晏龍，張學(xué)忠，譚建林，牛之瑞，任新軍，馮雷

（云南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，云南昆明650223）

HPLC法測定面粉中曲酸和過氧化苯甲酰的含量

晏龍，張學(xué)忠，譚建林*，牛之瑞，任新軍，馮雷

（云南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，云南昆明650223）

建立了面粉中曲酸和過氧化苯甲酰的高效液相色譜法的分析方法。面粉經(jīng)水浸泡提取，甲醇定容后，取濾液經(jīng)C18柱分離，以甲醇和0.02mol/L乙酸銨為流動相，采用PDA檢測器對樣品進行檢測，檢測波長為230 nm和270 nm。結(jié)果表明，在1μg/mL～50μg/mL添加范圍內(nèi)曲酸呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，R2=0.999 7，回收率在98.8%～99.7%，方法的檢出限為1.0μg/g；在0.5μg/mL～25μg/mL添加范圍內(nèi)過氧化苯甲酰呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，R2=0.999 9，回收率在97.2%～99.4%之間，方法的檢出限為0.5μg/g。

面粉；曲酸；過氧化苯甲酰；高效液相色譜法

曲酸是一種新型的生物天然防腐劑，是由醫(yī)藥級原料經(jīng)微生物發(fā)酵制成的具弱酸性的有機化合物[1]。曲酸應(yīng)用廣泛，在食品領(lǐng)域主要可以作為一種添加劑，起到保鮮、防腐、抗氧化作用[1-2]。曲酸在中國還未認(rèn)定有致癌性，但南京大學(xué)化學(xué)系的有關(guān)專家認(rèn)為曲酸分子式中的吡喃是與苯一樣的方向性化合物，從理論上講是和苯一樣有致癌性[3]。此外曲酸中的羥基也可使人體內(nèi)積累游離基，這也有致癌性[4]。日本政府指出曲酸具有致癌性，禁止將曲酸作為食品添加劑使用[5]。過氧化苯甲酰是一種強氧化劑，極不穩(wěn)定，易燃燒。過氧化苯甲酰能對面粉起到漂白和防腐的作用，過氧化苯甲酰易水解成苯甲酸，而過多苯甲酸可能會導(dǎo)致肝、腎出現(xiàn)病理變化[6-7]。2011年5月1日起，衛(wèi)生部禁止在面粉的生產(chǎn)中添加過氧化苯甲酰。

目前大多數(shù)文獻都采用比色法[8-9]、高效液相色譜法[10-11]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[3]對曲酸和過氧化苯甲酰進行單獨檢，本文采取水-甲醇體系提取面粉中曲酸和過氧化苯甲酰，過氧化苯甲酰水解成苯甲酸，然后使用高效液相色譜法同時檢測面粉中曲酸和苯甲酸的含量。

1 材料與方法

1.1 試劑

曲酸（純度﹥99%）、過氧化苯甲酰標(biāo)準(zhǔn)品（純度﹥99%）：百靈威；苯甲酸（1.00mg/mL）：國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；甲醇（色譜純）：德國Meker公司；超純水（＞18.2 MΩ）：德國Sartorius公司；乙酸銨（分析純）：上海試四赫維化工有限公司；冰乙酸（分析純）：上海申博化工有限公司。

0.02mol/L乙酸銨溶液：稱取1.54 g乙酸銨用水溶解，調(diào)節(jié)pH在5～6，用水定容至1 L。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜儀：日本Shimadzu公司LC-20A型，PDA檢測器；電子天平：德國Sartorius公司CPA225D型；0.22μm微孔有機系濾膜：天津津騰公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品的配制

準(zhǔn)確稱取曲酸的標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到1.0mg/mL的一級標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，于4℃避光保存。取曲酸一級標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.5mL和苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品0.25mL于10mL容量瓶中，用甲醇定容，得曲酸和苯甲酸的二級標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4℃避光保存。臨用前，用水將二級標(biāo)準(zhǔn)儲備液逐級稀釋成標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（曲酸1、5、10、25、50μg/mL；苯甲酸0.5、2.5、5、12.5、25μg/mL）。

準(zhǔn)確稱取過氧化苯甲酰的標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到1.0mg/mL的一級標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，于4℃避光保存。取曲酸一級標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.5mL和過氧化苯甲酰一級標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.25mL于10mL容量瓶中，用水定容，得曲酸和過氧化苯甲酰混合標(biāo)液，于4℃避光保存，待加標(biāo)使用。

1.4 色譜條件

色譜柱為Inertsil ODS-SP（C18：5μm，4.6×150mm Column），流動相A為0.02mol/L乙酸銨溶液，流動相B為甲醇，流速：1.0mL/min；檢測波長：230 nm，進樣量：10μL；柱溫：35℃，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table1 Gradient elution program

1.5 樣品前處理

取5 g樣品于50mL比色管，加入10mL乙酸銨的流動相漩渦混合1min，超聲30min，用甲醇定容至刻度線，搖勻，靜置，取上層清液用0.22μm微孔有機系濾膜過濾于進樣品瓶中待上機檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取試劑的選擇

有研究表明曲酸在二元混合提取溶劑中比單一的提取試劑提取效率高，而過氧化苯甲酰在國標(biāo)中則要求加碘試劑，按國標(biāo)中加碘試劑之后，230 nm的檢測下會出現(xiàn)一個很大的吸收峰，會對檢測形成一定的干擾。經(jīng)試驗，用甲醇和水的混合提取液浸泡也能提取過氧化苯甲酰并使其水解成苯甲酸，并且回收率也能達到滿意的效果。

曲酸在流動相pH≥7時，色譜峰拖尾很嚴(yán)重，然而在pH＜7時，色譜峰拖尾明顯改善，在pH＜6時不再有明顯變化，根據(jù)這一現(xiàn)象，考慮曲酸在不同pH的提取液時，效果是否不同，經(jīng)試驗，把水相調(diào)節(jié)在pH分別為3、4、5和純水時，曲酸其回收率分別為99.3%、99.5%、100.9%、99.6%，苯甲酸其回收率分別為99.2%、99.2%、100.8%、99.6%，由此可見回收率在pH等于5時相對提高一些，所以提取液水相選擇乙酸銨流動相。

2.2 檢測波長的選擇

曲酸和苯甲酸的紫外吸收不同，根據(jù)2種組分的紫外吸收圖譜（見圖1和圖2），選擇230 nm和270 nm分別檢測，發(fā)現(xiàn)曲酸在270 nm下檢測，其響應(yīng)值并未比在230 nm下檢測提高很多，而且在270 nm檢測時，雜質(zhì)的出峰也比在230 nm時響應(yīng)更高（圖4），所以最終檢測波長定為230 nm。曲酸和苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖見圖3。

圖1 曲酸的紫外吸收譜圖Fig.1 UV absorption spectra of kojic acid

圖2 苯甲酸的紫外吸收譜圖Fig.2 UV absorption spectra of benzoyl peroxide

圖3 曲酸（1）和苯甲酸（2）標(biāo)準(zhǔn)色譜圖Fig.3 Typical HPLC chromatograms of kojic acid（1）and benzoyl peroxide（2）

2.3 線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

曲酸在1.0μg/mL～50μg/mL內(nèi)線性良好，線性方程為：y=1.876 151 7×107x-1.619 526×104，相關(guān)系數(shù)為0.999 8；根據(jù)信噪比（RSN=3）計算，儀器檢出限為0.1μg/m L，樣品檢出限為1.0μg/g，過氧化苯甲酰在0.5μg/mL～25μg/mL內(nèi)線性良好，線性方程為：y= 7.169 433×107x-2.357 799×103，相關(guān)系數(shù)為0.999 9；根據(jù)信噪比（RSN=3）計算，儀器檢出限為0.05μg/mL，樣品檢出限為0.5μg/mL。

2.4 回收率和精密度

在空白樣品中添加5、10μg/g的曲酸和2.5、5μg/g的過氧化苯甲酰進行加標(biāo)回收試驗，由表2可見，曲酸的回收率范圍為98.8%～99.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏均差小于0.5%；過氧化苯甲酰的回收率范圍為97.2%～99.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏均差小于1%。

表2 曲酸空白樣品加標(biāo)回收率（n=6）Table2 Recoveries of kojic acid in blank sample（n=6）

2.5 樣品檢測結(jié)果

按照本方法對25個面粉樣品進行分析，均未檢測出曲酸和過氧化苯甲酰，圖4為空白樣品色譜圖、圖5為典型樣品加標(biāo)后的色譜圖。從圖5中可以看出，樣品中的曲酸和苯甲酸很好的被分離，且無干擾峰。

3 結(jié)論

圖4 空白樣品的色譜圖Fig.4 Chromatograms of blank sample

圖5 樣品加標(biāo)色譜圖（曲酸（1）和苯甲酸（2）加標(biāo)量分別為10μg/g，5μg/g）Fig.5 Chromatograms of quality control with kojic acid（10μg/g）and benzoyl peroxide（5μg/g）

在本方法確定的前處理及色譜條件下，樣品的曲酸平均回收率為99.28%，RSD<0.5%，過氧化苯甲酰平均回收率為98.74%，RSD<1%。曲酸回收率穩(wěn)定在98.8%～99.7%之間，過氧化苯甲?；厥章史€(wěn)定在97.2%～99.4%之間，曲酸和過氧化苯甲酰穩(wěn)定性良好。本方法具有靈敏度高、損失小回收率高的特點，適合面粉中曲酸和過氧化苯甲酰的快速檢測。

[1] 顧娟紅,楊天宇.曲酸的安全性及檢測方法研究進展[J].理化檢驗,2012(2):125-127

[2] 趙新河,李枚秋,鐘秋平.曲酸及其衍生物的研究進展[J].中國釀造,2007(10):4-7

[3]黃娟,劉艷,丁濤.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定食品中曲酸[J].色譜,2012(6):578-583

[4]劉彥芳,姚晨之,王佩維.化妝品及原料中有害物質(zhì)的分析研究進展[J].中國日用化學(xué)工業(yè)研討會,2007:97-103

[5]孫微,陶文沂.曲酸在食品添加劑中的應(yīng)用[J].食品與發(fā)酵工業(yè), 1997(1):69-72

[6]李偉,趙全年,宋衛(wèi)東.過氧化苯甲酰毒性的研究進展.疾病監(jiān)測與控制[J],2010(7):391-392

[7]朱文杰,茅力,王建,等.面粉中過氧化苯甲酰檢驗方法的研究進展[J].環(huán)境衛(wèi)生學(xué)雜志,2012(2):194-199

[8] 陳菲.比色法測定曲酸霜中曲酸的含量[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué), 1997(4):52-53

[9]路純明.過氧化苯甲酰的測定與應(yīng)用研究[J].分析科學(xué)學(xué)報, 1999(5):402-405

[10]中國檢驗檢疫科學(xué)研究院.SN/T 1499-2004《化妝品中曲酸的檢測方法液相色譜法》[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2005:1-6

[11]國家糧食局谷物油脂化學(xué)研究所,國家糧油質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心. GB/T 22325-2008《小麥粉中過氧化苯甲酰的測定高效液相色譜法》[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2001:1-7

Detection of Kojic Acid and Benzoyl Peroxide of Wheat Flour by HPLC

YAN Long，ZHANG Xue-zhong，TAN Jian-lin*，NIU Zhi-rui，REN Xin-jun，F(xiàn)ENG Lei
（Yunnan Institute of Product Quality Supervision and Inspection，Kunming650223，Yunnan，China）

An analytical method based on high performance liquid chromatography（HPLC）was developed for the determination of kojic acid and benzoyl peroxide of wheat flour.Sample preparation involved extraction using water，the extraction was fixed volume with methanol.Kojic acid and benzoyl peroxide was separated on a C18 column using gradient elution with a mobile phase of 0.02mol/L ammonium acetate/methanol solution at the flow rate of 1.0mL/min，the HPLC-PDA chromatogram of analytes was recorded at230 nm and 270 nm.The results showed that kojic acid（R2=0.999 7，in the range of1μg/mL-50μg/mL）and benzoyl peroxide（R2=0.999 9，in the range of0.5μg/mL-25μg/mL）showed good linearity over the concentration range.The recovery and limit of determination（LOD）varied from 98.8 to 99.7%，from 97.2 to99.4%，1.0μg/g and 0.5μg/g，respectively. This method had used for kojic acid and benzoyl peroxide in wheat flour to its simple and reliable.

wheat flour；kojic acid；benzoyl peroxide；HPLC

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.03.029

2013-11-08

晏龍（1988—），男（漢），大專，研究方向：食品中非法添加劑的檢測。

*通信作者：譚建林（1985—），男（漢），碩士研究生。