曾樂，楊光，鄭雄敏，楊希

(江西誠志生物工程有限公司，江西鷹潭，335000)

D-核糖(D-ribose)［1-5］作為遺傳物質(zhì)核糖核酸(RNA)、脫氧核糖核酸(DNA)的組成成分存在于所有生物細(xì)胞之中，在生理上起著重要作用。特別是近年來，D-核糖作為抗癌和抗病毒藥物、核黃素及風(fēng)味增強(qiáng)劑等的合成原料在制藥工業(yè)和食品工業(yè)上的需求逐步增大［6-9］。目前，D-核糖的工業(yè)生產(chǎn)廣泛采用的是發(fā)酵法［10-15］。而對于D-核糖發(fā)酵液的預(yù)處理，傳統(tǒng)工業(yè)生產(chǎn)上大多采用的是絮凝板框過濾或轉(zhuǎn)鼓過濾法去除發(fā)酵液中的大部分菌體及色素等雜質(zhì)，但其中存在菌體去除不徹底、D-核糖提取收率低、產(chǎn)品雜質(zhì)殘存明顯，產(chǎn)生的固廢難以處理等問題，逐步被膜工藝所取代［16-17］。

本研究采用新型、高效的陶瓷膜分離技術(shù)對D-核糖發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理，分別從膜過濾時間、膜過濾溫度來考察其對滲透通量的影響，以及從加水頂洗量與不同過濾方法兩方面來研究其對產(chǎn)品收率的影響，以期達(dá)到有效去除發(fā)酵液中的菌體、大顆粒蛋白及其他雜質(zhì)，提高D-核糖的提取收率，降低或減少雜質(zhì)，同時不產(chǎn)生固廢，有利于D-核糖產(chǎn)業(yè)化、清潔化生產(chǎn)的目的，為D-核糖發(fā)酵液的預(yù)處理工藝提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草酸、黃血鹽、硫酸鋅、活性炭均為分析純;D-核糖發(fā)酵液由江西誠志生物工程有限公司發(fā)酵工序提供;發(fā)酵液中產(chǎn)D-核糖的菌體為枯草芽孢桿菌(發(fā)酵液中的主要固形物質(zhì))。

1.2 儀器與設(shè)備

陶瓷膜過濾設(shè)備(0.24 m2的全回流分離設(shè)備，膜規(guī)格為100 nm)，江蘇久吾高科技有限公司;板框過濾設(shè)備，浙江建華集團(tuán)過濾機(jī)有限公司;轉(zhuǎn)鼓過濾設(shè)備，安丘汶瑞過濾機(jī)械有限公司;Agilent 1260高效液相色譜儀(配有示差檢測器RID和LC 1260 Open-LAB色譜工作站)，美國安捷倫科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 發(fā)酵液分離制備

取D-核糖發(fā)酵液200 L，通過陶瓷膜過濾設(shè)備，除去發(fā)酵液中的菌體及較大的蛋白及雜質(zhì)顆粒。具體分離流程如圖1。

圖1 陶瓷膜分離流程示意圖Fig.1 Flow diagram of the ceramic membrane separation process

1.3.2 對照實驗

取同批發(fā)酵液200 L，經(jīng)過草酸酸化后，加入黃血鹽、硫酸鋅、活性炭按比例進(jìn)行絮凝，進(jìn)行板框過濾，收集濾液作為膜過濾實驗的對照樣。另取同批發(fā)酵液100 L，采用同樣方法絮凝后，進(jìn)行轉(zhuǎn)鼓過濾，收集濾液作為膜過濾實驗的對照樣。

1.3.3 D-核糖含量的測定

采用高效液相色譜法檢測［18］，Shodex KS-801糖柱(300 mm KS-8，Showa Denko，Japan)，示差折光檢測器，進(jìn)樣量為10 μL，色譜柱溫度80℃，檢測器溫度40℃，進(jìn)樣流速為1.0 mL/min，運(yùn)行時間為15 min。流動相:用0.45 μm的濾膜真空過濾，并于超聲波脫氣機(jī)上超聲脫氣15 min的超純水。

1.3.4 樣品溶液的制備

取已干燥的D-核糖樣品2.0 g(精確至0.000 1 g)，置100 mL量瓶中，用流動相溶解，并定容至刻度，搖勻。用注射器吸取上述溶液并用濾膜過濾至進(jìn)樣瓶內(nèi)，作為供試液(20 μg/mL)待用。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

取D-核糖的標(biāo)準(zhǔn)品，其制備步驟同1.3.4。

2 結(jié)果與分析

2.1 陶瓷膜對D-核糖發(fā)酵料液滲透性實驗

在進(jìn)膜壓力0.3 MPa、出膜壓力0.1 MPa，操作溫度50℃，不加頂水的條件下，進(jìn)行了膜單位面積對D-核糖料液滲透性的實驗，結(jié)果如圖2。

圖2 陶瓷膜分離過程中的通量變化曲線Fig.2 Flux changing in the ceramic membrane separation process

圖2顯示的是D-核糖發(fā)酵液在陶瓷膜過濾過程中的通量變化曲線?？梢钥闯鲈谀み^濾初始階段(0～10 min)，料液需形成全回流過程，通量隨時間下降明顯，此階段料液體系的組成并沒有發(fā)生變化;隨著膜濃縮過程的進(jìn)行，大量的菌體、大顆粒蛋白、雜物等物質(zhì)被陶瓷膜濃縮，通量隨時間增長而逐步降低;在膜濃縮過程的持續(xù)(40～60 min)期間，料液中的菌體、雜質(zhì)物質(zhì)被持續(xù)不斷的濃縮，因此陶瓷膜的表面形成一層穩(wěn)定的濾餅層，此時膜通量隨時間的增長而變化不大，趨于穩(wěn)定。最后隨著料液體積逐步的減少，料液中的菌體等大顆粒物質(zhì)的濃度不斷升高，通量持續(xù)下降。整個過程膜的平均滲透通量為219 L/(m2·h)。

2.2 溫度對陶瓷膜通量的影響

通常情況下，溫度升高，分子間的熱運(yùn)動加劇，液體的黏度下降，從而使得傳質(zhì)速率加大，圖3為溫度對D-核糖發(fā)酵液在陶瓷膜過濾過程中的通量影響情況。

圖3 溫度對陶瓷膜通量的影響Fig.3 Effect of temperature on the ceramic membrane flux

從圖3可以看出，隨著溫度的升高，D-核糖發(fā)酵液在陶瓷膜過濾中的通量逐步增大，因此升高溫度是提升D-核糖發(fā)酵液在陶瓷膜過濾中通量的有效手段。同時可以看出在45～55℃隨著溫度升高通量提升的幅度最大，結(jié)合實際生產(chǎn)條件及設(shè)備要求，D-核糖發(fā)酵液在陶瓷膜過濾中的溫度控制在45～55℃最佳。

2.3 陶瓷膜過濾加水頂洗量對產(chǎn)品收率的影響

對于發(fā)酵液體系的過濾，在板框過濾的濾餅層、陶瓷膜過濾的濃縮液中都會殘留部分產(chǎn)品，所以一般都需要加水進(jìn)行頂洗，達(dá)到提高產(chǎn)品收率的目的，減少產(chǎn)品的流失。而具體的頂洗水量，要根據(jù)發(fā)酵液及產(chǎn)品的性質(zhì)以及工藝的要求等綜合因素來考慮。本試驗對頂洗的水量與產(chǎn)品的收率做了考察，實驗結(jié)果如表1及圖4。其中:產(chǎn)品收率=(膜過濾后濾液D-核糖含量×濾液體積)/(膜過濾前發(fā)酵D-核糖含量×料液體積)×100%;頂洗水倍數(shù)=加水量(L)/過濾60 min后剩余料液量(L)。

表1 頂洗水倍數(shù)的變化對D-核糖含量以及產(chǎn)品收率的影響Table 1 Effect of washing water multiples variation on the content of D-ribose and product yield

圖4 頂洗水倍數(shù)對產(chǎn)品收率的影響Fig.4 Effect of washing multiples on the product yield

開始加水頂洗的時間控制是剩余濃縮液的量越少越好，這時所需要的頂洗水量較少。一般有兩種判斷加水時間的方法:一是濃縮到一定程度時，通量下降非常明顯，這時需要加水提高通量;二是濃縮到一定的濃縮倍數(shù)后，就開始加水。本試驗采取第一種判斷加水時間的方法，根據(jù)2.1中陶瓷膜對D-核糖發(fā)酵料液滲透性的實驗結(jié)果，在陶瓷膜過濾60 min后，采用流加的方法進(jìn)行加水頂洗。從圖4可以看出，隨著頂洗水的增加，產(chǎn)品收率也在不斷提高。但在頂洗水倍數(shù)達(dá)到0.5倍之后，提取收率趨于穩(wěn)定，收率可達(dá)98%以上。

2.4 不同預(yù)處理方式對產(chǎn)品收率的影響

目前，D-核糖工業(yè)化生產(chǎn)過程中通常采用的發(fā)酵液預(yù)處理方法有:板框過濾、轉(zhuǎn)鼓過濾及膜過濾等。本試驗通過對板框過濾、轉(zhuǎn)鼓過濾及陶瓷膜過濾3種不同的D-核糖發(fā)酵液預(yù)處理方式的對比，考察其對發(fā)酵液預(yù)處理環(huán)節(jié)D-核糖收率的影響。結(jié)果見表2。產(chǎn)品收率=(過濾后濾液D-核糖含量×濾液體積)/(過濾前發(fā)酵液D-核糖含量×料液體積)×100%。

表2 不同預(yù)處理方法對產(chǎn)品收率的影響Table 2 Effect of different pretreatment methods on the product yield

從表2中可以得出，在板框過濾、轉(zhuǎn)鼓過濾、陶瓷膜過濾3種不同的D-核糖發(fā)酵液預(yù)處理方式下，陶瓷膜分離方法處理D-核糖發(fā)酵液后，產(chǎn)品收率最高，平均收率高達(dá)96.02%。這是因為板框過濾及轉(zhuǎn)鼓過濾方式都是屬于餅層過濾，即懸浮液在過濾過程中，其中的固型物質(zhì)沉積于介質(zhì)表面形成濾餅層，并通過濾餅層真正發(fā)揮攔截顆粒的作用。因此不可避免的在濾餅層不斷增大的同時，也會逐步附著D-核糖，從而導(dǎo)致在產(chǎn)品收率提升上出現(xiàn)瓶頸。而陶瓷膜過濾利用膜孔隙的選擇滲透性，以膜兩側(cè)流體壓力差為推動力進(jìn)行固液分離，不產(chǎn)生濾餅層，不存在D-核糖附著的情況發(fā)生，極大的提高了產(chǎn)品收率?？梢娞沾赡し蛛x方法比傳統(tǒng)的板框及轉(zhuǎn)鼓過濾方法在D-核糖發(fā)酵液預(yù)處理的應(yīng)用中更具優(yōu)勢，分離選擇性高，能顯著提高該階段的產(chǎn)品收率。

2.5 陶瓷膜的清洗及膜通量的恢復(fù)

陶瓷膜在分離料液過程中，水中的微粒、膠體粒子或溶質(zhì)大分子由于與膜存在物理化學(xué)相互作用或機(jī)械作用而易引起在膜表面或膜孔內(nèi)吸附、沉積，從而造成膜孔徑變小或堵塞，使膜產(chǎn)生透過流量與分離特性的下降。因此在長時間使用后必須對膜進(jìn)行清洗，使得膜通量得以恢復(fù)。

膜清洗一般是在高流速、低壓力條件下進(jìn)行。由于陶瓷膜具有優(yōu)異的化學(xué)穩(wěn)定性與高機(jī)械強(qiáng)度，可采用廣泛的清洗方法進(jìn)行清洗。本試驗采用清水漂洗→堿洗→清水漂洗→酸洗→純水置換至pH為中性的方式對陶瓷膜進(jìn)行清洗，可使陶瓷膜通量恢復(fù)至新膜通量的90%以上。其中堿洗組成為NaClO 1%～1.5%(V/V)、NaOH 1% ～2%(wt)的混合水溶液，酸洗組成為HNO31% ～2%(wt)的水溶液，純水為二級反滲透水。

3 結(jié)論

(1)D-核糖發(fā)酵液在陶瓷膜分離過程中，不加頂洗水的條件下，膜通量隨時間變化呈現(xiàn)前期遞減、中期穩(wěn)定、后期遞減的現(xiàn)象，整個過程膜的平均滲透通量為219 L/(m2·h)。

(2)膜分離通量隨著操作溫度的升高而逐漸增大，且在45～55℃溫度區(qū)間內(nèi)通量顯著提升，工業(yè)化應(yīng)用中可將溫度控制在45～55℃。

(3)膜分離過程中隨著頂洗水的增加，產(chǎn)品收率也在不斷提高;且在頂洗水倍數(shù)達(dá)到0.5倍后，提取收率趨于穩(wěn)定，之后增加頂水量對收率的提高甚微。

(4)陶瓷膜分離技術(shù)相比傳統(tǒng)的板框及轉(zhuǎn)鼓過濾在D-核糖發(fā)酵液預(yù)處理過程中更具優(yōu)勢，產(chǎn)品收率可達(dá)96%以上。

［1］ 楊新超，劉建軍，趙祥穎.D-核糖的性質(zhì)、生產(chǎn)及應(yīng)用［J］.中山大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2005，44(增 1):197-202.

［2］ 石坡.離子注入D-核糖產(chǎn)生菌的誘變效應(yīng)及作用機(jī)理研究［D］.石家莊:河北師范大學(xué)，2013:3-8.

［3］ Tao S，Rongqiao H.D-ribose，an overlooked player in type 2 diabetes mellitus［J］.Science China(Life Sciences)，2014，57(3):361.

［4］ 魏轉(zhuǎn)，盧偉，石坡，等.離子注入誘變選育D-核糖生產(chǎn)菌株［J］.中國食品工業(yè)，2014，CFI(8):64-66.

［5］ Wulf P D，Vandamma E J.Production of D-ribose by fermentation［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，1997，48(2):141-148.

［6］ 趙麗麗，陳寧，張克旭.代謝工程在D-核糖生產(chǎn)中研究現(xiàn)狀及應(yīng)用前景［J］.工業(yè)微生物，2002，32(4):42-45.

［7］ 高潤香.模擬移動床連續(xù)離交工藝在D-核糖發(fā)酵液凈化中的應(yīng)用［J］.生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)，2011，7(4):60-63.

［8］ 劉平懷，符健，黃川等.D-核糖對實驗性心肌缺血和心律失常的作用研究［J］.中國藥業(yè)，2005，14(10):26-28.

［9］ 張文楠，黃險峰，宋國強(qiáng).1，2，3-三-O-乙酰基-5-脫氧-D-呋喃核糖合成工藝研究［J］.常州大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2014，26(4):16-18.

［10］ 萬響林.降膜式蒸發(fā)器在D-核糖濃縮中的應(yīng)用［J］.廣東化工，2014，41(9):114.

［11］ 廖湘萍，彭其安，王偉平，等.發(fā)酵法生產(chǎn)D-核糖的研究進(jìn)展［J］.化學(xué)與生物工程，2007，24(3):8-10.

［12］ 任鵬飛，彭其安，楊天勇等.D-核糖發(fā)酵條件研究［J］.生物技術(shù)，2008，18(5):75-77.

［13］ 魏少軍，劉淑云，陳寧，等.D-葡萄糖酸鈉對D-核糖發(fā)酵的影響［J］.天津輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報，2002，41(2):4-6.

［14］ 張志宏，常景玲.D-核糖發(fā)酵條件的優(yōu)化與中試［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(22):10 398-10 440.

［15］ 彭彥峰.發(fā)酵法生產(chǎn)D-核糖參數(shù)分析方法和發(fā)酵工藝研究［D］.河北:河北工業(yè)大學(xué)，2003:13-19.

［16］ 賈秋英，吳兆亮，鄭輝杰等.超濾膜過程去除D-核糖發(fā)酵液中雜蛋白的工藝研究［J］.膜科學(xué)與技術(shù)，2005，25(4):30-32.

［17］ 崔鳳霞，任蓓蕾，王敬臣.膜技術(shù)在D-核糖提取工藝中的應(yīng)用研究［J］.價值工程，2010，7(8):182-183.

［18］ 張津楓，王健剛，鄧國才，等.葡萄糖發(fā)酵液D-核糖含量的高效液相色譜分析［J］.高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報，2001，22(1):43-45.