王卿，邱婧雯，李陽，沈飛

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熱堿預處理對菊芋莖稈組成和酶水解影響

王卿，邱婧雯，李陽，沈飛

四川農業(yè)大學生態(tài)環(huán)境研究所，四川 成都 611130

王卿, 邱婧雯, 李陽, 等. 熱堿預處理對菊芋莖稈組成和酶水解影響. 生物工程學報, 2015, 31(10): 1459–1467.Wang Q, Qiu JW, Li Y, et al. Effects of hot-NaOH pretreatment on Jerusalem artichoke stalk composition and subsequent enzymatic hydrolysis. Chin J Biotech, 2015, 31(10): 1459–1467.

為了深入了解菊芋莖稈用于生物能源轉化的潛力，在對菊芋莖稈的全稈、韌皮以及髓芯的組成分析基礎上，采用不同濃度的NaOH在121 ℃對菊芋莖稈進行預處理，并對預處理后的莖稈進行酶水解。結果表明：菊芋莖稈具有較高木質素含量(32.0%)，且韌皮中木質素含量最高；莖稈中碳水化合物總含量與傳統(tǒng)農作物秸稈相當，但纖維素含量相對較高(40.5%)，半纖維含量相對較低(19.6%)。經(jīng)不同濃度NaOH預處理后，相對于未處理莖稈，全稈、韌皮以及髓芯中木質素含量分別降低13.1%–13.4%、8.3%–13.5%和19.9%–27.2%，半纖維素含量分別降低了87.8%–96.9%、87.6%–95.0%和74.0%–90.2%。纖維素含量在全稈、韌皮和髓芯中相應增加了56.5%–60.2%、52.2%–55.4%和62.7%–73.2%。酶水解的結果顯示，增加預處理過程中NaOH的濃度，全稈和韌皮的水解率可被提高2.3–2.6倍和10.3–18.5倍。雖然熱NaOH預處理可以有效地改善髓芯水解性能，但經(jīng)過高濃度的NaOH (2.0 mol/L) 預處理，髓芯的水解性能下降明顯。由此可見，菊芋用于生物能源轉化技術中，熱堿法可較好地適用于菊芋秸稈預處理。提高堿濃度，有利于半纖維素和木質素的去除，并實現(xiàn)酶水解糖化產(chǎn)率的提高。但鑒于堿濃度過高會造成髓芯糖產(chǎn)率降低，熱堿預處理菊芋秸稈工藝條件需進一步優(yōu)化。

菊芋莖稈，組分分析，熱堿預處理，酶水解

能源是社會發(fā)展的物質保障，目前所使用的化石燃料日益枯竭，尋找可替代能源已成為當今社會發(fā)展的重中之重。生物質由于其資源豐富、來源廣泛、可再生、低污染等特點，具有較大的能源開發(fā)價值與應用前景?，F(xiàn)已成為能源發(fā)展與開發(fā)的重要組成部分，在各國的能源結構中占有重要地位[1]。目前，在生物能源開發(fā)過程中，為了避免“與人爭糧，與糧爭地”，利用能源植物以及木質纖維素原料進行生物燃料轉化已成為當前研究的重點與熱點[2]。

菊芋L. 生長適應性強，適合在沙漠、灘涂、鹽堿荒地等非宜農土地上生長，具有耐寒、耐旱以及耐鹽堿的特點。其生物學產(chǎn)量較高，一般塊莖產(chǎn)量可達50– 77 t/hm2，莖稈產(chǎn)量可達20–28 t/hm2[3-4]。菊芋塊莖中菊粉含量豐富，占其干基質量的70%–90%[5]。而菊芋莖稈以木質纖維素為主，其中碳水化合物占其干基質量的60%–65%[6]。因此，菊芋已經(jīng)被視為一種有發(fā)展前途的能源作物。

以菊芋的塊莖為原料進行生物燃料開發(fā)，尤其是生物乙醇很早就受到人們的關注[7-8]。近年來，由于生物能源開發(fā)引起的土地資源緊張問題，使得菊芋作為能源植物的開發(fā)與利用重獲重視。目前以菊芋塊莖為原料通過化學或生物的方式進行生物燃料轉化，其主要包括通過生物酶解(菊粉酶) 或者酸解，將菊粉轉化成單糖。然后再通過微生物將其轉化成生物乙醇、生物柴油等生物燃料[9-10]。然而，對菊芋莖稈進行生物能源轉化的研究目前較少，且現(xiàn)有的研究均集中在莖稈與塊莖聯(lián)合轉化工藝方面。然而，這些聯(lián)合工藝中所涉及的菊芋莖稈，均需經(jīng)獨立的預處理后，再與塊莖進行聯(lián)合水解發(fā)酵[6,11-12]。因此，為了有效地利用菊芋莖稈進行生物能源轉化，本文對菊芋莖稈的不同部位的組分進行了分析。并采用熱NaOH預處理法對其不同部位進行預處理，明確預處理對菊芋莖稈不同部位的響應以及對酶水解的影響。為進一步選擇優(yōu)化預處理工藝提供必要的參考。

1 材料與方法

1.1 菊芋莖稈

菊芋(南芋一號) 種植于四川農業(yè)大學成都校區(qū)附近苗圃空地，莖稈采收于2012年11月。莖稈采收后經(jīng)自然風干，手工分離髓芯和韌皮。將各部分及全稈粉碎至40目用于組分測定，粉碎過10目用于預處理。酶水解使用的纖維素酶和纖維二糖酶(Sigma公司，美國)，分別產(chǎn)自里氏木霉ATCC26924和黑曲霉。

1.2 熱NaOH預處理

配制濃度分別為0.5、1.0、2.0 mol/L的NaOH溶液，用于浸漬菊芋莖稈韌皮、髓芯以及全稈30 min (固液比1∶20)。密封后置于121 ℃預處理30 min。冷卻后采用真空抽濾方式對預處理后的濾渣進行沖洗至濾液的pH值為7.0–7.5，收集清洗后的濾渣用于酶水解。

1.3 酶水解

在100 mL螺口三角瓶中加入0.4 g濾渣(干基)，纖維素酶和纖維二糖酶的用量分別為20單位濾紙酶活/g纖維素(20 FPU/g纖維素) 和40單位纖維二糖酶活/g纖維素(40 CBU/g纖維素)，并用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(0.05 mol/L，pH 4.8) 調節(jié)水解體積為20 mL。封口后置于50 ℃、150 r/min的恒溫空氣浴搖床水解72 h。水解過程中定時取樣0.8 mL，密封置于100 ℃干式恒溫器滅活10 min后，13 000 r/min、4 ℃離心5 min。上清液于–18 ℃保存，用于葡萄糖濃度測定。根據(jù)測得水解液中葡萄糖的含量，按照公式(1) 計算纖維素的酶水解率。

1.4 分析方法

預處理前后物料組分分析采用National Renewable Energy Laboratory木質纖維素原料碳水化合物及木質素含量測定方法[13]。

采用高效液相色譜儀(Flexar，PerkinElmer，Inc.，MA，美國) 分析水解液中葡萄糖濃度。在分析過程中，為了減少誤差，采用內標法測定，內標物為0.5 g/L乳糖溶液。以0.05 mol/L的H2SO4為流動相 (流速為 0.8 mL/min)。每次進樣量控制為0.1 mL。糖分離采用色譜柱 (SH1011，Shodex，日本)，柱溫維持60 ℃。葡萄糖濃度檢測采用示差折光檢測器，檢測器溫度為50 ℃。

經(jīng)不同NaOH濃度預處理后菊芋秸稈的結晶度指數(shù)通過X射線衍射儀 (D2 PHASER，Bruker，德國) 在=10–40° 范圍內，以步長為0.02° 測定。以在18° 和22° 附近的衍射強度按公式(2) 計算。

式中，002指002面的最大衍射強度；am指=18° 時衍射強度，即無定形區(qū)的衍射強度。

2 結果與討論

2.1 菊芋莖稈的組分分析

菊芋莖稈全稈以及其韌皮和髓心中的主要組分如表1所示。菊芋莖稈含有豐富的葡聚糖和木聚糖，碳水化合物的總量約占整個莖稈干重的60.1%，說明它具有較好的生物能源轉化的物質基礎。莖稈中纖維素 (組分中的葡聚糖) 含量約為40.5%，半纖維素 (組分中木聚糖、甘露聚糖、半乳聚糖以及阿拉伯聚糖之和) 含量約為19.6%，木質素 (酸溶性木質素和酸不溶性木質素之和) 的含量約為32.0%。莖稈中抽提物和灰分的含量分別為6.1%和2.9%。與常規(guī)的農作物秸稈相比[14-16]，其碳水化合物的總量與玉米、小麥以及水稻等相當，但纖維素含量高于常規(guī)的農作物秸稈 (34%–36%)。半纖維素的各種聚糖組成與農作物秸稈相近，但其含量低于常規(guī)的農作物秸稈 (24%–29%)。較高的纖維素含量，可提高纖維素向葡萄糖轉化的物質潛力，同時較低的半纖維素含量，可降低預處理難度，減少后續(xù)酶水解過程中的位阻效應。而菊芋莖稈中木質素的含量明顯高于傳統(tǒng)的農作物秸稈(12%–17%)，這可能潛在地增加預處理難度。

表1 菊芋莖稈基本組分含量

AIL*refers to acid-insoluble lignin; ASL#refers to acid-soluble lignin.

此外，髓芯中纖維素含量高于韌皮約5.0%，而半纖維素和木質素含量明顯低于韌皮約4.8%和15.8%。從植物生長的角度，菊芋屬高大菊科作物，韌皮中較高木質素含量有利固化細胞壁，增加莖稈的抗壓和抗倒伏能力。而莖稈的髓芯的質地相對疏松，木質素含量較低，這與髓芯主要承擔水分和養(yǎng)分的輸送功能相關，且髓芯中較高的灰分和抽提物含量也可能與此相關。

2.2 不同濃度NaOH預處理對菊芋莖稈主要組分的影響

木質纖維素原料因其結構較為致密，一般需要進行預處理后，才可以較為容易地通過酶水解，將纖維素轉化為葡萄糖。采用不同濃度NaOH在121 ℃條件下對菊芋全稈、韌皮和髓芯分別進行預處理，預處理后物料的組分如表2所示。

整體上，采用熱NaOH預處理法對菊芋全稈、韌皮和髓芯的木質素的去除具有一定的作用。經(jīng)不同濃度的NaOH進行預處理后，全稈中木質素含量相對于未處理全稈含量降低13.1%–13.4%，韌皮中木質素含量降低8.3%–13.5%，而髓芯中木質素含量降低了19.9%–27.2%。隨著預處理的NaOH濃度的提高，全稈、韌皮以及髓芯的木質含量均呈下降趨勢，該趨勢在全稈和韌皮中變化較小，而在髓芯中較為明顯。由此可見，菊芋莖稈的韌皮是決定NaOH預處理過程中木質素去除的關鍵。通過熱NaOH預處理，全稈、韌皮以及髓芯中的半纖維素明顯降低，且隨著NaOH濃度的提高，半纖維素含量下降明顯。相對于未處理的莖稈，全稈中半纖維素含量降低了87.8%–96.9%，韌皮中半纖維素含量降低了87.6%–95.0%，而髓芯中半纖維素含量降低為74.0%–90.2%。由此可見，菊芋莖稈中的髓芯部分，雖然其質地較為疏松，然而其半纖維素去除難度相對較大。由于其在整個莖稈中占有的質量分數(shù)相對較低 (9.1%)，因此，對全稈預處理的半纖維素去除產(chǎn)生的影響不大。在預處理過程中由于一部分木質素和半纖維素被去除，莖稈中纖維素的含量相對于未處理莖稈均有增加，且隨著NaOH預處理濃度的增加，纖維素的含量呈較為明顯的上升趨勢。經(jīng)預處理后，菊芋全稈中纖維素含量相對于未處理的全稈增加了56.5%–60.2%，韌皮中纖維素含量增加了52.2%–55.4%，而髓芯中纖維素含量增加了62.7%–73.2%。整體而言，菊芋莖稈的全稈、韌皮以及髓芯在不同濃度的NaOH預處理作用下，其三大組分表現(xiàn)出的變化趨勢與其他生物質材料 (水稻秸稈、玉米秸稈、百慕大草等) 相 似[17-19]。預處理過程中所表現(xiàn)出木質素的去除作用，主要來自木質素在堿性條件下的溶解，而表現(xiàn)出的半纖維素的去除作用，主要是該組分在較高溫度下具有不穩(wěn)定的性質[20]，以及在堿作用下半纖維素的溶解去除作用[21]。此外，通過NaOH預處理對莖稈中的纖維素產(chǎn)生溶脹效果，可潛在地增大纖維素的無定形區(qū)，有利于菊芋莖稈后續(xù)酶水解的改善[22]。相比于目前研究較多的木質纖維素物理化學處理法 (例如：蒸汽爆破法、氨纖維爆法以及水熱法[20])，在組分去除方面，熱堿預處理菊芋秸稈可以在較低溫度下 (121 ℃)，實現(xiàn)蒸汽爆破法 (180–210 ℃) 以及水熱法 (160–240 ℃) 的典型半纖維素去除功能，同時還具有一定的木質素去除能力。相比于以結構溶脹破壞為主，組分去除功能不明顯的氨纖維爆法，熱堿預處理法對各類木質纖維素結構影響尚不明確，需要進一步研究。

表2 NaOH預處理對菊芋莖稈主要組分的影響

2.3 不同濃度NaOH預處理對菊芋莖稈酶水解的影響

將預處理后的菊芋莖稈的全稈、韌皮以及髓芯，以質量分數(shù)為2.0%的基質濃度，在過量纖維素酶條件下進行水解。并以未處理的全稈、韌皮以及髓芯作為對照，以評估不同濃度NaOH預處理對水解的影響。酶水解過程中水解率與時間的關系如圖1–3所示。

由圖1A可知，隨著酶水解時間的延長，不同NaOH濃度預處理后的韌皮其水解率均表現(xiàn)出上升趨勢。且隨著預處理的NaOH濃度增加，韌皮的水解速率和水解率均表現(xiàn)出明顯的上升。此結果與不同濃度NaOH預處理后韌皮組分的變化相對應。經(jīng)酶水解72 h后，經(jīng)0.5 mol/L NaOH預處理后的韌皮，其水解率為35.9%，而經(jīng)1.0 mol/L和2.0 mol/L NaOH預處理后韌皮水解率分別為53.8%和64.8%。而未經(jīng)預處理的韌皮72 h水解率僅為3.5%。經(jīng)不同濃度NaOH預處理后的韌皮相對于未處理對照，其水解率提高了10.3–18.5倍。

由圖1B可知，經(jīng)不同濃度NaOH預處理后的髓芯，水解率也呈現(xiàn)隨時間顯著上升趨勢，經(jīng)24 h水解后水解率基本保持不變，水解可視為基本結束。由72 h各處理組的水解率可見，隨著預處理的NaOH濃度從0.5 mol/L增加到1.0 mol/L，水解率由71.3%增加到91.6%，隨著NaOH濃度繼續(xù)增加時，水解率則明顯降低(85.2%)。此結果并沒有完全對應預處理后髓芯的木質素和半纖維素組分的變化。水解72 h后，未處理的髓芯的水解也達到39.7%。整體上，相對于未處理髓芯，通過NaOH預處理后，其水解率可提高1.8–2.3倍。

如圖2所示，在相同的酶水解條件，對菊芋莖稈的全稈進行不同濃度NaOH預處理后，全稈的酶水解同樣隨時間呈現(xiàn)明顯的上升趨勢，24 h后各組上升趨勢減緩。提高NaOH的預處理濃度，可以改善全稈的酶水解效果。經(jīng)72 h酶水解后，隨著NaOH濃度的增加，水解率由43.1%增加到49.2%，且濃度由0.5 mol/L提高到1.0 mol/L對水解率改善不明顯。而未經(jīng)預處理的全稈其酶水解率為18.8%。相對于未處理全稈經(jīng)不同濃度的NaOH預處理后，其酶水解率可提高2.3–2.6倍。此外，通過熱NaOH預處理后的菊芋全稈相比于水熱預處理 (180 ℃)，在相同的酶水解方式下，水解率提高16.8%–33.3%，且熱NaOH預處理能耗和設備耐高壓要求較低[23]。

圖1 不同濃度NaOH預處理的髓芯酶水解

圖2 不同濃度NaOH預處理的全稈酶水解

通過上面的分析可以看出，具有高木質素含量特征的菊芋全稈和韌皮，其酶水解性能較好地響應了預處理后木質素和半纖維素的組分變化。這主要是因為通過熱堿處理可以在一定程度上去除原料中的木質素、半纖維素，降低木質素和半纖維素對纖維素酶水解作用的阻礙。同時，熱堿處理還可以使纖維素結晶結構中的氫鍵部分斷裂，產(chǎn)生較多的無定形區(qū)暴露給纖維素酶，改善了酶水解性能[20,22]。而對木質素含量較低的髓芯，在較高濃度NaOH預處理后，雖然其木質素和半纖維素可被較好地去除，然而其水解率卻顯著下降。這可能的原因在于，髓芯木質素和半纖維素含量較低 (表1)，木質素和半纖維素的去除所消耗NaOH量相對較少。因此，過量的NaOH在預處理過程中與無定形纖維素上的自由羥基發(fā)生堿化反應形成堿纖維素[24-25]。因此，可以推測雖然連接堿纖維素每個單元的β-1,4糖苷鍵仍可以被纖維素酶專性水解，但葡萄糖C2位羥基上的H被Na替代，從而導致酶水解的葡萄糖產(chǎn)量降低和水解率偏低。此外，經(jīng)對不同濃度NaOH預處理后的菊芋秸稈各部分的相對結晶度測定發(fā)現(xiàn) (表3)，全稈和韌皮的結晶度隨處理濃度增加呈下降趨勢。而髓芯的結晶度有先下降后升高的趨勢，這可能是造成高濃度NaOH預處理后的髓芯，其水解率下降的原因之一。對預處理后髓芯X光衍射圖譜分析 (圖3) 發(fā)現(xiàn)，在高濃度NaOH預處理后的菊芋髓芯，在=28° 和34° 附近出現(xiàn)2個明顯的晶峰，增加了纖維素體系的結晶區(qū)域，可能是造成高濃度NaOH預處理后髓芯酶水解率降低的另外一個原因。

表3 NaOH預處理后菊芋莖稈的結晶度

除預處理后的髓芯獲得了較高的水解率以外，菊芋的全稈和韌皮的水解率相對未處理的原料有較大提高，但整體較低。從預處理后原料組分不難看出，雖然預處理后半纖維素含量降低較為明顯，然而木質素的去除水平也低，這是導致整體水解率水平較低的直接原因。由此可見，若較好地改善菊芋莖稈的水解效果，需進一步提高堿處理的強度 (延長處理時間、提高處理濃度或提高處理溫度等)。然而，提高堿處理強度，又必然導致髓芯的糖損失。因此，采用熱NaOH預處理菊芋莖稈的工藝仍需進一步兼顧性的優(yōu)化。

圖3 不同濃度NaOH預處理的髓芯的X光衍射圖

3 結論

相比于傳統(tǒng)農作物秸稈，菊芋莖稈具有較高木質素含量的特征 (32.0%)，且韌皮木質素含量最高。碳水化合物含量與傳統(tǒng)農作物秸稈相當，但其中纖維素含量相對較高 (40.5%)，半纖維含量相對較低 (19.6%)。熱堿預處理對菊芋莖稈中半纖維素的去除能力優(yōu)于木質素，且隨著堿濃度的提高，去除效果改善明顯。此外，提高熱堿處理濃度對木質素含量較高的全稈和韌皮部分酶水解糖產(chǎn)率的改善較為明顯。而對于木質素含量較低的髓芯，熱堿處理強度增大會導致糖產(chǎn)率和產(chǎn)量的降低。為了兼顧熱堿處理菊芋秸稈糖產(chǎn)率與處理效果，需要進一步對生產(chǎn)工藝進行優(yōu)化。

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(本文責編 郝麗芳)

Effects of hot-NaOH pretreatment on Jerusalem artichoke stalk composition and subsequent enzymatic hydrolysis

Qing Wang, Jingwen Qiu, Yang Li, and Fei Shen

Institute of Ecological and Environmental Sciences, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, Sichuan, China

In order to explore the possibility of Jerusalem artichoke stalk for bioenergy conversion, we analyzed the main composition of whole stalk, pitch, and core of the stalk. Meanwhile, these parts were pretreated with different NaOH concentrations at 121 °C. Afterwards, enzymatic hydrolysis was performed to evaluate the pretreatment efficiency. Jerusalem artichoke stalk was characterized by relatively high lignin content (32.0%) compared with traditional crop stalks. The total carbohydrate content was close to that of crop stalks, but with higher cellulose content (40.5%) and lower hemicellulose (19.6%) than those of traditional crop stalks. After pretreatment, the lignin content in the whole stalk, pitch, and core decreased by 13.1%–13.4%, 8.3%–13.5%, and 19.9%–27.2%, respectively, compared with the unpretreated substrates. The hemicellulose content in the whole stalk, pitch, and core decreased 87.8%–96.9%, 87.6%–95.0%, and 74.0%–90.2%, respectively. Correspondingly, the cellulose content in the pretreated whole stalk, pitch, and core increased by 56.5%–60.2%, 52.2%–55.4%, and 62.7%–73.2%, respectively. Moreover, increase of NaOH concentration for pretreatment could improve the enzymatic hydrolysis of the whole stalk and pitch by 2.3–2.6 folds and 10.3–18.5 folds, respectively. The hydrolysis of pretreated stalk core decreased significantly as 2.0 mol/L NaOH was employed, although the increased NaOH concentration can also improve its hydrolysis performance. Based on these results, hot-NaOH can be regarded as an option for Jerusalem artichoke stalk pretreatment. Increasing NaOH concentration was beneficial to hemicellulose and lignin removal, and consequently improved sugar conversion. However, the potential decrease of sugar conversion of the pretreated core by higher NaOH concentration suggested further optimization on the pretreatment conditions should be performed.

Jerusalem artichoke stalk, composition analysis, hot-NaOH pretreatment, enzymatic hydrolysis

10.13345/j.cjb.150060

January 29, 2015; Accepted: April 10, 2015

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