田志輝，王　丹，曹彥坤，馬　力，朱　龍，劉月平*

(1.河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院CT室，河北 石家莊 050011；2.河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院病理科，河北 石家莊 050011；3.河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院放療科，河北 石家莊 050011；4.河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院乳腺中心，河北省乳腺疾病診治中心，河北 石家莊 050011；5.河北省安國市醫(yī)院CT/MRI室，河北 安國 071200)

DIAPH-3 蛋白在浸潤性乳腺癌組織中的表達及預(yù)后的研究

田志輝1，王丹2，曹彥坤3，馬力4，朱龍5，劉月平2*

(1.河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院CT室，河北 石家莊 050011；2.河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院病理科，河北 石家莊 050011；3.河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院放療科，河北 石家莊 050011；4.河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院乳腺中心，河北省乳腺疾病診治中心，河北 石家莊 050011；5.河北省安國市醫(yī)院CT/MRI室，河北 安國 071200)

[摘要]目的檢測DIAPH-3蛋白在浸潤性乳腺癌組織中的表達，并進一步探討其表達與浸潤性乳腺癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。方法采用RT-PCR及Western Blot法檢測27例浸潤性乳腺癌組織及癌旁組織中的DIAPH-3 mRNA及蛋白表達。免疫組織化學SP法檢測100例浸潤性乳腺癌患者中DIAPH-3的蛋白表達，分析患者的臨床病理資料，電話隨訪并計算患者的生存時間。分析DIAPH-3蛋白表達與預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果在浸潤性乳腺癌組織中DIAPH-3蛋白及mRNA的表達量低于乳腺癌旁組織(P<0.01)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個數(shù)多、脈管有瘤栓、神經(jīng)受侵患者DIAPH-3的表達陽性率低(P<0.01)；Kaplan-Meier生存分析生存分析顯示，DIAPH-3低表達的患者5年生存率較低。Cox比例風險模型多因素分析顯示，DIAPH-3蛋白表達率低是浸潤性乳腺癌患者生存時間的影響因素(P<0.05)。結(jié)論DIAPH-3與浸潤性乳腺癌的預(yù)后有關(guān)，可作為評價浸潤性乳腺癌預(yù)后的生物學指標。

[關(guān)鍵詞]乳腺腫瘤；基因；DIAPH-3；預(yù)后

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.07.013

浸潤性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展是多方面促成、多階段的連續(xù)過程。研究表明，在腫瘤發(fā)展轉(zhuǎn)移過程中，DIAPH-3 蛋白起著極其重要的作用，且與靶向藥物抗藥性密切相關(guān)。本研究檢測DIAPH-3在浸潤性乳腺癌組織中的表達，探討其與浸潤性乳腺癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1資料與方法

1.1標本來源收集2013 年10—12月河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院手術(shù)切除原發(fā)性浸潤性乳腺癌組織及癌旁組織樣本27 例，患者均為女性，年齡28～71 歲，中位年齡55歲。另收集同醫(yī)院2008年手術(shù)切除原發(fā)性浸潤性乳腺癌標本100例，隨訪資料完整，患者均為女性，年齡20～88歲，中位年齡51歲。所有患者術(shù)前均未接受過放化療和內(nèi)分泌治療，生存時間為34～59個月，中位生存時間54個月，結(jié)果均經(jīng)病理診斷證實。同時收集同期手術(shù)切除乳腺纖維腺瘤標本22例作為對照組，患者均為女性，年齡22～78歲，中位年齡48歲。3組年齡差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2主要試劑兔抗人DIAPH-3多克隆抗體購自Proteintech生物技術(shù)有限公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自德國Thermo公司。DIAPH-3引物、RNA提取試劑購自上海生工生物科技有限公司。PCR擴增試劑盒購自美國Promega公司。

1.3方法

1.3.1RT-PCR法檢測Trizol一步法提取總RNA。1.5%瓊脂糖凝膠電泳試驗檢測總RNA完整性。逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行PCR 擴增。DIAPH-3反應(yīng)體系：取1 μL cDNA產(chǎn)物按照PCR擴增試劑盒要求擴增。DIAPH-3引物序列，Sense Primer：5′-AGACCTCCACTTCCCAACCT-3′，Anti Sense Primer：5′-CTCACAGGATTGCTGGTCAA-3′，產(chǎn)物長度368 bp。GADPH引物序列，Sense Primer：5′-CTCAGACACCATGGGGAAGCTGA-3′,Anti Sense Primer：5′-ATGAGCTTGAGGCTGTTGT-CATA-3′，產(chǎn)物長度450 bp。反應(yīng)條件為DIAPH-3：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s；52 ℃ 45 s；72 ℃ 50 s，循環(huán)35次；72 ℃延伸5 min,4 ℃冷卻。PCR 產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳試驗。經(jīng)Alphaease 凝膠成像系統(tǒng)掃描攝像測量灰度值。

1.3.2Western Blot法檢測新鮮浸潤性乳腺癌組織加入裂解液后冰上研磨，提取組織總蛋白，并應(yīng)用考馬斯亮藍蛋白定量后，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(本實驗用12%分離膠)。轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(poly vinglidene fluoride,PVDF)膜上，洗膜后進行二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzine,DAB)顯色。觀察并分析顯得結(jié)果。

1.3.3免疫組織化學法檢測免疫組織化學染色采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接(streptavidin-perosidase,SP)法。每次免疫組織化學染色均設(shè)同步陽性和陰性對照(DIAPH-3陽性對照為宮頸鱗狀細胞癌組織，陰性對照均用PBS代替一抗)。

1.4判定標準

1.4.1RT-PCR以人磷酸苷油酸脫氫酶(phosphogly cerate dehydro-genase，GADPH)為內(nèi)參，測定目的基因灰度值，計算相對表達量。相對表達量=目的基因灰度值/GADPH灰度值。

1.4.2Western Blot以GADPH為內(nèi)參，測定目的蛋白灰度值，計算相對表達量。相對表達量=目的蛋白灰度值/GADPH灰度值。

1.4.3免疫組織化學SP法于光鏡下觀察，DIAPH-3 免疫陽性反應(yīng)產(chǎn)物均沿乳腺導(dǎo)管上皮細胞膜內(nèi)側(cè)線性分布，呈棕黃色或棕褐色顆粒狀，于胞漿內(nèi)也可見著色。于40倍物鏡鏡下隨機選取至少10個視野范圍或每個視野范圍至少200個細胞。染色強度標準：無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色顆粒為2分，棕褐色顆粒為3分。陽性細胞百分比標準:陰性為0分，陽性細胞<10%為1分，10%～25%為2分，>25%～50%為3分，>50%為4分。染色強度與陽性細胞百分比的乘積>3分為免疫反應(yīng)陽性。

2結(jié)果

2.1不同臨床病理特征 DIAPH-3蛋白的表達免疫組織化學結(jié)果顯示DIAPH-3蛋白表達率隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個數(shù)的增加而減少(P<0.01)；DIAPH-3蛋白在有脈管瘤栓患者的表達低于無脈管瘤栓患者(23.5%vs49.0%)(P<0.01)；DIAPH-3蛋白在有神經(jīng)受侵患者的表達低于無神經(jīng)受侵患者(19.4%vs45.3%)(P<0.01)；DIAPH-3 蛋白表達在不同年齡、不同組織學分級、不同腫瘤最大直徑、不同臨床分期之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1　浸潤性乳腺癌患者不同病理

*P<0.05與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較(χ2檢驗)

2.227例浸潤性乳腺癌組織及癌旁組織中DIAPH-3 mRNA的表達RT-PCR 法和Western Blot 法均顯示，乳腺癌組織中的DIAPH-3表達均低于乳腺癌旁組織(P<0.01),見表2、圖1～2。

表2RT-PCR 和 Western Blot法檢測浸潤性乳腺癌組織和

癌旁組織中DIAPH-3的表達

Table 2Expression of DIAPH-3 protein in invasive breast

cancer and cancer adjacent tissues by RT-PCR and

Western Blot

組別RT-PCRWesternBlot乳腺癌組織 0.596±0.0940.233±0.086乳腺癌旁組織1.034±0.0960.941±0.249t 16.93913.965P 0.0000.000

圖1浸潤性乳腺癌癌及癌旁組織中DIAPH-3的RT-PCR表達

T.癌組織;NT.癌旁組織

Figure 1Expression of DIAPH-3 in invasive breast cancer and adjacent tissues by RT-PCR

圖2浸潤性乳腺癌癌及癌旁組織中DIAPH-3的Western Blot表達

T.癌組織;NT.癌旁組織

Figure 2Expression of DIAPH-3 in invasive breast cancer and adjacent tissues by Western Blot

2.3浸潤性乳腺癌組織及乳腺纖維腺瘤中DIAPH-3 蛋白的表達免疫組織化學結(jié)果顯示DIAPH-3蛋白在浸潤性乳腺癌組織中的表達陽性率低于乳腺纖維腺瘤組織中的表達陽性率，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表3　免疫組織化學法檢測DIAPH-3在浸潤性

2.4DIAPH-3與浸潤性乳腺癌預(yù)后Kaplan-Meier單因素生存分析顯示，DIAPH-3 蛋白表達水平降低與患者5年生存率降低有關(guān)，36例DIAPH-3表達陽性的患者較64例DIAPH-3表達陰性的患者5年生存率高(P<0.05)，見表4。

2.5Cox多因素生存分析DIAPH-3蛋白表達減少與預(yù)后有關(guān)(P<0.05)，可以作為判斷浸潤性乳腺癌患者預(yù)后的影響因素，見表5，6。

表4　不同DIAPH-3表達浸潤性乳腺癌5年生存率比較

表5　Cox多因素分析的賦值

表6　影響浸潤性乳腺癌預(yù)后的Cox回歸分析

3討論

DIAPH-3 蛋白屬于Formin 蛋白家族，具有促進肌動蛋白的聚集成核、延伸、加帽及微絲的繼續(xù)伸長等作用，進而調(diào)控細胞黏附、運動、細胞形態(tài)學分化、細胞內(nèi)運輸、囊泡運輸?shù)冗^程[1-6]。有研究證實，DIAPH-3基因的沉默使不穩(wěn)定的微管蛋白生成，誘使細胞內(nèi)吞作用障礙，激活下游Ras/Raf/MEK/ERK 信號傳導(dǎo)通路[7]。同時，DIAPH-3可以與Rho激酶結(jié)合調(diào)節(jié)細胞的遷移、黏附、浸潤、分化等過程[8]。研究表明，DIAPH-3在細胞侵襲中扮演重要角色。DIAPH-3沉默在前列腺癌或其他類型細胞中導(dǎo)致了由干細胞向變形細胞的轉(zhuǎn)變，同時也引起了癌細胞的轉(zhuǎn)移、侵襲[9]。

DIAPH-3基因的沉默阻止細胞的樹突狀偽足樣運動、侵襲及基底膜的降解，通過改變膠原蛋白Ⅰ的構(gòu)型，DIAPH-3的沉默行為促進了細胞侵襲。在Hela細胞中觀察到DIAPH-3基因的沉默阻礙細胞出胞過程，且有利于細胞的爬行[10]。然而DIAPH-3在浸潤性乳腺癌組織中的表達還鮮有研究。

本研究RT-PCR及Western Blot結(jié)果顯示DIAPH-3在浸潤性乳腺癌組織中mRNA及蛋白表達均低于乳腺癌旁組織。100例不同臨床病理特征的浸潤性乳腺癌組織免疫組織化學結(jié)果顯示，DIAPH-3表達減弱或缺失與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管瘤栓出現(xiàn)、神經(jīng)受侵有關(guān)，提示DIAPH-3表達減弱或缺失可能誘導(dǎo)浸潤性乳腺癌侵襲及轉(zhuǎn)移；而DIAPH-3表達減弱與浸潤性乳腺癌臨床分期和組織學分級無關(guān)。根據(jù)此結(jié)果推測有2種可能：①經(jīng)Cox多因素生存分析，DIAPH-3為預(yù)后的影響因素，提示DIAPH-3蛋白可能為貫穿浸潤性乳腺癌整個發(fā)生發(fā)展過程的作用因子，其作用并不依賴于其他因素，獨立影響腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移；②在浸潤性乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中存在與DIAPH-3蛋白拮抗的因素。

本研究Kaplan-Meier單因素生存分析結(jié)果顯示DIAPH-3與浸潤性乳腺癌患者的預(yù)后有關(guān)；Cox多因素生存分析顯示DIAPH-3為浸潤性乳腺癌預(yù)后的影響因素，提示檢測患者組織內(nèi)的DIAPH-3表達，有助于臨床對于患者預(yù)后的評價和治療。然而在浸潤性乳腺癌發(fā)生發(fā)展中，DIAPH-3的缺失與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系及其機制有待進一步的觀察證實。

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[10]Stastna J,Pan X,Wang H,et al.Differing and isoform-specific roles for the forming DIAPH3 in plasma membrane blebbing and filopodia formation[J].Cell Res 2012,22(4):728-745.

(本文編輯：許卓文)

·論著·

·論著·

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第二醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學碩士，從事小兒肝膽疾病超聲診斷研究。

[中圖分類號]R737.9

[文獻標志碼]A

[文章編號]1007-3205(2015)07-0792-05

[收稿日期]2014-12-19；[修回日期]2015-03-09 2015-01-19；[修回日期]2015-02-02

[基金項目]河北省醫(yī)學科學研究重點課題計劃(20120016) 河北省醫(yī)學科學研究重點課題計劃(ZL20140026)

[作者簡介]李國慧(1976-)，女，河北井陘人，河北省兒童醫(yī)院主管檢驗師，醫(yī)學碩士，從事臨床檢驗學研究。 劇紅娟(1982-)，女，河北石家莊人，河北醫(yī)科大學

*通訊作者。E-mail：zhangtongdiyouxian@163.com

Expression of DIAPH-3 protein and prognosis in invasive breast cancer

TIAN Zhi-hui1,WANG Dan2,CAO Yan-kun3,MA Li4，ZHU Long5,LIU Yue-ping2*

(1.Department of CT,the Fourth Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050011,China;

2.Department of Pathology,the Fourth Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050011,

China;3.Department of Radiation Oncology,the Fourth Hospital of Hebei Medical University,

Shijiazhuang 050011,China;4.Breast Center,the Fourth Hospital of Hebei Medical

University,Hebei Breast Center,Shijiazhuang 050011,China;5.Department of

CT/MRI,the Hospital of Anguo City,Hebei Province,Anguo 071200,China)

[Abstract]ObjectiveTo explore the expression of DIAPH-3 in invasive breast cancer,then to explore the relationship between protein expression and clinicopathological features of invasive breast cancer as well as prognosis.MethodsmRNA and protein expression of DIAPH-3 in 27 cases of invasive breast cancer and cancer adjacent tissues were examined by RT-PCR and Western Blot.Immunohistochemical SP method was used to examine the expression of DIAPH-3 protein in 100 cases of invasive breast cancer.The clinical data were analyzed and the overall survival of the patients was followed up by telephone.ResultsThe mRNA and protein expression of DIAPH-3 in invasive breast cancer were significantly lower than those of cancer adjacent tissues(P<0.01).The invasive breat cancer tissure showed the features:more number of lymph node metastasis,vascular vessel with tumor bolts,lower DIAPH-3 positive in invasive nerve.The decreased expression of DIAPH-3 associated with lower five-year survival rate of patients.Multivariate analysis showed that the expression of DIAPH-3 significantly related to survival(P<0.05).ConclusionThe expression of DIAPH-3 related to the prognosis of invasive breast cancer,and the item can be a biological indicator to evaluate the prognosis of invasive breast cancer.

[Key words]breast neoplasms;genes;DIAPH-3;prognosis