許春平，劉遠(yuǎn)上，李萌姍，趙姍姍，史超文

（1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州450002，2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南鄭州450002）

銅色牛肝菌活性胞外多糖的發(fā)酵優(yōu)化研究

許春平1，劉遠(yuǎn)上1，李萌姍1，趙姍姍1，史超文2

（1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州450002，2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南鄭州450002）

選擇發(fā)酵液中的胞外多糖含量為生物指標(biāo)，對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)基（碳源、氮源、無機(jī)鹽）和環(huán)境條件（pH、溫度）的優(yōu)化，最后確定了蔗糖50 g/L，酵母粉5 g/L的最優(yōu)培養(yǎng)基和溫度=25℃，pH=6的最優(yōu)培養(yǎng)條件；用優(yōu)化后的條件通過5 L式發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)銅色牛肝菌，5天后胞外多糖產(chǎn)量達(dá)1.84 g/L。胞外多糖經(jīng)除蛋白后，通過ABTS、DPPH、臨二氮菲法測(cè)其抗氧化性，結(jié)果表明其胞外多糖具有很好的抗氧化能力。

銅色牛肝菌；胞外多糖；液體發(fā)酵；優(yōu)化；抗氧化

銅色牛肝菌（Boletusaereus Fr.ex Bull）傘菌目、牛肝菌科、牛肝菌屬，夏秋季生于櫟等林中地上，可以食用，味道好，是一種食藥用真菌，屬于外生菌根菌。但是不能人工栽培，可用菌絲體進(jìn)行深層發(fā)酵培養(yǎng)[1]。

食藥用真菌具有有抗氧化、抗腫瘤、降血壓、降血糖、抗病毒等功效，而這些功效的發(fā)揮與真菌多糖有著密切的關(guān)系[2]。真菌多糖是由10個(gè)以上的單糖通過糖苷鍵連接而成的高分子多聚物，具有復(fù)雜的生物活性和功能[3]，可提高免疫力調(diào)節(jié)身體的各項(xiàng)機(jī)能[4]。真菌多糖分為胞內(nèi)多糖和胞外多糖，胞外多糖主要從發(fā)酵液中提取，因?yàn)橐后w發(fā)酵可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)多糖，生產(chǎn)周期短，操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)在工業(yè)化生產(chǎn)多糖大多采用液體發(fā)酵法[5-7]，尤其是銅色牛肝菌，只能通過液體深層發(fā)酵獲得大量多糖。

本文主要是對(duì)銅色牛肝菌深層發(fā)酵培養(yǎng)基和環(huán)境條件進(jìn)行優(yōu)化，為工業(yè)化生產(chǎn)銅色牛肝菌多糖提供理論依據(jù)，并且通過臨二氮菲法、DPPH法、ABTS法測(cè)定銅色牛肝菌胞外多糖的抗氧化性，探索其對(duì)各種自由基的清除能力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

銅色牛肝菌菌種來自于河南省生物菌種保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯25%，葡萄糖1%，瓊脂1.5%～2.0%），液體種子培養(yǎng)基（葡萄糖3%，蛋白胨0.3%）。

1.1.3 試劑

乙醇、濃硫酸、DPPH、鄰二氮菲、1.5%過氧化氫、FeSO4均為分析純；ABTS試劑盒：碧云天生物技術(shù)研究所。

1.1.4 儀器

JYT-5QYC200恒溫振蕩搖床：上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；5L攪拌式真菌發(fā)酵罐：上海百倫科技有限公司；METTLER 4E200電子分析天平：上海沛歐分析儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；CF16RXⅡ日立離心機(jī)：日本HITACHI；UV-17001C紫外分光光度計(jì)：上海鳳凰光學(xué)科儀有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化

將保存于試管斜面培養(yǎng)基中的銅色牛肝菌菌絲塊接種于PDA平板培養(yǎng)基上，26℃下培養(yǎng)7 d[8]。

1.2.2 液體種子培養(yǎng)

用打孔器打取活化好的PDA銅色牛肝菌絲塊（約1 cm2）兩塊接入含50mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，置于于26℃160 r/min恒溫振蕩搖床中培養(yǎng)4d。然后加入滅過菌的玻璃珠置于磁力攪拌器上將菌絲塊打碎后備用。

1.2.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品1 g，溶解稀釋后定容到100mL容量瓶中，配成10mg/mL的葡萄糖貯備液，精密吸取貯備液1mL定容至100mL，配成0.1mg/m L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。精密移取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μL，于25mL具塞刻度試管中，加蒸餾水至1.0mL，再各加5%苯酚溶液1mL搖勻，迅速加入濃硫酸溶液5m L，放在振蕩器上震蕩均勻，置沸水浴中加熱15 min，取出再置于冰水中15 min，用紫外分光光度計(jì)于490 nm，以蒸餾水代替葡萄糖溶液作為對(duì)照測(cè)定吸光值。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

探究不同碳源、氮源、無機(jī)鹽、pH、溫度對(duì)銅色牛肝菌胞外多糖含量的影響，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為3%葡萄糖，0.3%蛋白胨，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行試驗(yàn)，培養(yǎng)時(shí)間為8 d，搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min，接種量為4%，pH=5。碳源選用的是3%的葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖、木糖、乳糖；氮源選用的是0.3%的牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、大豆粉、磷酸銨、硝酸鉀；無機(jī)鹽選用的是FeSO4、MnCl2、MgSO4、CaCl2、K2HPO4和空白對(duì)照（3%葡萄糖，0.3%蛋白胨）；pH=3、4、5、6、7、8、9；溫度=20、25、28、30℃。

1.2.5 碳源濃度和C/N比實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，探究碳源濃度和碳氮比對(duì)銅色牛肝菌胞外多糖含量的影響。碳源濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%；碳氮比分別為1∶1、10∶1、20∶1、30∶1。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行試驗(yàn)，培養(yǎng)時(shí)間為8 d，搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min。

1.2.6 菌絲干重的稱量和胞外多糖含量的測(cè)定

用抽濾法[9]將菌絲和發(fā)酵液分離，將濾紙和菌絲置于70℃的烘箱至干燥后稱量，再除去濾紙干重即為菌絲干重。

菌體含量（g/L）=菌絲干重（g）/發(fā)酵液體積（m L）× 1 000

把發(fā)酵液濃縮后加入4倍乙醇，置于4℃冰箱過夜處理，第2天把處理液放在轉(zhuǎn)速為10 000 r/min離心機(jī)中離心10min后棄去上清，用蒸餾水溶解沉淀定容至250mL，然后用苯酚硫酸法[10]測(cè)發(fā)酵液中的多糖含量。

1.2.7 銅色牛肝菌在發(fā)酵罐中的培養(yǎng)

根據(jù)單因素優(yōu)化和交互作用實(shí)驗(yàn)確定的培養(yǎng)基配方配制3 L于5 L發(fā)酵罐中，接種量4%，通氣量2 vvm，攪拌速度160 r/min，培養(yǎng)8 d，然后將發(fā)酵液濃縮后醇沉[11]出胞外多糖冷凍干燥以備后用。

1.2.8 胞外多糖的抗氧化作用

ABTS法測(cè)定銅色牛肝菌胞外多糖的總抗氧化力。ABTS在一定的氧化劑作用下可以氧化成綠色的ABTS，當(dāng)有抗氧化物存在時(shí)ABTS的氧化就會(huì)被抑制，在734 nm或405 nm測(cè)定ABTS的吸光度即可測(cè)定并計(jì)算出樣品的總抗氧化能力[12]。Trolox是一種維生素E的類似物，具有和維生素E相近的抗氧化能力，可以作為其它抗氧化物總抗氧化能力的參照物。

DPPH法測(cè)定胞外多糖對(duì)DPPH的清除率。DPPH在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，有自由基清除劑存在時(shí)，DPPH的單電子被捕捉而使其顏色變淺，在最大光吸收波長(zhǎng)處的吸光值下降，且下降程度呈線性關(guān)系，吸光度水平的降低表明抗氧化性的增加，從而可以計(jì)算出樣品的抗氧化能力[13]。

臨二氮菲法測(cè)定胞外多糖對(duì)·OH的清除率[14]，以前是利用鄰二氮菲可與Fe2+生成橙紅色有色物用來檢測(cè)樣品中Fe2+的方法。由于H2O2在Fe2+的催化作用下生成具有高反應(yīng)活性的羥基自由基（Fenton反應(yīng)）能夠氧化反應(yīng)體系中的Fe2+，因此出現(xiàn)了用來檢測(cè)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基的鄰二氮菲法。

2 結(jié)果分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Glucose standard curve graph

2.2 碳源、氮源、無機(jī)鹽對(duì)多糖含量的影響

碳源、氮源、無機(jī)鹽對(duì)多糖含量的影響見表1。

表1 不同碳源、氮源、無機(jī)鹽對(duì)銅色牛肝菌菌絲含量和胞外多糖含量的影響*Table1 Effect of carbon，nitrogen and mineral source on mycelial growth and EPS production by B.aereus in shake flask cultures*

由表1分析可知，蔗糖＞麥芽糖＞葡萄糖＞果糖=乳糖＞木糖，麥芽糖和蔗糖作為碳源都能獲得較高的多糖含量，但是在工業(yè)化生產(chǎn)中，蔗糖的成本更低，而且能產(chǎn)得更多的菌絲，所以選擇蔗糖作為最優(yōu)碳源，葡萄糖、果糖、乳糖、木糖作為碳源，胞外多糖含量比較接近。

在氮源的優(yōu)化過程中，可以觀察到，銅色牛肝菌在有機(jī)氮源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)很好，在無機(jī)氮源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)很慢并且菌絲很少，說明銅色牛肝菌不能很好的利用無機(jī)氮源。而在有機(jī)氮源中富含各種氨基酸，這些氨基酸可以直接被菌絲吸收加以利用，因此利用這種氮源時(shí)，菌絲生長(zhǎng)較快，胞外多糖產(chǎn)量相對(duì)較高[15]。無論是選擇發(fā)酵液中的胞外多糖含量還是菌絲含量作為生物指標(biāo)，都應(yīng)該選酵母粉作為最適氮源。

無機(jī)鹽的加入并沒有提高銅色牛肝菌胞外多糖的產(chǎn)量，所以在實(shí)驗(yàn)中不再添加無機(jī)鹽。

2.3 環(huán)境條件對(duì)胞外多糖含量的影響

2.3.1 初始pH對(duì)胞外多糖含量的影響

以液體種子培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其他條件保持不變，培養(yǎng)基pH分別為3、4、5、6、7、8、9，確定最適pH。結(jié)果如圖2（A）所示，銅色牛肝菌在pH=3-9都能生長(zhǎng)，最適pH為6。

2.3.2 培養(yǎng)溫度對(duì)胞外多糖含量的影響

以液體種子培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，初始pH=5，其它條件不變，溫度分別為20、25、28、30℃，結(jié)果如圖2（B）所示，溫度為25℃時(shí)菌絲含量和多糖含量都是最高，而其它3個(gè)溫度差異不明顯。

圖2 不同pH和溫度條件對(duì)銅色牛肝菌菌絲含量和胞外多糖含量的影響Fig.2 Effect of pH and temperature on mycelial growth and EPS production by B.aereus in shake flask cultures

2.4 不同碳源濃度和碳氮比對(duì)胞外多糖含量的影響

改變碳源濃度，其它條件不變，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖3和圖4。

圖3 不同碳源濃度對(duì)銅色牛肝菌菌絲含量和胞外多糖含量的影響Fig.3 Effect of Carbon concentration on the mycelial growth and EPS production by B.aereus

圖4 不同的碳氮比對(duì)銅色牛肝菌菌絲含量和胞外多糖的影響Fig.4 Effect of C/N ratio on the mycelial growth and EPS production by B.aereus

由圖3分析可知，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的蔗糖試驗(yàn)組的菌絲含量和胞外多糖含量最高，而質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、2%、3%、4%的蔗糖試驗(yàn)組碳源不足，菌絲體干重和胞內(nèi)外多糖含量較低；質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%的碳源存在時(shí)，則抑制菌絲的生長(zhǎng)和胞外多糖的合成。所以，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%為最適碳源濃度。

圖4為不同的碳氮比對(duì)銅色牛肝菌菌絲含量和胞外多糖的影響，蔗糖與酵母粉比例達(dá)到10：1時(shí)，菌絲含量和胞外多糖含量都達(dá)到最高水平。正如Yuan et al的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，赤芝的碳氮比也是10∶1[16]。綜上所述，最適碳源及濃度為蔗糖：50 g/L，最適氮源及濃度為5 g/L。

2.5 銅色牛肝菌發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)

發(fā)酵時(shí)間與pH、菌絲干重、殘?zhí)呛虴PS產(chǎn)量等指標(biāo)的相關(guān)變化情況見圖5。

圖5 利用5L發(fā)酵罐發(fā)酵過程中菌絲干重、胞外多糖、pH和殘?zhí)请S時(shí)間的變化圖Fig.5 Time course of the mycelial growth，EPS production，pHand residual glucose in 5-L stir red-tank bioreactor.

由圖5分析可知，發(fā)酵液EPS含量從接種首日開始就逐漸升高，在第5天達(dá)到最大值（1.84 g/L），此后含量趨向平穩(wěn)。而菌絲干重隨時(shí)間的增加而快速升高，在第3天達(dá)到最大值，隨后降低。殘?zhí)呛吭诎l(fā)酵過程中不斷減少，但pH變化不是很明顯。

2.6 銅色牛肝菌胞外多糖抗氧化性研究

如圖6（A）所示，總抗氧化力隨著多糖濃度的增加而增大，呈現(xiàn)一定的相關(guān)性，最后當(dāng)胞外多糖濃度到10 g/L時(shí)，其總抗氧化力與0.171mM Trolox相等，同樣，銅色牛肝菌胞外多糖清除DPPH和·OH自由基的能力都隨著多糖濃度的增大而增強(qiáng)，如圖6（B），多糖濃度由6 g/L到8 g/L的斜率明顯大于2 g/L到6 g/L的斜率，當(dāng)多糖濃度為10 g/L時(shí)，，清除DPPH自由基高達(dá)62.23%。并且清除·OH自由基能力也隨著多糖濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，如圖6（C）所示，最高清除率達(dá)到61.37%。結(jié)果表明銅色牛肝菌胞外多糖具有很好的抗氧化能力，這種能力是因?yàn)槠浞肿又杏写罅康聂然?COOH）、羰基（C=O）、醚基（-O-）以及其它基團(tuán)。這些基團(tuán)與自由基發(fā)生反應(yīng)時(shí)可以提供電子使自由基以一種更穩(wěn)定的形式存在，或者使自由基引起的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)停止[12]。

圖6 銅色牛肝菌胞外多糖抗氧化效果圖Fig.6 Antioxidant activity of B.aereus polysaccharides.

3 結(jié)語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)以胞外多糖含量為指標(biāo)，對(duì)銅色牛肝菌的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，最適培養(yǎng)基為：蔗糖50 g/L，酵母粉5 g/L，pH=6，溫度25℃。將優(yōu)化結(jié)果應(yīng)用于5 L式發(fā)酵罐，培養(yǎng)8 d后處理發(fā)酵液得到胞外多糖，然后通過ABTS、DPPH、臨二氮菲法測(cè)其抗氧化性，結(jié)果表明銅色牛肝菌胞外多糖具有很好的抗氧化能力。

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Optimization of Active Exopolysaccharides Production by Submerged Culture of Boletus Aereus

XU Chun-ping1，LIU Yuan-shang1，LI Meng-shan1，ZHAO Shan-shan1，SHI Chao-wen2
（1.College of Food and Biological Engineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450002，Henan，China；2.College of Life Science，Henan Agricultural University Zhengzhou 450002，Henan，China）

In this paper，optimization of liquid culture medium components （carbon and nitrogen sources，mineral salt）and fermentation condition （pH and temperature）to produce exopolysaccharides （EPS）was carried out.The optimum medium was sucrose 50 g/L，yeast extract5 g/L，temperature 25℃，with initial pH at 6.Under the optimized culture conditions in a 5-Lstirred-tank reactor，the EPS was obtained upto 1.84 g/Lat5 d. After after removing protein，the antioxidant activity of EPS was measured by ABTS，DPPH，phenanthroline method.The results showed that the EPS has good antioxidant capacity.

Boletus aereus；exopolysaccharides；liquid fermentation；optimization；antioxidant

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.03.033

2013-07-15

國(guó)家教育部國(guó)際合作與交流司“留學(xué)人員回國(guó)科研啟動(dòng)基金”教外司留[2012]940

許春平（1977—），男（漢），教授，博士，研究方向：生物化工和煙草工程。