裘益輝，虞冠鋒，葉星照，董千銅，吳天添，邵時(shí)杰，余震

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 血管外科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 肛腸外科，浙江 溫州 325015；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 胃腸外科，浙江 溫州 325015；4.同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院 普外科，上海 200072）

·論 著·

腦5-羥色胺及其旁路關(guān)鍵酶在術(shù)后疲勞綜合征大鼠模型中的變化

裘益輝1，虞冠鋒1，葉星照2，董千銅3，吳天添3，邵時(shí)杰3，余震4

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 血管外科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 肛腸外科，浙江 溫州 325015；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 胃腸外科，浙江 溫州 325015；4.同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院 普外科，上海 200072）

目的：探討腦5-羥色胺（5-HT）及其旁路關(guān)鍵酶在術(shù)后疲勞綜合征（POFS）大鼠模型中的變化。方法：將64只SD實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為模型組和對(duì)照組（各分為術(shù)后1、3、7、10 d組），模型組行70%中段小腸切除端端吻合術(shù)，對(duì)照組僅行開(kāi)關(guān)腹手術(shù)。分別于術(shù)后1、3、7、10 d取腦組織，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定海馬組織中5-HT的含量，熒光定量PCR法檢測(cè)海馬組織中色氨酸羥化酶1、2（TPH1、TPH2）和吲哚胺-2，3-二加氧酶（IDO）的表達(dá)量。結(jié)果：與對(duì)照組相比，模型組大鼠5-HT的含量分別于術(shù)后1、3 d明顯升高（P＜0.05）；在模型組大鼠中，術(shù)后1、3 d 5-HT的含量均較術(shù)后7、10 d明顯升高（P＜0.05），術(shù)后3 d升至最高（P＜0.05），術(shù)后7、10 d逐漸恢復(fù)正常。與對(duì)照組相比，模型組大鼠TPH1的表達(dá)量于術(shù)后3 d明顯升高（P＜0.05）；在模型組大鼠中，術(shù)后3 d TPH1的表達(dá)量較術(shù)后1、7、10 d明顯升高（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，模型組大鼠TPH2的表達(dá)量分別于術(shù)后1、3 d明顯升高（P＜0.05）；在模型組大鼠中，術(shù)后1、3 d TPH2的表達(dá)量均較術(shù)后7、10 d明顯升高（P＜0.05），術(shù)后3 d升至最高，術(shù)后7、10 d逐漸恢復(fù)正常。與對(duì)照組相比，模型組IDO的表達(dá)量于術(shù)后1 d明顯升高（P＜0.05）；在模型組大鼠中，術(shù)后1 d IDO的表達(dá)量較術(shù)后3、7、10 d明顯升高（P＜0.05）。結(jié)論：在POFS大鼠模型中，5-HT的含量術(shù)后早期明顯升高，其升高與5-HT限速酶TPH1、TPH2的表達(dá)量上調(diào)密切相關(guān)。

術(shù)后疲勞綜合征；5-羥色胺；色氨酸羥化酶；吲哚胺-2，3-二加氧酶；大鼠

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD成年大鼠64只，雄性，體質(zhì)量220～250 g，由中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物均單獨(dú)飼養(yǎng)于清潔的飼養(yǎng)籠內(nèi)，可以自由攝食和飲水，飼養(yǎng)室的溫度保持在20～22 ℃，濕度維持在55%左右，每日明暗時(shí)間比為12 h/ 12 h。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器設(shè)備 甲酸、乙腈購(gòu)于成都金山化學(xué)試劑有限公司；TRIZOL購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；無(wú)水甲醇、異丙醇、氯仿購(gòu)于天津市四友生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR擴(kuò)增kit購(gòu)于上海博仕生物醫(yī)學(xué)服務(wù)中心；膠回收kit購(gòu)于德國(guó)MN公司。Agilent1200高效液相色譜儀購(gòu)自美國(guó)Agilent公司；API4000液質(zhì)聯(lián)用儀購(gòu)自美國(guó)AB公司；Chromolith RP-18 endcapped色譜柱購(gòu)自德國(guó)Merck公司；組織勻漿器購(gòu)自美國(guó)Pro Scientific公司；電泳儀購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司；Nanodrop 1000微量分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；UVP凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)UVP公司；SLAN-96P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自上海宏石醫(yī)療科技有限公司。

1.3 動(dòng)物分組和模型制作 本實(shí)驗(yàn)以SD大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，按體質(zhì)量大小編號(hào)后隨機(jī)分為模型組（n= 32）和對(duì)照組（n=32），各分為術(shù)后1 d組（n=8）、術(shù)后3 d組（n=8）、術(shù)后7 d組（n=8）和術(shù)后10 d組（n= 8）。大鼠在2%戊巴比妥鈉按30 mg/kg腹部皮下注射麻醉后，模型組行70%中段小腸切除端端吻合術(shù)建立POFS大鼠模型[3]，對(duì)照組僅行開(kāi)關(guān)腹手術(shù)。2組大鼠術(shù)前術(shù)后各禁食24 h，不禁水，術(shù)后24 h開(kāi)始自由攝食和飲水。

1.4 腦海馬組織的采集檢測(cè) 2組大鼠分別于術(shù)后1、3、7、10 d用2%戊巴比妥鈉麻醉后，迅速斷頭，在冰面上取出大腦海馬組織，用冰冷的0.9%氯化鈉溶液沖洗除去血液，濾紙拭干稱質(zhì)量，置于液氮固化存放后-80 ℃儲(chǔ)存待測(cè)。采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定腦海馬組織5-HT的含量。色譜條件：流動(dòng)相A為水，流動(dòng)相B為乙腈；質(zhì)譜條件：碰撞氣（CAD）為4 L/min，氣簾氣（CUR）為25 L/min，霧化氣（GS1）為30 L/min，輔助氣（GS2）為40 L/min，噴霧電壓（IS）為5 500 V，去溶劑溫度（TEMP）為500 ℃。采用熒光定量PCR法檢測(cè)海馬組織中色氨酸羥化酶（tryptophan hydroxylase，TPH）1、2和吲哚胺-2，3-二加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）的表達(dá)量。內(nèi)參照18S引物序列：p5為agtcgccgtgc ctaccat，p3為cgggtcgggagtgggtaat；TPH1引物序列：p5為gtgccggcctgctttcttcc，p3為gcgctggttat gctcttgctgtct；TPH2引物序列：p5為catggctccga ccccctctaca，p3為tacgcccgcagttgaccttcttg；IDO引物序列：p5為ggctgcctcccattctgtctta，p3為gc tttcgggtcttgatgctctact。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)用±s表示。模型組與對(duì)照組的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；實(shí)驗(yàn)組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 2組大鼠腦海馬組織TPH2表達(dá)量（n=8，±s）

表3 2組大鼠腦海馬組織TPH2表達(dá)量（n=8，±s）

與對(duì)照組比：aP＜0.05

2 結(jié)果

2.1 2組大鼠的一般情況 與對(duì)照組相比，模型組大鼠術(shù)后體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢，瞇眼，毛發(fā)無(wú)光澤，自我清潔能力差，隨著術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸好轉(zhuǎn)。

2.2 腦海馬組織5-HT的含量 如表1，與對(duì)照組相比，模型組大鼠5-HT的含量分別于術(shù)后1、3 d明顯升高（P＜0.05），術(shù)后7、10 d無(wú)明顯差異。在模型組大鼠中，術(shù)后1、3 d 5-HT的含量均較術(shù)后7、10 d明顯升高（P＜0.05），術(shù)后3 d升至最高（P＜0.05），術(shù)后7、10 d逐漸恢復(fù)正常。對(duì)照組大鼠，術(shù)后1、3、7、10 d間5-HT的含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.5 腦海馬組織IDO的表達(dá)量 如表4，與對(duì)照組相比，模型組大鼠IDO的表達(dá)量于術(shù)后1 d明顯升高（P＜0.05），術(shù)后3、7、10 d無(wú)明顯差異。在模型組大鼠中，術(shù)后1 d IDO的表達(dá)量較術(shù)后3、7、10 d明顯升高（P＜0.05），術(shù)后3、7、10 d間比較無(wú)明顯差異。在對(duì)照組大鼠中，術(shù)后1、3、7、10 d間IDO的表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 2組大鼠腦海馬組織IDO的表達(dá)量（n=8，±s）

表4 2組大鼠腦海馬組織IDO的表達(dá)量（n=8，±s）

與對(duì)照組比：aP＜0.05

表1 2組大鼠腦海馬組織5-HT的含量（n=8，±s）

表1 2組大鼠腦海馬組織5-HT的含量（n=8，±s）

與對(duì)照組比：aP＜0.05

2.3 腦海馬組織TPH1的表達(dá)量 如表2，與對(duì)照組相比，模型組大鼠TPH1的表達(dá)量于術(shù)后3 d明顯升高（P＜0.05），術(shù)后1、7、10 d無(wú)明顯變化。在模型組大鼠中，術(shù)后3 d TPH1的表達(dá)量較術(shù)后1、7、10 d明顯升高（P＜0.05），術(shù)后1、7、10 d間無(wú)明顯差異。在對(duì)照組大鼠中，術(shù)后1、3、7、10 d間TPH1的表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 2組大鼠腦海馬組織TPH1的表達(dá)量（n=8，±s）

表2 2組大鼠腦海馬組織TPH1的表達(dá)量（n=8，±s）

與對(duì)照組比：aP＜0.05

2.4 腦海馬組織TPH2的表達(dá)量 如表3，與對(duì)照組相比，模型組大鼠TPH2的表達(dá)量分別于術(shù)后1、3 d明顯升高（P＜0.05），術(shù)后7、10 d無(wú)明顯差異。在模型組大鼠中，術(shù)后1、3 d TPH2的表達(dá)量均較術(shù)后7、10 d明顯升高（P＜0.05），術(shù)后3 d升至最高，術(shù)后7、10 d恢復(fù)正常。在對(duì)照組大鼠中，術(shù)后1、3、7、10 d間TPH2的表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

腹部大手術(shù)創(chuàng)傷引起機(jī)體一系列復(fù)雜的應(yīng)激反應(yīng)，主要表現(xiàn)為內(nèi)分泌代謝的改變、炎癥反應(yīng)和免疫抑制，容易導(dǎo)致術(shù)后各種并發(fā)癥[5-6]，其中POFS就是最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一。而POFS作為集生理、心理和社會(huì)因素為一體的復(fù)雜并發(fā)癥，在術(shù)后相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間里都嚴(yán)重影響患者術(shù)后的恢復(fù)[7]。雖然國(guó)內(nèi)外學(xué)者建立了一系列評(píng)估方法并采用多模式干預(yù)POFS的發(fā)展且取得一定療效[8-9]，但其病因及發(fā)生機(jī)制尚不明確。POFS的病因是多源性的，主要與患者的心血管功能、營(yíng)養(yǎng)狀況、骨骼肌系統(tǒng)變化、生化標(biāo)記物、手術(shù)類型及心理因素有關(guān)，可以概括為手術(shù)創(chuàng)傷、營(yíng)養(yǎng)狀況、身體適應(yīng)性、細(xì)胞因子及心理學(xué)理論[1]。在本研究前期建立的POFS大鼠模型中，大鼠腹部大手術(shù)后恢復(fù)期三個(gè)腦區(qū)5-HT的含量呈現(xiàn)波動(dòng)性變化[4]。5-HT又名血清素，人體95%的5-HT存在于胃腸道，5%在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，因血腦屏障的存在，血液中的5-HT很難進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，因此中樞5-HT和外周5-HT分屬兩個(gè)獨(dú)立的系統(tǒng)。而中樞5-HT具有廣泛的功能，參與心血管活動(dòng)、覺(jué)醒-睡眠周期、痛覺(jué)、精神情感活動(dòng)和下丘腦-垂體的神經(jīng)內(nèi)分泌活動(dòng)的調(diào)節(jié)[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠中樞5-HT的含量于術(shù)后1、3 d明顯升高，術(shù)后3 d升至最高，術(shù)后7、10 d逐漸恢復(fù)正常。這進(jìn)一步表明5-HT的含量術(shù)后早期明顯升高與POFS的發(fā)生發(fā)展有著重要的聯(lián)系。

腦內(nèi)5-HT神經(jīng)元主要在末梢合成5-HT：色氨酸（Trp）在色氨酸羥化酶（TPH）的催化下生成5-羥色氨酸（5-HTP），再經(jīng)脫羧酶的作用成為5-HT。TPH作為5-HT合成的限速酶，一般認(rèn)為存在兩種分子學(xué)類型，即TPH1和TPH2兩個(gè)亞型，腦海馬組織中兩種亞型都有表達(dá)，水平基本相當(dāng)[11-12]。TPH的活性直接決定5-HT含量的變化，因而TPH調(diào)控影響的研究比5-HT本身含量的研究更有價(jià)值[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示模型組大鼠TPH1的表達(dá)量術(shù)后3 d明顯升高，TPH2的表達(dá)量術(shù)后1、3 d明顯升高，術(shù)后3 d升至最高，術(shù)后7、10 d逐漸恢復(fù)正常。結(jié)合5-HT結(jié)果，我們推測(cè)5-HT的含量術(shù)后3 d升高可能是TPH1 和TPH2共同作用的結(jié)果，而5-HT術(shù)后1 d升高可能TPH2起著更大的作用。在本實(shí)驗(yàn)中，無(wú)論模型組還是對(duì)照組，TPH2的表達(dá)量明顯高于TPH1的表達(dá)量，關(guān)于TPH亞型在海馬中的表達(dá)量值得下一步研究。

5-HT的前體物質(zhì)Trp除了經(jīng)TPH途徑生成5-HT外，還可經(jīng)IDO分解形成犬尿氨酸（5-HT旁路）。IDO廣泛分布于除肝臟以外的組織，主要存在于巨噬細(xì)胞及腦內(nèi)皮細(xì)胞、血管周巨噬細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞，而IDO的活性主要由IL-1β、TNF-α、IFN-γ等促炎細(xì)胞因子激活[13]。一方面，IDO活性的改變直接決定5-HT的前體物質(zhì)Trp的含量進(jìn)而影響中樞5-HT合成的含量；另一方面，IDO可以將5-HT的前體物質(zhì)Trp分解成犬尿氨酸，而犬尿氨酸進(jìn)一步分解為喹啉酸和犬尿酸，前者是強(qiáng)力的N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體激動(dòng)劑，過(guò)度刺激NMDA受體可導(dǎo)致神經(jīng)元性損害，后者是NMDA受體谷氨酸識(shí)別部位的拮抗劑，可以減少NMDA受體的過(guò)度刺激[14]。所以促炎細(xì)胞因子誘導(dǎo)的IDO活性改變可以影響兩者的比率進(jìn)而打破這種神經(jīng)損害保護(hù)平衡。因此5-HT旁路可以通過(guò)中樞促炎細(xì)胞因子的激活，引起下游的NMDA受體的過(guò)度刺激致神經(jīng)退化，最終可能引起POFS。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠IDO的表達(dá)量術(shù)后1 d明顯升高，這就意味著5-HT的前體物質(zhì)Trp減少，而5-HT的含量術(shù)后1 d明顯升高，這可能與5-HT的合成底物Trp進(jìn)入腦內(nèi)足夠多有關(guān)；模型組大鼠IDO的表達(dá)量術(shù)后3 d明顯回落，這可能與促炎細(xì)胞因子回落或者TPH的高表達(dá)調(diào)控有關(guān)。IDO的表達(dá)量術(shù)后明顯升高進(jìn)而影響5-HT旁路及下游NMDA受體的表達(dá)可能是POFS發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一。綜上所述，5-HT在POFS中的作用得到進(jìn)一步證實(shí)，其主要受到其限速酶TPH的調(diào)控。因手術(shù)創(chuàng)傷部位的促炎細(xì)胞因子既可以在外周發(fā)揮作用，又可以進(jìn)入中樞發(fā)揮效應(yīng)，其中IL-1β、TNF-α發(fā)揮著重要作用[15]，所以手術(shù)應(yīng)激引起外周促炎細(xì)胞因子的升高，進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)誘導(dǎo)IDO活性改變，進(jìn)而激活5-HT旁路及其下游產(chǎn)物可能是POFS的發(fā)生機(jī)制之一。

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（本文編輯：胡苗苗）

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（本文編輯：丁敏嬌）

The role of changes of key enzymes of brain 5-hydroxytryptamine and 5-hydroxytryptamine bypass in ratmodel of postoperative fatigue syndrome

QIU Yihui1, YU Guanfeng1, YE Xingzhao2, DONG Qiantong3, WU Tiantian3, SHAO Shijie3, YU Zhen4.1.Department of Vascular Surgery, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Whenzhou, 325015; 2.Department of Anorectal Surgery, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Whenzhou, 325015; 3.Department of Gastrointestinal Surgery, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Whenzhou, 325015; 4.Department of General Surgery, Tenth People’s Hospital Affiliated to Tongji University, Shanghai, 200072

Objective:To explore the role of changes of key enzymes of brain 5-HT and 5-HT bypass in rat model of postoperative fatigue syndrome.Methods:64 SD rats were randomly divided into model group and control group according to the weigh (which both including 1 d, 3 d, 7 d, 10 d group).The rats of model group would be resected the middle 70% small bowel, and control group only undergoing on-off abdominal surgery.The brains were removed on 1 d, 3 d, 7 d, 10 d postoperatively respectively, and we detected the concentration of 5-HT by high performance liquid chromatography and the mRNA expression of TPH1, TPH2, IDO by realtime fuorescence quantitative PCR in hippocampus area.Results: Compared with control group, concentration of 5-HT of model group rats increased signifcantly on 1 d, 3 d postoperatively respectively (P＜0.05).And in model group rats, concentration of 5-HT on 1 d, 3 d increased signifcantly respectively compared with 7 d, 10 d postoperatively (P＜0.05), on 3 d to its highest (P＜0.05), 7 d, 10 d gradually returned to normal.Compared with control group, mRNA expression of TPH1 in model group rats increased signifcantly on 3 d postoperatively (P＜0.05).And inmodel group rats, mRNA expression of TPH1 on 3 d increased signifcantly compared with 1 d, 7 d, 10 d postoperatively (P＜0.05).Compared with control group, mRNA expression of TPH2 in model group rats increased signifcantly on 1 d, 3 d postoperatively respectively (P＜0.05).And in model group rats, mRNA expression of TPH2 on 1 d, 3 d increased signifcantly respectively compared with 7 d, 10 d postoperatively (P＜0.05), on 3 d to its highest, 7 d, 10 d gradually returned to normal.Compared with control group, mRNA expression of IDO in model group rats increased signifcantly on 1d postoperatively (P＜0.05).And in model group rats, mRNA expression of IDO on 1 d increased signifcantly compared with 3 d, 7 d, 10 d postoperatively (P＜0.05).Conclusion:In rat model of postoperative fatigue syndrome, concentration of 5-HT increases signifcantly early postoperatively.Its mechanism refers to up-regulation of mRNA expression of TPH1, TPH2 of 5-HT rate-limiting enzyme.

postoperative fatigue syndrome; 5-hydroxytryptamine; tryptophan hydroxylase; indoleamine 2, 3-dioxygenase; rats術(shù)后疲勞綜合征（postoperative fatigue syndrome，POFS）是外科術(shù)后恢復(fù)期普遍和主要的并發(fā)癥之一，其主要特征表現(xiàn)為肌肉無(wú)力，睡眠時(shí)間增加，集中注意力能力下降，以及一定程度的抑郁，尤其以腹部大手術(shù)后1個(gè)月內(nèi)最為顯著[1-2]。作為一組延緩術(shù)后患者恢復(fù)至正?；顒?dòng)的生理和心理癥狀的統(tǒng)稱，它不僅減弱患者的勞動(dòng)能力，降低患者的生活質(zhì)量，而且延長(zhǎng)康復(fù)時(shí)間，增加醫(yī)療護(hù)理費(fèi)用。近年來(lái)，中樞神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺（5-HT）因可能涉及POFS的發(fā)病機(jī)制而受到關(guān)注。在本研究前期建立的POFS大鼠模型中[3]，我們發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)5-HT水平的波動(dòng)可能與腹部大手術(shù)POFS的發(fā)生發(fā)展有著重要的聯(lián)系[4]。本實(shí)驗(yàn)以此為切入點(diǎn)，研究腦5-HT及其旁路關(guān)鍵酶的變化，探討其在POFS大鼠模型中的作用機(jī)制，為尋找有效的靶點(diǎn)干預(yù)POFS提供理論依據(jù)。

R33

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.02.002

2014-07-10

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81171857）；浙江省衛(wèi)生廳支撐學(xué)科資助項(xiàng)目（11-ZC24）。

裘益輝（1988-），男，浙江溫州人，住院醫(yī)師，碩士。

余震，教授，博士生導(dǎo)師，Email：yuzhen0577@163.com。