吳 桐1劉吉成1邱永強(qiáng)2李美謙1何 寧1李鴻梅1李喜春

全基因組相關(guān)研究SNP多態(tài)性陽(yáng)性位點(diǎn)與黑龍江省女性乳腺癌發(fā)病相關(guān)性研究

吳 桐1劉吉成1邱永強(qiáng)2李美謙1何 寧1李鴻梅1李喜春3

目的檢測(cè)前期GWAS研究中差異最顯著的三個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性與黑龍江地區(qū)漢族女性乳腺癌發(fā)病相關(guān)性。方法收集150例乳腺癌患者和300例年齡匹配且無(wú)乳腺癌家族史的健康體檢者一般臨床資料和5 ml外周靜脈血，提取基因組DNA，PCR/sequencing方法基因分型，統(tǒng)計(jì)并比較兩組研究對(duì)象各等位基因頻率及基因型頻率。結(jié)果各位點(diǎn)乳腺癌組和對(duì)照組的基因型分布均符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律（P＞0．05）；rs3006663，rs737495等位基因頻率分布及基因型檢測(cè)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）；rs6551328基因型分布在病例對(duì)照組中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），相對(duì)于CC基因型，CT雜合基因型的風(fēng)險(xiǎn)值OR＝1．776，95%CI為1．155～2．728，提示該位點(diǎn)CT基因型是乳腺癌發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)因素。結(jié)論rs6551328多態(tài)性與在黑龍江漢族女性乳腺癌發(fā)病相關(guān)。

乳腺癌，單核苷酸多態(tài)性SNP，易感位點(diǎn)，群體分布

乳腺癌是女性中排名首位的致病致死惡性腫瘤，近年來(lái)，乳腺癌發(fā)病呈年輕化趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅婦女的健康和生命。乳腺癌是由環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的復(fù)雜疾病。流行病學(xué)調(diào)查表明，乳腺癌的發(fā)病呈明顯的家庭聚集現(xiàn)象，并在群體中表現(xiàn)出易感個(gè)體差異性和種族差異性，提示遺傳因素在乳腺癌的發(fā)病過(guò)程中起到重要作用［1］。然而，乳腺癌發(fā)病遺傳病因至今尚未明確，為乳腺癌的預(yù)防、早期診斷及治療帶來(lái)困難。近年來(lái)全基因組相關(guān)研究（GWAS）確定了大量的乳腺癌低共顯性遺傳易感位點(diǎn)，表明乳腺癌的遺傳易感性主要可能與常見(jiàn)的低共顯性易感基因和單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（SNP）變異有關(guān)。這些易感基因和易感位點(diǎn)有望作為腫瘤標(biāo)志物改善乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)及早期診斷，為確定高危人群、尋找預(yù)警標(biāo)志物及個(gè)體化醫(yī)療提供理論依據(jù)。本文采用病例對(duì)照研究策略，選取黑龍江地區(qū)150乳腺癌病例和300例體檢健康病例作為對(duì)照，通過(guò)檢測(cè)前期GWAS研究中差異最顯著三個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，探討這些位點(diǎn)多態(tài)性與黑龍江地區(qū)乳腺癌易感性的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

本研究經(jīng)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均自愿入組，簽署知情同意書(shū)。乳腺癌病例選自黑龍江地區(qū)2013年1月～2015年1月臨床收治漢族女性患者共計(jì)150例，（46.18±4.86）歲，為經(jīng)病理組織學(xué)確診患者；300例對(duì)照選自臨床體檢健康漢族女性，（44.92±5.21）歲。排除既往有放化療史，其他腫瘤病史，自身免疫系統(tǒng)疾病史，精神病史，內(nèi)分泌疾病史，職業(yè)暴露史，以及家族一級(jí)親屬患有乳腺癌、卵巢癌者，排除在黑龍江地區(qū)居住不滿(mǎn)15年者。收集每名參加者外周靜脈血5 ml，EDTA抗凝保存，以備分析。

1.2 位點(diǎn)篩選

研究位點(diǎn)為rs3006663，rs737495，rs6551328，三個(gè)位點(diǎn)，篩選自本研究室前期以乳腺癌為研究對(duì)象，應(yīng)用Affimetrix SNP 6.0基因分型芯片（Affymetrix.Inc， 美國(guó)）完成的基于混合DNA全基因組相關(guān)研究結(jié)果，為病例—對(duì)照差異最顯著三個(gè)位點(diǎn)，其P值依次分別為3.374×10-8，8.981×10-8，9.212×10-8。

1.3 基因分型

1.3.1 材料和試劑 全血基因組DNA提取采用血液基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，DP348-03），引物由北京博邁德基因技術(shù)有限公司合成，2×EasyTaq PCR Super Mix 購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司（AS111-12），DNA 測(cè)序由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

1.3.2 基因分型 本研究采用PCR/Sequencing方法鑒定基因型，全血基因組DNA提取采用血液基因組DNA提取試劑盒提取，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度和純度，并將DNA工作液稀釋至（50±2）ng/μl。利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物，引物序列詳見(jiàn)表1；PCR擴(kuò)增體系為：2×EasyTaq PCR Super Mix 12.5 μl，2pM上下游引物各1 μl，DNA模板1 μl，超純水9.5 μl；擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)后，72℃最終延伸10 min。PCR產(chǎn)物測(cè)序。

表1 各位點(diǎn)引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果用DNAstar軟件判讀，Hardy-Weinberg平衡用Haploview軟件計(jì)算，統(tǒng)計(jì)分析用SPSS 18.0軟件分析， 基因頻率和基因型頻率分布用χ2檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

2.1 各位點(diǎn)Hardy-Weinberg平衡分析

經(jīng)檢驗(yàn)，各位點(diǎn)乳腺癌組和對(duì)照組的基因型分布均符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律（P＞0.05），說(shuō)明研究對(duì)象在遺傳學(xué)方面可以代表本地人群。

2.2 各位點(diǎn)基因型頻率及基因頻率分析

三個(gè)位點(diǎn)基因型頻率分布見(jiàn)表2所示，位點(diǎn)rs6551328各基因型在病例、對(duì)照兩組分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，三個(gè)位點(diǎn)基因頻率分布未顯示顯著差異。

3 討論

乳腺癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在全球呈上升趨勢(shì)，目前，全球每年約有120萬(wàn)新發(fā)乳腺癌病例，約有50萬(wàn)婦女死于乳腺癌，乳腺癌嚴(yán)重威脅著婦女的健康和生命。中國(guó)是乳腺癌發(fā)病率增長(zhǎng)最快的國(guó)家之一，且呈年輕化趨勢(shì)。因此有必要在婦女人群中開(kāi)展針對(duì)風(fēng)險(xiǎn)因素的評(píng)估，準(zhǔn)確找到高危人群范圍以便更好的進(jìn)行針對(duì)性的預(yù)防指導(dǎo)。

乳腺癌的發(fā)生發(fā)展的致病機(jī)理目前尚不明了。在復(fù)雜疾病風(fēng)險(xiǎn)因素的研究中，全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）成為一個(gè)非常行之有效的方法。GWAS通過(guò)對(duì)大量的病例對(duì)照及成千上萬(wàn)個(gè)SNP位點(diǎn)分析，評(píng)估在不同的染色體上的SNP位點(diǎn)與疾病的關(guān)系， 從而找出新的乳腺癌易感位點(diǎn)。在GWAS研究技術(shù)問(wèn)世之前，研究人員已通過(guò)家系相關(guān)研究和候選基因途徑等，篩選出某些與乳腺癌易感相關(guān)基因，但盡管這些基因與乳腺癌高風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，但這些突變?cè)谌巳褐蟹浅Ｉ伲仓荒芙忉寴O小部分基于家系的乳腺癌患者的遺傳病因?qū)W。GWAS技術(shù)的問(wèn)世讓我們找到了許多未曾發(fā)現(xiàn)的基因以及染色體區(qū)域，為復(fù)雜疾病的發(fā)病機(jī)制提供了更多的線索，通過(guò)GWAS研究篩選乳腺癌易感性單核苷酸多態(tài)性（SNP）成為乳腺癌遺傳病因?qū)W的一個(gè)熱點(diǎn)［2］。目前，國(guó)外對(duì)于乳腺癌易感位點(diǎn)的研究與驗(yàn)證多以歐美人群為研究對(duì)象，大量的乳腺癌低共顯性遺傳易感性位點(diǎn)，表明乳腺癌的遺傳易感性主要可能與常見(jiàn)的低共顯性基因的變異有關(guān)［3］。然而，目前尚不清楚低外顯率等位基因的確切數(shù)目及其影響乳腺癌易感性的機(jī)制。

表2 各位點(diǎn)基因型頻率及基因比較

而我國(guó)針對(duì)與乳腺癌相關(guān)的各種危險(xiǎn)因素（流行病學(xué)危險(xiǎn)因素、乳腺病理危險(xiǎn)因素和相關(guān)生物標(biāo)志物檢測(cè)）已經(jīng)進(jìn)行了較多的研究，但對(duì)于乳腺癌的易感位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)及基于易感位點(diǎn)建立風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型研究尚處于起步階段。僅Zhangwei等人通過(guò)對(duì)7 531例乳腺癌患者和3 998例健康對(duì)照者進(jìn)行全基因掃描分析發(fā)現(xiàn)了1個(gè)中國(guó)人群的乳腺癌易感位點(diǎn) rs2046210［4］，和Lianjie等通過(guò)對(duì)1 049例中國(guó)人群乳腺癌患者和1 073例健康對(duì)照者的乳腺癌易感基因FGFR2的多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)了2個(gè)乳腺癌易感位點(diǎn)rs1219648和rs2420946［5］。相對(duì)于國(guó)外此類(lèi)研究，我國(guó)乳腺癌SNP易感位點(diǎn)研究較少。我們?cè)谇捌诒本h族女性人群的GWAS研究中已獲得了若干個(gè)P＜5.0×10-8的乳腺癌易感相關(guān)SNP位點(diǎn)，本研究為在黑龍江省女性人群中驗(yàn)證rs3006663，rs737495，rs6551328三個(gè)差異最顯著位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)rs6551328基因型分布在病例對(duì)照組中差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），相對(duì)于CC基因型，CT雜合基因型的風(fēng)險(xiǎn)值OR＝1.776， 95%CI為1.155～2.728，提示該位點(diǎn)CT基因型可能是黑龍江地區(qū)漢族女性乳腺癌發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)因素。

研究現(xiàn)狀表明，欲闡明乳腺癌發(fā)生發(fā)展的致病機(jī)理仍任重道遠(yuǎn)，未來(lái)欲了解乳腺癌的致病機(jī)理還將更多的依賴(lài)對(duì)乳腺癌低風(fēng)險(xiǎn)易感基因多態(tài)性及其相互作用的研究。

［1］Nasim Mavaddat，Antonis C．Antoniou，Douglas F．Easton，et al．Genetic susceptibility to breast cancer［J］． Molecular Oncology，2010，4（3）：174-191．

［2］吳桐，劉吉成． 乳腺癌易感基因研究現(xiàn)狀［J］． 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，31（7）：579-582．

［3］Turnbull C，Ahmed S，Morrison J，et al． Genome-wide association study identifies five new breast cancer susceptibility loci［J］． Nat Genet， 2010，42（6）：504-507．

［4］Zhang W，Long JR，Gao YT，et al． Genome-wide association study identifies a new breast cancer susceptibility locus at 6q25．1［J］．Nat Genet，2009，41（3）：324-328．

［5］Liang J，Chen P，Hu Z，et al． Genetic variants in fibroblast growth factor receptor2 （FGFR2） contribute to susceptibility of breast cancer in Chinese women［J］． Carcinogenesis，2008，29（12）：2341-2346．

Association Study Between Positive SNP Polymorphism Loci of GWAS and Breast Cancer in Female of Heilongjiang Province

WU Tong1LIU Jicheng1QIU Yongqiang2LI Meiqian1HE Ning1LI Hongmei1LI Xichun31 Research Institute of Medicine & Pharmacy，Qiqihar Medical University，Qiqihar 160006，China，2 Public Health School，Qiqihar Medical University，Qiqihar 160006，China，3 The Third Affiliated Hospital，Qiqihar Medical University，Qiqihar 160006，China

ObjectiveTo analyze the correlation of three most significant loci polymorphism from preliminary GWAS results and the attack of Breast Cancerin female of Han group in Heilongjiang province．Methods150 breast cancer patients and 300 cases of age matched healthy controls without breast cancer were recruited from clinic． General clinical data and 5 ml peripheral venous blood from each cases were collected． Genomic DNA was extracted by kit． PCR/sequencing was used for genotyping． Allele frequency and genotype frequency was analyzed for comparison in both groups．ResultsThe genotype frequency distribution of each loci in case and control groups conformed to the Hardy-Weinberg genetic balance law． Statistical difference was not detected in allele frequency and genotype frequency of rs3006663 and rs737495（P＞0．05）． Genotype distribution of rs6551328 showed significant difference in both groups（P＜ 0．05）． Compared with CC genotype，the OR value of CT genotypes was 1．776， 95%CI was 1．155～ 2．728，suggested that CT genotypes might be the risk factor of breast cancer．Conclusionrs6551328 loci polymorphism associated with the attack of Breast Cancer in female of Han group in Heilongjiang province

Breast Cancer，Single nucleotide polymorphism， Susceptibility loci，Population distribution

R737．9

B

1674-9316（2015）27-0005-03

10．3969/j．issn．1674-9316．2015．27．004

1 160006 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥科學(xué)研究院；2 160006 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院；3 160006 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院

黑龍江省科技廳攻關(guān)項(xiàng)目（編號(hào)：GC12C304-3）；黑龍江省教育廳資助項(xiàng)目（編號(hào)：12531829）；齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院“重大預(yù)研基金”項(xiàng)目