姚霞，明紅梅，*，周健，許德富，王小軍，朱莉莉，陳曉旭

（1.四川理工學院生物工程學院，四川自貢643000；2.瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州646000）

瀘型大曲冬夏兩季培菌期微生態(tài)的比較研究

姚霞1，明紅梅1，*，周健1，許德富2，王小軍2，朱莉莉1，陳曉旭1

（1.四川理工學院生物工程學院，四川自貢643000；2.瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州646000）

大曲的質量與大曲微生態(tài)的微生物種類、數(shù)量及理化指標等相關。通過對瀘型大曲冬夏兩季培菌期大曲微生態(tài)指標跟蹤檢測，并將冬夏兩季培菌期大曲微生態(tài)指標進行比較，結果表明：冬季大曲品溫比夏季低，水分散失比夏季慢；冬季大曲總體微生物數(shù)量比夏季多，微生物的種類與夏季相當；冬季大曲氨態(tài)氮含量和糖化力均比夏季高，但酯化力比夏季低。

瀘型大曲；培菌期；微生態(tài)

大曲在白酒釀造中是一種糖化發(fā)酵劑[1]，其主要作用是在釀酒過程中把原料中的淀粉或其他糖分轉變成葡萄糖再生成酒。除此以外，還具有提供菌源、糖化發(fā)酵、投糧和生香等作用[1]。用大曲釀酒是我國獨特的釀酒工藝，大曲釀酒的基礎是大曲中的微生物[2]。大曲為微生物的生長繁殖提供了各種營養(yǎng)物質和適宜的環(huán)境條件，同時，這些豐富的微生物類群在大曲中生長和代謝，形成了白酒釀造過程中所需要的各種酶及豐富的代謝產(chǎn)物，使大曲具有糖化力、發(fā)酵力、酯化力和蛋白質分解能力等多種功能[3]，其代謝產(chǎn)物也是白酒中的香味物質或香味前體物質，進而影響白酒品質[4]。

大型酒廠一般擁有自己的制曲車間，不僅供本廠使用，同時也作為商品，對外銷售。生產(chǎn)優(yōu)質大曲是釀酒產(chǎn)業(yè)和釀酒人的共同愿望。大曲質量的好壞與大曲微生態(tài)密切相關，受季節(jié)、地域、溫度、環(huán)境微生物區(qū)系等多種因素的影響，大曲微生態(tài)呈現(xiàn)不同的差異，進而導致大曲質量參差不齊。而大曲微生態(tài)變化最顯著的時期為大曲的培菌期。因此，本研究主要針對冬夏兩季培菌期瀘型大曲的微生態(tài)指標（微生物種類、數(shù)量及理化指標等）進行對比研究，以期為改進制曲工藝，進一步提高濃香型大曲的質量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究的樣品為冬季1月和夏季8月培菌期的中高溫大曲曲樣，由瀘州老窖制曲廠提供。

1.2 曲樣

大曲安曲完成以后開始取樣，取樣時間點分別為第0、1、3、5、7、10天，每次取底樓庫房不同的五點處的大曲，然后粉碎混合均勻取200 g。

1.3 培養(yǎng)基

霉菌采用虎紅瓊脂培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術有限責任公司；酵母菌采用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基[5]，細菌和芽孢桿菌采用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.4 大曲微生物分離計數(shù)

1.4.1 大曲菌懸液制備

將大曲粉碎混合均勻在無菌環(huán)境中稱取1g曲樣，放入裝有99mL無菌水和玻璃珠的三角瓶中，在搖床上振蕩30min，充分打散混勻菌懸液，并制成10-2菌懸液，靜置澄清，取上清液做10倍逐級稀釋至適當倍數(shù)[6]。

1.4.2 芽孢細菌計數(shù)

同上，無菌稱取1 g曲樣裝有99mL無菌水和玻璃珠的三角瓶中，搖床振蕩30min，取上層菌懸液，在80℃水浴中處理10min，殺死非芽孢菌。然后進行稀釋，取10-2、10-3、10-4稀釋度菌懸液進行平板涂布，37℃倒置培養(yǎng)1 d～2 d，平板計數(shù)[7]，并結合鏡檢。

1.4.3 細菌、霉菌和酵母菌的計數(shù)

細菌、霉菌、酵母菌的菌懸液制備方法同芽孢菌，制好菌懸液后梯度稀釋，取10-3和10-4和10-5進行平板涂布，細菌在37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)1 d～2 d，霉菌和酵母菌在28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2 d～3 d，然后進行平板計數(shù)[7]。

1.5 理化指標的測定

1.5.1 品溫測定

取樣時將水銀溫度計插入大曲曲心中，待溫度平衡時讀取溫度，即為大曲品溫，每次選取庫房3個不同坯層大曲測量品溫，最后求均值。

1.5.2 檢測分析

部分大曲理化指標：水分測定、酸度、糖化力、酯化力和氨態(tài)氮的測定參照文獻[1，8-9]進行。

2 結果與分析

2.1 大曲品溫及水分變化趨勢

在大曲培菌期，微生物的大量生長繁殖消耗了大曲中的營養(yǎng)物質、空氣中的氧，產(chǎn)生大量的生物熱，使大曲的品溫逐漸升高，大曲內部逐漸形成微氧環(huán)境。在高溫和微氧的作用下，部分不耐熱菌和好氧菌的生長受到抑制或停止，大曲品溫開始降低。水分含量隨著大曲品溫的升高快速的蒸發(fā)，大曲的水分含量一直呈下降的趨勢。

在培菌期，不同季節(jié)大曲品溫變化趨勢見圖1，不同季節(jié)大曲含水量變化趨勢見圖2。

圖1 冬夏兩季培菌期大曲品溫變化趨勢統(tǒng)計結果Fig.1 The Daqu temperature change trend statistical results during bacteria culture period of winter and summer

圖2 冬夏兩季培菌期大曲含水量變化趨勢統(tǒng)計結果Fig.2 The Daqu moisture content change trend statistical results during bacteria culture period of winter and summer

由圖1可以看出，冬季大曲品溫整體變化趨勢是逐漸升高，培菌后期降低。但安曲時大曲品溫稍高于第1天的大曲品溫，可能是機械加工大曲產(chǎn)生了摩擦熱所致。在第7天左右品溫達到最高，升到60℃左右。夏季大曲品溫整體變化趨勢也是先升高后降低。在第7天左右品溫達到最高，升到65℃左右。總體來看，夏季大曲品溫要高于冬季。

由圖2可以看出，無論冬季還是夏季，大曲水分含量均逐漸降低，夏季大曲水分散失速率比冬季快。夏季大曲含水量在第10天最低，達到16%左右，冬季大曲含水量在第10天最低，達到23%左右。

2.2 培菌期微生物統(tǒng)計結果

2.2.1 冬夏兩季培菌期細菌和芽孢細菌的變化趨勢

在培菌期中，不同季節(jié)細菌的變化趨勢見圖3，不同季節(jié)的芽孢細菌變化趨勢見圖4。

圖3 冬夏兩季培菌期大曲細菌變化趨勢統(tǒng)計結果Fig.3 TheDaqu bacteria change trend statistical results during bacteria culture period of winter and summer

圖4 冬夏兩季培菌期大曲芽孢菌變化趨勢統(tǒng)計結果Fig.4 The Daqu spore bacteria change trend statistical results during bacteria culture period of winter and summer

由圖3可知，在培菌安曲時（即0時）冬季的細菌數(shù)量沒有夏季的多，隨著時間的延長冬季大曲細菌數(shù)在培菌期逐漸增多，而夏季細菌數(shù)在培菌初期逐漸升高，在第6天左右達到最高，隨后降低，到培菌末期稍有回升。這是因為大曲的微生物是由糧食自身攜帶的微生物和空氣中的微生物自然接種而來[1]，故冬季大曲培菌安曲時檢測的細菌數(shù)不及夏季的高。隨著培菌時間延長大曲品溫逐漸升高，這給細菌生長繁殖提供適宜的溫度條件，故在培菌初期（0～3 d）無論冬季還是夏季細菌不斷繁殖，數(shù)量不斷增加。

在培菌中期（3 d～7 d），隨著時間的延長，品溫升高較快，冬季培菌在第6天品溫達到50℃左右，在第7天品溫達到60℃左右，這已經(jīng)超過了一般細菌的最適生長溫度，部分不耐熱細菌被殺死，小部分耐熱細菌得以存活，一部分細菌以芽孢的形式度過高溫期，如圖4所示，這與部分耐熱芽孢菌繼續(xù)生長繁殖有關[10]，所以冬季培菌期中期細菌數(shù)量呈緩慢增長趨勢；夏季培菌在第5天品溫達到60℃左右，第7天品溫達到65℃，這已經(jīng)遠遠超過一般細菌的最適生長溫度，大部分不耐熱細菌被殺死，部分芽孢菌也被殺死?？赡苌贁?shù)嗜熱芽孢菌仍能生長繁殖，如圖4所示的芽孢菌變化趨勢，所以，夏季培菌中期細菌數(shù)量呈先下降后上升趨勢。

在培菌末期（7 d～10 d），無論冬季還是夏季，品溫下降，環(huán)境中微生物和部分耐熱細菌繼續(xù)繁殖，部分芽孢菌復蘇繁殖，如圖3、圖4所示，細菌和芽孢菌都呈增長趨勢。

2.2.2 冬夏兩季培菌期霉菌、酵母菌的變化趨勢

在培菌期，不同季節(jié)的霉菌的變化趨勢見圖5，不同季節(jié)酵母菌變化趨勢見圖6。

由圖5可知，在安曲時冬季的霉菌數(shù)量比夏季的低，冬夏兩季菌體數(shù)量變化趨勢都是先增加后降低。冬季霉菌的總體數(shù)量要稍多于夏季。

圖5 冬夏兩季培菌期大曲霉菌變化趨勢統(tǒng)計結果Fig.5 The Daqu mycetes change trend statistical results during bacteria culture period of winter and summer

圖6 冬夏兩季培菌期大曲酵母菌變化趨勢統(tǒng)計結果Fig.6 The Daqu saccharomycetes change trend statistical results during bacteria culture period of winter and summer

培菌前期，冬夏兩季大曲霉菌數(shù)量急劇增加，夏季增長速度比冬季的快。培菌中期，冬季和夏季大曲霉菌數(shù)量開始減少，冬季品溫最高達到60℃左右，夏季品溫達到65℃，受大曲品溫的影響[11]，高溫抑制霉菌生長繁殖，同時大曲水分散失，不利于霉菌的生長，大部分霉菌死亡。在培菌末期，冬季大曲霉菌數(shù)量有所回升，而夏季霉菌數(shù)量一直下降，這是因為在培菌末期，冬季大曲品溫在40℃左右，水分含量在23%左右，一部分存活的霉菌孢子能夠再次生長繁殖；夏季的大曲溫度還在55℃以上，水分含量在16%左右，不利于霉菌孢子的生長繁殖。

由圖5、圖6對比可知，冬夏兩季培菌期酵母菌的數(shù)量變化趨勢和霉菌數(shù)量的變化趨勢接近。一方面，酵母菌和霉菌相似，也受到大曲品溫和含水量影響[12]；另一方面，由于酵母菌的生長繁殖有賴于霉菌[13]，霉菌在生長繁殖過程可以產(chǎn)生大量的淀粉酶，將淀粉水解為葡萄糖，為酵母菌生長繁殖提供能源物質，因此，酵母菌數(shù)量一定程度上受到霉菌數(shù)量的影響。

2.3 培菌期部分理化指標測定結果

在培菌期，冬季理化指標測定結果見圖7，夏季理化指標測定結果見圖8。

圖7 冬季理化指標測定結果Fig.7 Physical and chemical index determination results in winter

圖8 夏季理化指標測定結果Fig.8 Physical and chemical index determination results in summer

從圖7、圖8變化趨勢來看：在培菌期冬季和夏季的理化指標變化趨勢總體一致。酯化力和氨態(tài)氮是呈現(xiàn)逐漸上升的整體趨勢，酸度的變化趨勢接近，糖化力呈先降后升的變化趨勢。

這些變化都與微生物生長繁殖代謝息息相關。在整個培菌期，一直有微生物進行生長繁殖，隨著發(fā)酵的進行，大量的營養(yǎng)物質被消耗，產(chǎn)生、積累一些代謝產(chǎn)物和各種酶類，如淀粉酶，蛋白酶，酯化酶等。因此，從總體的趨勢來看，酯化力、氨態(tài)氮含量和糖化力呈現(xiàn)上升的趨勢，同時中間會有波動現(xiàn)象，這是因為隨著發(fā)酵的進行，不同的時期的優(yōu)勢菌群不一樣，如發(fā)酵前期細菌、酵母占據(jù)優(yōu)勢，隨后大曲酸度升高，霉菌開始大量增殖，當大曲達到頂溫時，由于高溫微氧的篩選作用，這時候耐熱微生物開始占據(jù)優(yōu)勢，而不同時期的優(yōu)勢菌群所產(chǎn)酶類和代謝產(chǎn)物有較大的差別，這就導致在各種酶類積累的過程中，雖然整體呈現(xiàn)上升的趨勢，但是有一定的波動性。

從圖7、圖8理化指標測定結果來看：在培菌末期，夏季的酯化力是冬季的1.6倍左右，而冬季氨態(tài)氮含量是夏季的1.25倍左右，酸度在冬夏兩季差別不明顯。冬季和夏季糖化力在最開始都很高，后來降低，培菌末期又快速增長，最終檢測的糖化力冬季是夏季的2.4倍左右。原因分析主要有3個方面：第一，大曲品溫和含水量影響微生物的生長繁殖，微生物菌群菌系消長[14]過程又影響大曲理化指標變化。夏季大曲最高品溫高于冬季，水分散失多于冬季，冬季總體微生物數(shù)量多于夏季，特別是與蛋白酶分泌有關的細菌、霉菌數(shù)量均高于夏季，這就導致冬季大曲的氨態(tài)氮[15]含量要高于夏季；第二，霉菌是大曲糖化力的主要動力來源[2]，冬季溫度和濕度條件適宜霉菌生長繁殖，因此，冬季大曲霉菌數(shù)量比夏季的多，同時酶的活力和溫度有關，溫度高酶易失活，這就導致冬季大曲的糖化力比夏季的高；第三，夏季大曲品溫比冬季的高，在高溫的篩選作用下，夏季大曲芽孢菌數(shù)量較多，而芽孢菌是代謝產(chǎn)生酯化酶的功能菌之一[2]，因此，在培菌末期，夏季大曲的酯化力比冬季的高，可能與芽孢菌的數(shù)量豐富有關，但還需要進一步研究。

3 結論

本研究利用微生物可培養(yǎng)技術跟蹤分析培菌期大曲中各類微生物，結果發(fā)現(xiàn)，細菌和霉菌在大曲微生物類群中占優(yōu)勢，而酵母菌數(shù)量相對較少。

大曲的理化指標和微生物類群、數(shù)量在一定程度上反映了大曲的品質，優(yōu)質曲的微生物數(shù)量和種類比普通曲豐富，酯化力、糖化力、氨態(tài)氮含量也高于普通曲[3]。本研究結果表明，冬夏兩季培菌期大曲微生態(tài)存在一定的差異：培菌期冬季的微生物總數(shù)量要多于夏季；夏季的酯化力高于冬季；冬季的糖化力和氨態(tài)氮含量要高于夏季。培菌期大曲微生態(tài)差異的原因主要受季節(jié)溫度的影響。大曲的微生態(tài)隨著轉化發(fā)酵期和后期的貯存，還在進一步發(fā)生變化，有待后續(xù)研究。

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Comparative Research of the Microbial Ecology in the Luzhou Daqu during Cultivation in Winter and Summer

YAO Xia1，MING Hong-mei1，*，ZHOU Jian1，XU De-fu2，WANG Xiao-jun2，ZHU Li-li1，CHEN Xiao-xu1
（1.Sichuan University of Science&Engineering of Bioengineering Institute，Zigong643000，Sichuan，China；2.Luzhou LaoJiao ComPany，Luzhou 646000，Sichuan，China）

The quality evaluation of daqu is related to many factors，such as the species and numbers of the microorganisms，the physical-chemical indexes，etc.By tracking and detection of the Micro ecological indicators in winter and summer about Luzhou laojiao Daqu which is during the bacteria culture period.At the same time，the microecological index of the winter and the summer are compared，the results shoed that：the product temperature in winter was lower than in summer，the rate of moisture loss in winter was slower than in summer，too；The microbe quantity of Daqu in winter was more than summer's，the microbial species in winter and summer are equally.The ammonia nitrogen content and the saccharifying power of Daqu in winter is higher than in summer，but the esterifying power of Daqu in winter was lower than in summer.

Daqu of Lu type；bacteria culture period；microecological

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.03.034

2014-09-27

瀘州市科技局應用基礎項目（2011-S-28）；瀘州老窖科研獎學金項目（13ljzk04）；釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室項目（NJ2011-13）；四川省高等教育質量工程項目（2011-659）

姚霞（1988—），女（漢），在讀碩士研究生，研究方向：釀酒微生物研究及應用。

*通信作者：明紅梅（1971—），女（漢），副教授，從事釀酒微生物研究。