表面活性蛋白A在固有免疫中的作用及機(jī)制分析

劉玉紅

(湖南省辰溪縣黃溪口中心醫(yī)院湖南辰溪419500)

摘要目的：分析表面活性蛋白A(SP-A)在固有免疫中的作用及機(jī)制。方法：①將大腸桿菌培養(yǎng)至穩(wěn)定期，將其分為SP-A組(SP-A 25mg/L)、BSA組(BSA 25mg/L)、空白對照組，200r/min，37℃培養(yǎng)，觀察SP-A對大腸桿菌的凝集影響。②采用Ficoll密度梯度離心法將健康志愿者外周血進(jìn)行分離，將單核巨噬細(xì)胞分離，分為SP-A組(SP-A 25mg/L)、空白對照組。在顯微鏡下觀察大腸桿菌被單核巨噬細(xì)胞吞噬畫面并攝像。③將大腸桿菌培養(yǎng)至穩(wěn)定期，將其分為SP-A組(SP-A 25mg/L)、BSA組(BSA 25mg/L)、空白對照組，200r/min，37℃培養(yǎng)6h，并測定光密度值(OD)，分析SP-A對大腸桿菌的生長影響。結(jié)果： ①SP-A組大腸桿菌發(fā)生凝集，②單核巨噬細(xì)胞加入SP-A后對大腸桿菌的攝取明顯增加，③加入BSA大腸桿菌生長無顯著變化(P>0.05)，加入SP-A大腸桿菌生長變化顯著(P<0.05)。結(jié)論： SP-A可促進(jìn)大腸桿菌凝集，抑制大腸桿菌生長，并促使單核巨噬細(xì)胞攝取大腸桿菌的量增加，從而發(fā)生固有免疫作用。

關(guān)鍵詞表明活性蛋白A；固有免疫；大腸桿菌；作用機(jī)制

【中圖分類號(hào)】R446.63

尿路感染是較為常見的一種泌尿系統(tǒng)疾病，是成年人群中最常見的一種感染性疾病，大腸桿菌是引起尿路感染最常見的一種致病菌，表面活性蛋白A(surfactant protein A，SP-A)是一種天然免疫分子，最早發(fā)現(xiàn)于肺組織，在調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)及肺部免疫反應(yīng)方面起重要作用[1]。本次研究通過觀察SP-A對大腸桿菌的凝集和生長，以及單核巨噬細(xì)胞對大腸桿菌的攝取，分析表面活性蛋白A在固有免疫中的作用及機(jī)制，現(xiàn)將方法及結(jié)果報(bào)道如下。

1. 材料與方法

1.1 試劑與細(xì)胞

大腸桿菌ATCC 8739(上海復(fù)祥生物科技有限公司)，紫外分光光度計(jì)(上海奧析科學(xué)儀器有限公司)，F(xiàn)icoll分離液(上海研謹(jǐn)生物科技有限公司)，瑞氏-吉姆薩復(fù)合染色液(上海哈靈生物科技有限公司)，表明活性蛋白A(北京華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 觀察SP-A對大腸桿菌的凝集作用

采用分區(qū)劃線法，將大腸桿菌接種于LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)倒置已接種的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，在2ml的LB培養(yǎng)基中加入單克隆大腸桿菌，200r/min培養(yǎng)15h，將其培養(yǎng)至穩(wěn)定期，試驗(yàn)分為SP-A組(SP-A 25mg/L)、BSA組(BSA 25mg/L)、空白對照組。200r/min，37℃搖床培養(yǎng)。1h后，觀察顯微鏡下大腸桿菌的形態(tài)并攝像。

1.2.2 觀察SP-A對大腸桿菌的生長作用

采用分區(qū)劃線法，將大腸桿菌接種于LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)倒置已接種的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，在2ml的LB培養(yǎng)基中加入單克隆大腸桿菌，200r/min培養(yǎng)15h，將其培養(yǎng)至穩(wěn)定期，試驗(yàn)分為SP-A組(SP-A 25mg/L)、BSA組(BSA 25mg/L)、空白對照組。200r/min，37℃搖床培養(yǎng)6h，每小時(shí)采用600nm波長紫外分光光度計(jì)進(jìn)行光密度值測定，并對大腸桿菌生長曲線進(jìn)行繪制。

1.2.3 觀察SP-A影響單核巨噬細(xì)胞攝取大腸桿菌的作用

采用Ficoll密度梯度離心法將單核巨噬細(xì)胞分離，將實(shí)驗(yàn)分為SP-A組(SP-A 25mg/L)、空白對照組。加入U(xiǎn)PEC，不斷震蕩的在37℃下孵育1h，為阻止其吞噬作用，加入1ml冷PBS，采用瑞氏-吉姆薩復(fù)合染色液快速染色，在顯微鏡下觀察大腸桿菌被單核巨噬細(xì)胞吞噬畫面并攝像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS14.0專業(yè)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析檢驗(yàn)，計(jì)量資料錄入形式為"±s"，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，當(dāng)P<0.05時(shí)，表示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異具有顯著意義。

2. 結(jié)果

2.1 大腸桿菌的凝集

SP-A組、空白對照組、BSA組三組均可見到活動(dòng)的細(xì)菌，其中，空白對照組，BSA組大腸桿菌未發(fā)生凝集現(xiàn)象，SP-A組凝集呈團(tuán)塊狀，活動(dòng)性顯著降低。

2.2 大腸桿菌的生長

在0h、1h側(cè)大腸桿菌OD值，SP-A組與空白對照組比較無顯著差異(P>0.05)，在2h后，比較SP-A組與空白對照組OD值，相同時(shí)間點(diǎn)SP-A組明顯降低，P<0.05，加入BSA后無明顯差異，P>0.05，詳見表1。

表1　不同時(shí)間細(xì)菌生長OD值變化(x±s)

注：空白對照組與SP-A組比較，#P<0.05，空白對照組與BSA組比較，*P>0.05。

2.3 觀察單核巨噬細(xì)胞細(xì)胞攝取細(xì)菌

SP-A組的大腸桿菌呈團(tuán)塊狀凝集，單核巨噬細(xì)胞攝取大腸桿菌的量明顯增加，空白對照組可見單核巨噬細(xì)胞周圍分散的大腸桿菌。

3. 討論

表面活性蛋白A是由6個(gè)三聚體平行排列而形成的，含有半胱氨酸的N末端，研究表明，表面活性蛋白A因?yàn)槠洫?dú)特的結(jié)構(gòu)，在調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)及肺部的免疫反應(yīng)方面起著極其重要的作用[2]。表面活性蛋白A的球部CRD能結(jié)合巨噬細(xì)胞表面的信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白，抑制信號(hào)傳遞系統(tǒng)活化，從而抑制炎性反應(yīng)細(xì)胞因子，促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬炎性反應(yīng)細(xì)胞，防止炎性反應(yīng)，減輕組織損傷[3]。

本次研究在LB細(xì)菌培養(yǎng)液中加入表面活性蛋白A，加入后，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的凝集呈團(tuán)塊狀，其活動(dòng)性顯著降低，在未加入表面活性蛋白A的 空白對照組及BSA組，大腸桿菌未發(fā)生凝集，散亂分布在四周。作用2h后，測量SP-A組、BSA組、空白對照組三組的細(xì)菌光密度值，與BSA組及空白對照組比較，SP-A組大腸桿菌光密度值OD顯著下降，即細(xì)菌量顯著減少，P<0.05，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異具有顯著意義。說明表面活性蛋白A能抑制大腸桿菌的生長，隨著時(shí)間延長，抑制效果越顯著。研究表明，表面活性蛋白A能增加細(xì)胞膜的通透性，從而使細(xì)菌發(fā)生凝集，抑制革蘭陰性菌增殖[4]。根據(jù)上述研究結(jié)果可推測，表面活性蛋白A既能避免過度的炎癥反應(yīng)，又對清除病原體保護(hù)機(jī)體有利，維持了免疫穩(wěn)態(tài)。

綜上所述，表面活性蛋白A能直接抑制大腸桿菌的生長，且能夠增加單核巨噬細(xì)胞攝取大腸桿菌，并促進(jìn)大腸桿菌發(fā)生凝集，有利于清除細(xì)菌，從而改善炎癥反應(yīng)狀態(tài)，說明表面活性蛋白A在固有免疫中起著極其重要的作用，為治療慢性腎盂腎炎提供了新策略，對相關(guān)疾病的防治具有深遠(yuǎn)意義。

參考文獻(xiàn)

[1]牛偉靜,丁國華,胡鳳琪，等.表面活性蛋白A在固有免疫中的作用及機(jī)制[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2014,35(2):202-204,208.

[2]陳芳,舒曉明,王冬雪，等.血清肺表面活性蛋白-A,D檢測在多發(fā)性肌炎/皮肌炎合并間質(zhì)性肺病中的意義[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2012,92(31):2182-2185.

[3]胡鳳琪,袁海,王桂榮，等.表面活性蛋白A及D在小鼠尿路感染中的作用及機(jī)制[J].中華腎臟病雜志,2013,29(6):439-443.

[4]常紹鴻,欒斌.毛細(xì)支氣管炎患兒血清肺表面活性蛋白A測定及其意義[J].中國小兒急救醫(yī)學(xué),2012,19(4):424-425.