用相同的工藝制備了Nafion/Hb/GCE與Nafion/WO3/GCE兩種電極.在電化學(xué)測(cè)試之前，所用的修飾電極均需要在pH 7.0的PBS中浸泡30 min，以除去表面粘附的雜質(zhì).

2結(jié)果與討論

2.1海膽狀WO3微球的表征

圖1是不同階段產(chǎn)物的XRD衍射圖譜，其中曲線a為溶劑熱反應(yīng)產(chǎn)物的XRD衍射圖譜，該曲線對(duì)應(yīng)的是WO2.72的標(biāo)準(zhǔn)圖譜 (JCPDS No.36-101)[11];曲線b顯示經(jīng)過450 ℃熱處理，WO2.72完全轉(zhuǎn)變成了WO3(JCPDS No.43-1035)[11].

a:水熱反應(yīng)產(chǎn)物; b:熱處理所得產(chǎn)物圖1　不同階段產(chǎn)物的XRD圖譜

圖2顯示了不同階段產(chǎn)物的SEM照片.圖2(a)、(b)為溶劑熱反應(yīng)產(chǎn)物WO2.72不同放大倍數(shù)的SEM照片.如圖2(a)所示，所得WO2.72產(chǎn)物形貌均一，都為納米線自組裝的海膽狀微球;圖2(b)顯示納米線直徑約為20 nm，微球直徑約為500 nm；圖2(c)與2(d)顯示450 ℃熱處理30 min未引起產(chǎn)物形貌的明顯變化.這可能是由于較溫和的煅燒溫度、緩慢的升溫速率以及WO3與WO2.72具有較為相似的晶體結(jié)構(gòu)[12].

(a)、(b)溶劑熱反應(yīng)產(chǎn)物

(c)、(d)熱處理所得產(chǎn)物圖2　不同階段產(chǎn)物的SEM照片

2.2Nafion/Hb/WO3復(fù)合膜的光譜表征

血紅素類蛋白質(zhì)Soret 吸收峰的位置能夠反映血紅素蛋白質(zhì)構(gòu)像的完整性信息，故Soret 吸收峰位置的改變可以作為蛋白質(zhì)是否變性的重要標(biāo)志[5,13].因此，利用UV-Vis光譜檢測(cè)Hb的結(jié)構(gòu)的變化情況.

圖3為Nafion/Hb/WO3復(fù)合膜 (曲線a) 和Hb(曲線b)的UV-Vis 譜圖.Hb的PBS溶液滴在石英片上制備的薄膜，其Soret 吸收峰位置為406.2 nm；Nafion/Hb/WO3復(fù)合膜的Soret 吸收峰位置為405.4 nm，和純Hb薄膜相比，其吸收峰位置幾乎沒有改變，故可以認(rèn)為Hb在Nafion/Hb/WO3復(fù)合膜中保持了原有的結(jié)構(gòu).

a:Nafion/Hb/WO3復(fù)合膜; b:純Hb圖3　Hb的UV-Vis 光譜

紅外光譜是研究蛋白質(zhì)大分子二級(jí)結(jié)構(gòu)的有效手段，故在電極表面復(fù)合膜中，Hb的活性常用紅外光譜進(jìn)行分析[7-13].在紅外光譜中，蛋白質(zhì)具有Amide Ⅰ與Amide Ⅱ兩個(gè)特征吸收峰，這兩個(gè)吸收峰可以提供蛋白質(zhì)中肽鍵的許多細(xì)節(jié)信息.Amide Ⅰ吸收峰 (1 700～1 600 cm-1) 是由于構(gòu)成蛋白質(zhì)骨架的肽鍵(-CO-NH-)中C=O的伸縮振動(dòng)引起的；Amide Ⅱ吸收峰 (1 620～1 500 cm-1) 是由于N—H的彎曲振動(dòng)與C—N的伸縮振動(dòng)共同引起的.Nafion中不含有肽鍵，故不具有Amide Ⅰ與Amide Ⅱ吸收峰.

圖4為Nafion/Hb/WO3復(fù)合膜(曲線a)與純Hb(曲線b)的紅外吸收光譜.如圖4所示，Nafion/Hb/WO3復(fù)合膜具有與純Hb幾乎完全相同的AmideⅠ與Amide Ⅱ吸收峰，這說明Hb在復(fù)合膜中保持了原有的二級(jí)結(jié)構(gòu).可見，WO3具有良好的生物相容性，可以提供一個(gè)保護(hù)性的微環(huán)境以保持蛋白質(zhì)的生物活性.

a:Nafion/Hb/WO3復(fù)合膜; b:純Hb圖4　Hb的紅外吸收光譜

2.3Hb在Nafion/Hb/WO3復(fù)合膜中的直接電化學(xué)

如圖5所示，Nafion/WO3/GCE(b曲線)的循環(huán)伏安曲線中無(wú)氧化峰與還原峰，表明在此掃描電壓范圍內(nèi)海膽狀WO3微球無(wú)電活性;Hb/Nafion/GCE(a曲線)的循環(huán)伏安曲線有一對(duì)很弱的氧化還原峰，這是因?yàn)镠b的氧化還原中心包埋于蛋白質(zhì)內(nèi)部,要與GCE表面直接進(jìn)行電子交換并不容易，而且會(huì)大量失活;Nafion/Hb/WO3/GCE(c曲線)的循環(huán)伏安曲線有一對(duì)清晰穩(wěn)定的氧化還原峰，這對(duì)氧化還原峰代表Hb(FeⅢ)/Hb(FeⅡ) 氧化還原對(duì)的相互轉(zhuǎn)化.

a:Nafion/Hb/GCE; b:Nafion/WO3/GCE;c:Nafion/Hb/WO3/GCE圖5　不同修飾電極在0.1 mol·L-1的pH 7.0 PBS緩沖溶液中的循環(huán)伏安曲線，其中掃速為0.1 V s-1

在此修飾電極上，Hb的表觀電位Eo′(Eo′定義為 (Epa+Epc)/2，其中Epa為氧化峰電位，Epc為還原峰電位) 為0.352 (vs.Ag/AgCl)，這與其他研究者制備的負(fù)載Hb的修飾電極所得結(jié)果一致[14].峰間電位差(ΔEp) 的大小可以反映直接電子轉(zhuǎn)移速率的快慢.電位差越小，表明直接電子轉(zhuǎn)移速率越快.Nafion/Hb/WO3/GCE的循環(huán)伏安曲線中ΔEp=38 mv，這表明在此修飾電極上電子轉(zhuǎn)移是一個(gè)快速且準(zhǔn)可逆的過程.納米線自組裝海膽狀WO3微球之所以可以促進(jìn)Hb的直接電子轉(zhuǎn)移是由于納米線可以為電子提供一個(gè)快速轉(zhuǎn)移的通路.

Nafion/Hb/WO3/GCE在PBS(0.1 M,pH=7)中的循環(huán)伏安特性與掃描速率的關(guān)系如圖6所示.從圖6(a)中可以看出，在0.1～0.8 V s-1的掃速范圍中，Hb(FeⅢ)/Hb(FeⅡ) 的氧化還原峰電流值隨掃速的增大而增大，同時(shí)峰間電位差亦有少量增加.氧化還原峰電流值與掃速成正比，其線性關(guān)系見圖6(b)，這十分清楚地表明，在此修飾電極表面，Hb與GCE之間的電子轉(zhuǎn)移是表面控制的電化學(xué)過程.采用Laviron模型[15]對(duì)這一表面控制電化學(xué)體系進(jìn)行分析.經(jīng)計(jì)算,Hb在Nafion/Hb/WO3/GCE上的電子轉(zhuǎn)移速率常數(shù)(ks)約為2.8 s-1.這說明電活性物質(zhì)Hb在Nafion/Hb/WO3復(fù)合薄膜中具有較快的電子轉(zhuǎn)移.

(a)不同掃速條件下的循環(huán)伏安曲線

(b)氧化峰與還原峰電流和掃速之間的關(guān)系圖6　Nafion/Hb/WO3/GCE在0.1 mol L-1的pH 7.0 PBS緩沖溶液中掃速與電流的關(guān)系

Nafion/Hb/WO3/GCE的活性Hb表觀覆蓋度 (Γ*, mol cm-2)可利用公式Γ* =Q/nFA計(jì)算得出[16]，其中Q是氧化還原峰的積分電量，n是Hb的反應(yīng)電子轉(zhuǎn)移數(shù)(n=1)，F(xiàn)為法拉第常數(shù)，A是電極幾何表面積.據(jù)此計(jì)算出固定在Nafion/Hb/WO3復(fù)合薄膜上具有電化學(xué)活性的Hb的表觀覆蓋度Γ*為3.32×10-10mol cm-2，該值遠(yuǎn)高于單層覆蓋的理論值 (1.89×10-11mol cm-2)[17].這表明多層Hb固定于Nafion/Hb/WO3復(fù)合薄膜中并參與了直接電子轉(zhuǎn)移過程.

Hb的直接電化學(xué)行為和溶液pH值具有十分密切的關(guān)系.圖7 所示為Nafion/Hb/WO3/GCE在不同pH的PBS緩沖液中的循環(huán)伏安曲線.從圖7中可以看出，隨PBS的pH值逐漸增大，Hb的氧化峰與還原峰的峰電位均向負(fù)電位移動(dòng).這種氧化還原電位的變化在測(cè)試 pH 值范圍(6.0～8.0)內(nèi)是可逆的，在重復(fù)調(diào)節(jié)到相同的pH值時(shí)，修飾電極的循環(huán)伏安曲線能夠恢復(fù)，峰位置和峰電流不會(huì)發(fā)生改變.

a:6.0;b:6.5;c:7.0;d:7.5;e:8.0圖7　Nafion/Hb/WO3/GCE在不同pH值0.1mol L-1的PBS緩沖溶液中的循環(huán)伏安曲線(其中插圖為表觀電位與pH值的關(guān)系曲線)

實(shí)驗(yàn)考察了Eo′與測(cè)試底液pH值的關(guān)系,如圖7的內(nèi)插圖所示.Hb的表觀電位 (Eo′)隨溶液的pH值變化而線性變化.其斜率為-52.6 mV pH-1,線性相關(guān)系數(shù)R=0.999，接近于質(zhì)子-電子傳遞的理論值-58.0 mV pH-1.這說明在Nafion/Hb/WO3復(fù)合薄膜中，Hb的血紅素輔基在發(fā)生單電子傳遞的同時(shí)，還伴隨有一個(gè)質(zhì)子的得失.其電極氧化還原反應(yīng)的方程式為[18]：

Hb(FeⅢ) + e-+ H+= Hb(FeⅡ)

(1)

由圖7還可以看出,在pH=7.0的PBS中,Hb的氧化還原峰電流都最大，這是由于越接近于生物體內(nèi)環(huán)境，Hb的活性越高.故選取pH=7作為生物傳感器的檢測(cè)條件.

2.4Nafion/Hb/WO3/GCE的電催化性能

Hb能對(duì)O2、H2O2、亞硝酸鹽等物質(zhì)進(jìn)行電催化還原[4,9,19].本文以H2O2為例，研究了Nafion/Hb/WO3/GCE的電催化還原能力.圖8所示為Nafion/Hb/WO3/GCE在含有不同濃度H2O2的PBS(0.1M，pH 7.0)中所測(cè)得的循環(huán)伏安曲線.

圖8　Nafion/Hb/WO3/GCE在含不同濃度H2O2的0.1 mol L-1的pH 7.0 PBS緩沖溶液中的循環(huán)伏安圖(H2O2的濃度分別為:0μm、10 μm、30 μm、50 μm、70 μm、110 μm、150 μm、190 μm、 230 μm、270 μm)，插圖為H2O2濃度與相應(yīng)的催化還原電流之間的關(guān)系圖

當(dāng)未加入H2O2時(shí)，曲線有一對(duì)可逆的氧化還原峰.隨著H2O2的加入，還原峰電流快速增加，氧化峰電流減小直至消失，這表明H2O2在電極表面發(fā)生的是電催化還原反應(yīng).其電催化還原反應(yīng)的方程式為[18]：

H2O2+2Hb(FeⅡ)=2Hb(FeⅢ)+2H2O

(2)

(3)

2.5Nafion/Hb/WO3/GCE對(duì)H2O2的生物傳感性

采用計(jì)時(shí)電流法研究Nafion/Hb/WO3/GCE針對(duì)H2O2的生物傳感性能.在工作電位為0.35 V條件下，向PBS (0.1 M,pH 7.0) 中連續(xù)加入一定濃度的H2O2溶液后，得到一系列的電流響應(yīng),如圖9所示.當(dāng)加入H2O2后,還原電流快速增大到一個(gè)穩(wěn)定值，且在3 s內(nèi)達(dá)到95%的電流響應(yīng)，表明Nafion/Hb/WO3/GCE對(duì)H2O2具有快速響應(yīng).

圖9　Nafion/Hb/WO3/GCE對(duì)H2O2濃度變化的計(jì)時(shí)電流響應(yīng)曲線及H2O2濃度與電流響應(yīng)之間的關(guān)系圖

圖9內(nèi)插圖為穩(wěn)態(tài)電流與H2O2濃度的校正曲線圖.如圖9所示,電流與H2O2濃度之間具有明確的線性關(guān)系，線性范圍為0.5～230μm(γ=0.998,n=31)，檢測(cè)限為0.1μm(信噪比S/N=3).將此體系下的傳感器與其它已報(bào)道的傳感器等對(duì)H2O2的傳感性能進(jìn)行了對(duì)比，如表1所示[22].由表1可知，Nafion/Hb/WO3/GCE具有較低的檢出限和較寬線性范圍，這歸功于納米線自組裝海膽狀WO3微球的優(yōu)異生物相容性和良好的電子導(dǎo)通作用.

參考文獻(xiàn)表1不同修飾電極對(duì)H2O2檢測(cè)性能的比較修飾電極線性范圍/μm檢測(cè)限/μmNafion/Hb/TiO2-rGO/GCE0.1-1450.01[21]Hb/ZnO-MWCNT/Nafion/GCE1-800.85[22]Hb/Chit-[bmim]PF6/TiO2-Gr/GCE1-11700.3[23]HRP/TiO2/Nafion/GCE0.4-1400.05[6]Mb/TiC/chit/GCE0.5-500.2[24]Nafion/Hb/WO3/GCE0.5-2300.1本研究

注：TiO2NSsT, 多壁碳納米管；CMC, 羧甲基纖維素；[bmim]BF4-rGO, TiO2納米片修飾還原氧化石墨烯納米復(fù)合材料；MWCN, 離子液體1-丁基-3-甲基咪挫六氟磷酸鹽；Mb, 肌紅蛋白；Chit, 殼聚糖

2.6傳感器的穩(wěn)定性與再現(xiàn)性

本文還研究了所組裝生物傳感器的長(zhǎng)效穩(wěn)定性.將該修飾電極存放在4 ℃冰箱中，30天之后再用其檢測(cè)10μm H2O2，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示相對(duì)于剛制備好的修飾電極，電流響應(yīng)降低為原來(lái)的91.8%，說明固定在電極表面上的Hb能夠長(zhǎng)時(shí)間地保持其生物活性[23].這應(yīng)歸功于所制備的納米線自組裝WO3微球具有良好的生物相容性，可以為Hb提供一個(gè)保護(hù)性微環(huán)境，以維持其生物結(jié)構(gòu).

同時(shí)研究了該生物傳感器的重現(xiàn)性.平行制備了6組相同的Nafion/Hb/WO3/GCE，并對(duì)10μm H2O2進(jìn)行平行檢測(cè)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.7%,表明Nafion/Hb/WO3/GCE具有良好的重現(xiàn)性.

3結(jié)論

采用溶劑熱法結(jié)合高溫?zé)崽幚恚苽涑隽思{米線自組裝海膽狀WO3微球，并將其應(yīng)用于Hb電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建.光譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Hb在Nafion/Hb/WO3復(fù)合膜中保持了其天然構(gòu)象;電化學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，所制備的直接電化學(xué)生物傳感器對(duì)H2O2具有優(yōu)異的傳感性能,具有較寬的線性范圍 (0.5～230μM)和極低的檢測(cè)極限 (0.1μM)，以及較好的穩(wěn)定性與再現(xiàn)性.這種納米線自組裝海膽狀WO3微球是制備電化學(xué)生物傳感器的一種優(yōu)異基體材料，在生物醫(yī)學(xué)與環(huán)境監(jiān)測(cè)方面具有十分廣闊的應(yīng)用前景.

[1] Hamachi I,Fujita A,Kunitake T.Protein engineering using molecular assem-bly:Functional conversion of cytochrome c via noncovalent interactions[J].J.Am.Chem.Soc.,1997,119(39):9 096-9 102.

[2] Legar C,Elloitt S.J,Hoke K.R,et al.Enzyme electrokinetics:Using protein film voltammetry to investigate redox enzymes and their mechanisms[J].Biochemistry,2003,42(29):8 653-8 662.

[3] Zhihong Z,Lining Q,Qingjuan N,et al.Urchinlike MnO2nanoparticles for the direct electrochemistry of hemoglobin with carbon ionic liquid electrode[J].Biosens.Bioelectron.,2011,26(5):2 119-2 124.

[4] M.Lwasaki,M.Hare.Cobalt ion-doped TiO2photocatalyst reponse to visible light[J].J Colloid Interface Sci,2000,224(1):202-204

[5] Sheng Q.L,Zheng J.B,Shangguan X.D,et al.Direct electrochemistry and electrocatalysis of heme-proteins immobilized in porous carbon nanofiber/room-temperature ionic liquid composite film[J].Electrochim.Acta,2010,55(9):3 185-3 191.

[6] Wang C,Han X,Xu P,et al.Controlled synthesis of hierarchical nickel and morphology-dependent electromagnetic properties[J].The Journal of Physical Chemistry C,2010,114(7):3 196-3 203.

[7] Sheying D,Penghui Z,Hui L,et al.Direct electrochemistry and electrocatalysis of hemoglobin in composite film based on ionic liquid and NiO microspheres with different morphologies[J].Biosens.Bioelectron.,2011,26(10):4 082-4 087.

[8] Xie Q,Zhao Y.Y,Chen X,et al.Nanosheet-based titania microspheres with hollow core-shell structure encapsulating horseradish peroxidase for a mediator-free biosensor[J].Biomaterials,2011,32(27):6 588-6 594.

[9] Lu X.B,Zhang H.J,Ni Y.W,et al.Porous nanosheet-based ZnO microspheres for the construction of direct electrochemical biosensor[J].Biosens.Bioelectron.,2008,24(1):93-98.

[10] Deng Z.F,Gong Y.C,Luo Y,et al.WO3nanostructures facilitate electron transfer of enzyme:Application to detection of H2O2with high selectivity[J].Biosens.Bioelectron.,2009,24(8):2 465-2 469.

[11] Xi G.C,Ye J.H,Ma Q,et al.In situ growth of metal particles on 3D urchin-like WO3nanostructures[J].J.Am.Chem.Soc.,2012,134(15):6 508-6 511.

[12] Xi G.C,Yue B,Cao J.Y,et al.Fe3O4/WO3hierarchical core-shell structure:High-performance and recyclable visible-light photocatalysis[J].Chem.Eur.J.,2011,17(18):5 145-5 154.

[13] Sun W,Guo Y.Q,Zhang Y.Y,et al.Direct electrochemistry of hemoglobin on graphene and titanium dioxide nanorods composite modified electrode and its electrocatalysis[J].Biosens.Bioelectron.,2013,42:207-213.

[14] Shang Y,Zhang D F,Guo L.CuCl-intermediated construction of short-range-ordered WO3mesoporous spheres with excellent adsorption performance[J].Mater.Chem,2012,22(3):856-861.

[15] Laviron E.General expression of the linear potential sweep voltammogram in the case of diffusionless electrochemical systems[J].J.Electroanal.Chem.,1979,101(1):19-28.

[16] Shi F,Zheng W.Z,Wang W.C,et al.Application of graphene-copper sulfide nanocomposite modified electrode for electrochemistry and electrocatalysis of hemoglobin[J].Biosens.Bioelectron.,2015,64:131-137.

[17] Wang S.F,Chen T,Zhang Z.L,et al.Direct electrochemistry and electrocatalysis of heme proteins entrapped in agarose hydrogel films in room-temperature ionic liquids[J].Langmuir,2005,21(20):9 213-9 260.

[18] Kamin R.A,Wilson G.S.Rotating ring-disk enzyme electrode for biocatalysis kinetic studies and characterization of the immobilized enzyme layer[J].Anal.Chem.,1980,52(8):1 198-1 205.

[19] George S,Lee H.K.Direct electrochemistry and electrocatalysis of hemoglobin in nafion/carbon nanochip film on glassy carbon electrode[J].J.Phys.Chem.B.,2009,113(47):15 445-15 454.

[20] Xie L.L,Xu Y.D,Cao X.Y.Hydrogen peroxide biosensor based on hemoglobin mmobilized at graphene,flower-like zinc oxide, and gold nanoparticles nanocomposite modified glassy carbon electrode[J].Colloids Surf.,B,2013,10:245-250.

[21] Liu H,Duan C.Y,Su X,et al.Hemoglobin encapsulated titania nanosheet modified reduced graphene oxide nanocomposite as a mediator-free biosensor[J].Sens.Actuators B,2014,203:303-310.

[22] Ma W,Tian D.B.Direct electron transfer and electrocatalysis of hemoglobin in ZnO coated multiwalled carbon nanotubes and Nafion composite matrix[J].Bioelectrochemistry,2010,78(2):106-112.

[23] Sun J.Y,Huang K.J,Zhao S.F,et al.Direct electrochemistry and electrocatalysis of hemoglobin on chitosan-room temperature ionic liquid-TiO2-graphene nanocomposite film modified electrode[J].Bioelectrochemistry,2011,82(2):125-130.

A novel H2O2biosensing based on the direct electrochemistry

of hemoglobin on urchin-like WO3microspheres

LIU Hui, GUO Kai, DUAN Cong-yue, TANG Ni, SHEN Wan-qiu

(School of Materials Science and Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

Abstract:Using solvent hot method and combined with heat treatment,nanowire-based urchin-like WO3microspheres have been synthesized and employed to immobilize hemoglobin (Hb) in order to fabricate a mediator-free biosensor.The morphology and structure of the WO3microspheres were characterized by scanning electron microscopy,X-ray diffraction.Spectroscopic and electrochemical measurements revealed that the WO3microspheres are an immobilization support with biocompatibility for proteins,affording good protein stability and bioactivity.Due to the special structure of the WO3microspheres,the direct electron transfer of Hb is facilitated and the resulting biosensor displayed good performance for the detection of H2O2,with both a low detection limit of 0.1 μm and a wide linear range of 0.5～230 μm,as well as a fast response and excellent long-term stability.

Key words:urchin-like WO3； hemoglobin; direct electrochemistry; biosensor

中圖分類號(hào)：O64

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1000-5811(2015)05-0050-06

作者簡(jiǎn)介:劉輝(1976-)，男，陜西周至人，副教授，博士，研究方向：納米功能材料制備及表征

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(51272147)； 陜西科技大學(xué)學(xué)術(shù)骨干培育計(jì)劃項(xiàng)目(XSGP201203)； 陜西科技大學(xué)研究生創(chuàng)新基金項(xiàng)目

收稿日期:*2015-07-19